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크로마틴 면역침전 및 고처리량 시퀀싱(ChIP-seq)을 이용한 살모넬라 바이오필름의 CsgD 규제 목표 발견

Genetics
 

Summary

차세대 염기서열 분석(ChIP-seq)과 결합된 크로마틴 면역 침전은 전사 인자와 그들이 제어하는 게놈 서열 사이의 상호 작용을 확립하는 데 사용되는 방법입니다. 이 프로토콜은 세균성 생물막으로 ChIP-seq를 수행하기 위한 기술을 간략하게 설명하고, 살모넬라 테레카 혈청바르 티피무리움 세균 생물막을 예로 사용한다.

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Palmer, M. B., Wang, Y., White, A. P. Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing (ChIP-seq). J. Vis. Exp. (155), e60736, doi:10.3791/60736 (2020).

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Abstract

순화질 면역 침전은 시퀀싱(ChIP-seq)에 이어 전사 인자, 히스톤 변형 및 기타 DNA 관련 단백질의 조절 표적을 발견하는데 사용될 수 있는 기술이다. ChIP-seq 데이터는 또한 상이한 환경 조건 또는 세포 유형에서 전사 인자의 차동 결합을 찾는데 사용될 수 있다. 처음에, ChIP는 마이크로어레이(ChIP-chip)에 대한 혼성화를 통해 수행되었다; 그러나 ChIP-seq는 기술 발전, 시퀀싱에 대한 재정적 장벽 감소, 대량의 고품질 데이터 출력을 통해 선호되는 방법이 되었습니다. 지속적이고 만성적인 감염의 주요 원인인 세균성 생물막으로 ChIP-seq를 수행하는 기술이 이 프로토콜에 설명되어 있습니다. ChIP-seq는 살모넬라 테네리카 혈청염 혈류, 티피무리움 생물막 및 플랑크토닉 세포상에서 수행되며, 마스터 생물막 조절기인 CsgD를 대상으로 두 세포 유형에서 미분 결합을 결정한다. 여기서, 우리는 수확할 생물막의 적정량을 입증하고, 플랑크토닉 대조군 시료로 정상화하고, 교차 링커 접근을 위한 생물막을 균질화하고, 고품질의 시퀀싱 결과를 얻기 위해 일상적인 ChIP-seq 단계를 수행합니다.

Introduction

세균성 생물막, 자가 생산 된 매트릭스에 내장 된 세포의 구조적 응집체는 탈수, 항생제 및 숙주 면역반응에내성이 1. 이와 같이, 그(것)들은 지속적이고 만성 감염을 일으키는 원인이 되고 생존과 전송에 그들의 해결책 때문에 연구원에게 유일한 도전을 제출합니다. 살모넬라 엔티카 세로바르 티피무리움(S. 티피무리움)은 환경스트레스(28°C, 제한영양제)에 노출되었을 때 순수 배양에서 독성 인자를 발현하는 생물막 응집체, 및 플랑크토닉 세포의 전형적으로 이질적인 집단을 확립하는 것으로 밝혀졌다2. 이 2개의 세포 모형은 마스터 생물막 레귤레이터, CsgD3의이중 안정한 발현 때문에 생겨났습니다. 우리는 이것이 플랑크토닉 세포가 단기 전염에 참여하고 생물막 세포가 새로운 숙주에게 감염될 기회가 발생할 때까지 환경에서 장기적으로 지속될 수 있는 살모넬라에대한 내기 헤징 전략이 될 수 있다는 가설을 세웠습니다2,4. csg 오페론 발현을 제어하는 많은 조절 요소는5. 그러나, adrAcsg 오페론6을제외하고, CsgD의 몇몇 규제 표적은 알려져 있다. CsgD 규제 네트워크를 식별하면 살모넬라 수명 주기와 생물막이 전송에서 하는 역할을 더 잘 이해하는 데 도움이 됩니다.

고처리량 시퀀싱(ChIP-seq)에 이어 크로마틴 면역 침전은 단백질-DNA 상호작용의 게놈 전반식별을 위한 강력한 생체 내 기술이며 전사 인자, 히스톤 변형 또는 뉴클레오좀7과관련된 규제 과정에 대한 정보를 제공한다. 새로운 연구는 성장 조건과 세포 유형 사이의 차동 단백질 결합을 평가하기 위해이 기술을 사용했다8. 염색질 면역 침전 (ChIP)에서, 상호 작용하는 단백질을 가진 DNA 단편은 표적 단백질의 항체 선택을 통해 풍부합니다. 세포는 수확되고 DNA 결합 단백질은 포름알데히드 가교 처리를 통해 생체 내 DNA에 가교됩니다. 세포는 lysed, 세포 내용물 방출, 및 염색질은 대략 200-600 bp 단편7로전이된다. 표적 단백질에 결합된 DNA 단편은 항체를 사용하여 면역침전되고, 단백질 소화에 이어 디크로스링크에 의해 분리된다9. 이들 DNA 단편은 마이크로어레이(ChIP-chip)에 대한 혼성화또는 게놈서열(10,11)에대한 깊은 시퀀싱 및 매핑에 의해 일치하는 단백질 결합 부위를 나타낸다. ChIP 칩 실험은 적절한 규제 데이터를 산출하지만 고가의 프로브의 사용뿐만 아니라 혼성화 및 어레이 바이어스12로인해 제한됩니다. ChIP-seq는 증가된 뉴클레오티드 분해능 및 커버리지, 개선된 신호 대 잡음 비, 그리고 ChIP 칩7에비해 더 적은 아티팩트를 가진 더 큰 동적 범위를 가지고 있습니다.

ChIP는 살모넬라 혈청바 티피무리움13,14, 비브리오 알기놀리틱스15, 대장균의RpoS 규정에서 Sfh 및 OmpR 조절을 분석하는 데 사용되었습니다. I16, 결핵균에 있는 독성 조절제 EspR 규정17, 슈도모나스 aeruginosa18에 있는 AmrZ 규정을 통해 잠재적인 diguanylate 사이클라제18,뿐만 아니라 VraSR 황색포도상구균의규정19. 기술된 세균성 ChIP-seq 실험은 액체 매체에 있는 세포를 성장하고 단 세포 양식에 있는 수확으로 시작됩니다. 그러나, 생물막 및 상응하는 유전자 조절의 분석은 성공적인 ChIP-seq 프로토콜을 생성하기 위한 새로운 과제세트를 나타낸다. 이 프로토콜에서, ChIP-seq는 CsgD, S의 차등 조절 표적을 찾는데 사용된다. 생물막 및 플랑크토닉 세포 유형에서 티피무리움 마스터 생물막 조절기. 이 프로토콜은 ChIP-seq에 대한 적절한 양의 생물막을 결정하고, 플라스크 배양으로부터 생물막을 수확하고, 생물막 및 단일 세포 제어 샘플을 정상화하고, 생물막을 균질화하고, 완전한 면역 침전을 하는 데 사용되는 기술을 설명합니다. 이것은 세균성 생물막에 있는 규정하는 표적을 공부하기 위해 유용할 것이고 많은 종을 위해 적응될 수 있습니다.

Protocol

1. 플라스크 배양 세포 성장

  1. 냉동 된 stocks에서, LB 한천에 줄무늬 살모넬라 혈청 바르 티피무륨 균주 (100 mm 페트리 플레이트에서 20 mL 고체 매체) 적절한 항생제와 37 °C에서 배양 16-20 시간 동안 고립 된 식민지를 얻기 위해.
  2. 1.1 단계에서 줄무늬 플레이트에서 1-3 콜로니와 함께 25 mm x 150 mm borosilicate 배양 튜브에 적절한 항생제를 함유한 5 mL LB 국물을 접종합니다. 37°C에서 배양하고 7시간 동안 200 rpm에서 흔들어.
  3. 분광광도계를 사용하여 국물 배양OD600을 측정합니다. 2 mL 큐벳에서 PBS에서 4에서 배양 1의 알리쿼트를 희석하고 600 nm에서 흡광도를 측정합니다. 우리는 이 단계에서 가장 중요한 요인이 성장의 시기라고 판단했습니다. OD 값은 1.4단계에서 원하는 수의 셀을 제공하기 위해 배양을 정규화하는 데 사용됩니다.
  4. 1.0 OD600 부피의 세포 배양(즉, ~109세포)을 적절한 항생제와 함께 100 mL의 100 mL를 함유하는 Erlenmeyer 플라스크에 첨가한다. 28°C에서 배양하고 13시간 동안 200 rpm에서 흔들어.
    참고 : 생물막 세포는 응집 된 조각으로 나타나고 단일 플랑크토닉 세포는 흐린 매체에 있습니다.

2. 무세포 조절 1% 트립톤 수집

  1. 무세포 조절 1% 트립톤에 대한 플라스크 배양을 수집한다. 피펫 플라스크 배양은 원심분리튜브에 첨가하기 전에 혼합한다.
  2. 12,000 x g에서 10°C에서 10분 동안 모든 세포를 펠렛으로.
  3. 0.2 μm 필터 장치, 진공 필터에 상급제를 넣고 새로운 튜브에 분배합니다.
    참고: 바이오필름 응집체는 기존 용액(예: PBS)에서 부착되며 튜브 및 파이펫 팁의 측면에 충실합니다. 조작이 용이하기 때문에, 우리는 조절 된 매체 (1 % 트립톤)를 사용하여 초기에 생물막을 이동하고 가교 직전에 따뜻한 PBS를 사용하여 (단계 4.5) 미디어에 존재 할 수있는 단백질 가교 기판을 제거합니다.

3. 플라스크 배양물에서 생물막과 플랑크토닉 세포를분리2

  1. 멸균 25 mL 파이펫을 사용하여, 15 mL 튜브로 양상 플라스크 배양. 원심분리기는 2분 동안 저속(210 x g)으로,2개의 세포 유형을 분리한다.
    참고 : 생물 막 세포는 튜브의 바닥에 느슨한 펠릿을 형성해야합니다
  2. 플랑크토닉 세포를 함유하는 상급체를 나중에 2개의 40 mL 원심분리기 튜브로 피펫(단계 5). 펠릿을 방해하지 않도록 주의하면서 남은 액체를 모두 제거하십시오. 세포 유형이 모든 플라스크 배양 배지로부터 분리될 때까지 반복한다.

4. 생물막 응집체 준비

참고: 생물막은 젖은 무게로 수확되어 ChIP에 권장되는 최소 시작 물질인 DNA 25 μg를 산출합니다. S의 생물막 변환 인자(BCF). 티피무리움은 1.73 x 108 CFU/mg2입니다. 그밖 생물막 모형을 준비하는 연구원은 이 방정식을 사용하여 DNA 시작 물자의 25 μg를 위해 요구되는 생물막의 무게를 찾아기 위하여 이용되는 생물막의 단위 무게 당 세포의 수를 경험적으로 정의할 필요가 있을 것입니다:
Equation 1

  1. 2mL 스냅 캡 또는 스크류 캡 튜브를 정확하게 계량합니다.
  2. 1 mL의 컨디셔닝 된 트립톤에서 생물막 펠릿을 다시 중단하십시오. 재정지된 바이오필름을 미리 계량된 2mL 스냅 캡 또는 스크류 캡 튜브로 옮니다.
  3. 20 °C에서 11 000 x g에서 1 분 동안 원심 분리기
  4. 조심스럽게 튜브에서 모든 상급을 제거하고 정확하게 튜브를 무게. 생물막으로 튜브의 무게에서 튜브 무게를 빼서 생물막의 무게를 찾습니다. 대상 생물막 중량의 ±10%여야 한다.
  5. 나머지 컨디셔닝 된 트립톤을 제거하기 위해 세포를 세척하십시오. 튜브와 소용돌이에 따뜻한 PBS 1 mL을 추가하여 펠릿을 다시 놓습니다. 8 000 x g에서 3 분 동안 원심 분리를 펠릿 바이오 필름을 제거하고 상류를 제거합니다. 튜브와 소용돌이에 PBS 1 mL을 추가하여 펠릿을 다시 일시 중단합니다.

5. 판자 세포 준비

  1. 분광광도계를 사용하여 느린 속도 원심분리(단계 3.2)에서 플랑크토닉 상층의 부피와 OD600을 기록합니다.
  2. 6.0의 최종 OD600에 필요한 볼륨을 계산합니다.
    Equation 2
  3. 원심분리기를 원심분리기로 10°C로 냉각하고 퇴적물 플랭크토닉 세포를 원심분리(10°C에서 10분) 냉각
  4. 상급체를 제거하고 5.2단계에서 계산된 PBS의 최종 부피에서 세포 펠릿을 다시 중단한다.
  5. 분광광도계를 사용하여 플랑크토닉 세포의 OD600을 재측정하고 6.0 OD600 플랭크토닉 셀의 부피를 2 mL 스냅 캡 또는 스크류 캡 튜브로 분배합니다.
  6. PBS를 사용하여 볼륨을 1mL로 가져옵니다.

6. 균질화 세포

  1. 각 튜브에 멸균 된 5mm 스테인레스 스틸 비드 1 개를 추가하십시오.
  2. 30Hz에서 5분 동안 믹서 밀을 사용하여 균질화합니다.
  3. 균질화된 세포를 새로운 1.5 mL 튜브로 옮기고 금속 비드를 피합니다. PBS를 사용하여 볼륨을 1mL로 가져옵니다.
    참고: 직렬 희석을 수행하여 입력 셀을 열거하고 최종 셀 번호가 원하는 수 또는 예측 된 수에 가까운지 확인합니다.

7. DNA에 단백질의 가교

  1. 신선한 포름알데히드를 샘플 튜브에 1%의 최종 농도로 분배합니다. 회전 하는 바퀴에 실온에서 30 분 동안 배양.
    주의: 포름알데히드는 부식성, 피부, 눈 및 호흡기 자극성 이며 인화성. 연기 후드에 분배하십시오.
  2. 1M 글리신을 최종 농도 125 mM에 추가하여 가교를 중지합니다. 회전 하는 바퀴에 실온에서 5 분 동안 배양.

8. 여분의 크로스 링커를 제거하기 위해 셀을 세척하십시오.

  1. 세포를 8,000 x g에서 3 분 동안 침전시키고 상류물을 제거합니다.
  2. 25x 프로테아제 억제제의 20 μL 및 500 μL의 필터 멸균 PBS로 펠릿을 다시 일시 중단합니다.
  3. 8000 x g에서 3 분 동안 원심 분리 튜브를 제거하고 상류를 제거합니다.

9. 세포 를 리싱

  1. 펠릿을 600 μL Lysis 버퍼(표 1참조)에 다시 중단하고 10분 동안 얼음에 배양합니다.
  2. 멸균 된 15 mL 튜브에 IP 희석 버퍼 1.4 mL (표 1참조)을 추가하고 용해 된 세포를 15 mL 튜브로 이동합니다. 튜브를 얼음 위에 1.5-2 시간 동안 보관하고 가끔씩 소용돌이를 피하십시오.
    참고: 일부 내성 세포 재료는 튜브에 남아있을 수 있습니다. 가끔 소용돌이가 있는 얼음에 긴 잠복기가 되면 물질이 부서집니다. 나머지는 초음파 처리를 통해 분해됩니다.

10. 초음파 처리에 의한 DNA 조각화

  1. 15 mL 튜브를 얼음 비커에 놓고 튜브 내부에 3mm 프로브를 놓습니다.
  2. 400W의 20-40%에서 30초의 초음파 처리 5회를 수행하고 2분 동안 얼음을 식시고 버스트 사이에 냉각합니다.
  3. 퇴적물 은 원심 분리에 의해 물질을 침전 (8000 x g,4 °C에서 10 분). 상급체를 새 튜브로 옮김.
  4. 선택적으로, 65°C에서 30-60분 동안 디크로스링크를 수행하고 RNA와 단백질을 45°C에서 30-60분 동안 소화한 후 2% 아가로즈 겔에서 실행하여 적절한 크기의 단편을 확인합니다.
    참고: 프로브를 세포 에 침지합니다. 초음파 처리 및 휴식하는 동안 얼음에 용액을 유지합니다. 초음파 처리기 프로브가 맥동하는 동안 튜브를 제거하지 마십시오. 용액은 흐린 사전 초음파 처리 및 명확한 소각 후 나타납니다.

11. 면역 침전DNADNA-단백질 항체 복합체

  1. 준비
    1. 면역 침전을 위해 1.35 mL aliquot 1개, 입력 제어로서 200 μL aliquot 1개를 분배합니다. 입력 제어를 -80°C에서 디크로스링크 및 소화 단계가 수행될 때까지 저장합니다.
  2. 원발성 항체를 가진 면역 침전
    1. 정제된 단백질 특이적 1차 항체 10 μg를 1.35 μL aliquot에 첨가한다. 회전 식 휠에서 4 °C에서 밤새 배양합니다.
      주: 1차 항체는 단일클론 항체, 고품질 폴리클로날 혈청 또는 상업적 에피토프 항체(즉, 항-FLAG)일 수 있다.
    2. 11.2.1단계에서 튜브에 50 μL의 단백질 G 자기 비드를 넣고 회전 휠에서 3시간 동안 4°C에서 배양합니다.
    3. IP 세척 버퍼 1, IP 세척 버퍼 2 및 TE pH 8.0(표 1참조)을 얼음 양동이에 놓습니다. 65 °C로 따뜻한 용출 버퍼.
      참고: 용출 버퍼가 들어 있는 용액을 얼음 위에 두지 마십시오.
    4. 마그네틱 스탠드를 사용하여 단백질 G 자기 구슬을 튜브 측면에 묶습니다.
    5. 세척 수행: 750 μL 콜드 IP 워시 버퍼 1로 2x 세척하고, 750 μL 콜드 IP 워시 버퍼 2로 1x를 세척하고, pH 8.0에서 750 μL 콜드 TE로 2x를 세척합니다. 세차 하는 동안 자기 스탠드에 튜브를 유지 합니다.
    6. 450 μL의 IP 용출 버퍼(표 1참조)를 각 튜브에 넣고 5분마다 부드러운 와류를 사용하여 30분 동안 65°C에서 배양합니다.
    7. 마그네틱 스탠드를 사용하여 튜브 측면에 구슬을 묶습니다. 솔루션이 명확해질 때까지 최소 2분 동안 기다립니다.
    8. 마그네틱 비드 펠릿을 방해하지 않도록 주의하면서, 제거된 상급자를 새로운 1.5 mL 튜브에 분배합니다.

12. DNA 단백질 복합체를 교차 연결 해제하고 RNA와 단백질을 공동 정화하는 소화

  1. 각 튜브에 0.3 M의 최종 농도에 2 μg RNase A 및 NaCl을 추가합니다.
  2. 65 °C에서 배양, ≥6 시간, 또는 하룻밤.
  3. 각 튜브에 180 μg의 프로틴라제 K를 첨가한 다음 3-5시간 동안 45°C에서 배양하여 단백질 소화를 완료합니다.

13. 도서관 준비 및 시퀀싱

  1. 자기 구슬을 사용하여 DNA정화
    참고: 자기 구슬은 세균 세포를 가진 ChIP 도중 일반적으로 회수되는 DNA의 소량을 격리하기 위해 바람직합니다.
  2. 선택한 시퀀싱 플랫폼과 호환되는 키트를 사용하여 라이브러리를 준비합니다.
  3. 형광계 및 광범위한 dsDNA 키트 또는 qRT-PCR 라이브러리 정량화 키트로 라이브러리 농도를 확인합니다.
    참고: 우리의 경험에서, 형광계 측정은 DNA 농도를 과대 평가할 수 있습니다.
  4. 풀 라이브러리, 각 라이브러리 샘플에 대한 적절한 적용 범위를 고려합니다. 살모넬라와일루미나 시퀀싱을 위해 10-12개의 라이브러리를 모았다. Tris-HCl pH 8.0을 최종 농도 1 mM에 추가합니다.
  5. 선택한 플랫폼의 사양에 따라 순서를 정합니다.

Representative Results

세균성 생물막에서 염색질 면역 침전 샘플의 준비는 그림 1에나타난 바와 같이, 몇몇 단계를 관련시킵니다. 이들은 플라스크 배양에 있는 생물막 성장, 조건부 매체를 수집하고, 통제로 생물막 과 플랑막 세포의 적당한 양을 수집하고, PBS에 있는 세포를 세척하고, 균질화, DNA에 단백질을 가교하는, 용해 세포, 초음파 처리에 의하여 DNA를 단편화하고, 적당한 항체 및 단백질 G 구슬로 DNA를 단편화하고, 면역 절전성 면역 절전 DNA를, 세척하고 면역 절전DNA를 위한 DNA를, 세척하고 면역 절합하는 DNA를, 및 정제하는 DNA를 위한 정제를 포함합니다.

S. 생물막 유도 조건 하에서 액체 배양에서 성장한 티피무리움 세포는 다세포 생물막 응집체 및 플랑크토닉 세포를 형성하기 위해 표현형 전환을 거칩니다. 이 인구는 약 40% 생물막 응집체를 포함할 것이고, 이는 더 높은 수준의 디구아날레이트 사이클라스(DGCs) 및 생물막 조절기를 발현하고, 60% 플랑크토닉 세포는 더 높은 수준의 독성 관련 유전자를 발현하는2,4 (그림 2A)를함유한다. 본 프로토콜에서는 ChIP-seq를 통해 전사 부위를 비교하기 위해 두 세포 유형을 모두 수확하는 방법을 기술합니다. 그러나, 이 프로토콜은 그밖 세균성 종에 의해 형성된 생물막의 그밖 모형을 위해 적응될 수 있습니다. 생물막 응집체 및 플랑크토닉 세포는 느린 속도 원심분리에 의해 분리되며, 이는 펠렛 바이오필름과 상층부에서 플랑크토닉 세포를 잎을떠난다(그림 2B). 그런 다음 셀 유형은 프로토콜의 후속 단계에 대해 별도로 처리됩니다.

ChIP-seq에 대한 DNA 입력의 권장량은 10-25 μg20입니다. S. 티피무륨 플라스크 배양, 30 mg의 생물막은 약 25 μg의 DNA를 산출한다. 생물막 응집체는 단백질성 세포외 물질이 풍부하기 때문에, 우리는 이것이 가교의 효율성을 방해할 것이라는 가설을 세워 주체가 되었습니다. 우리가 단순히 세포 수에 의해 다른 세포 모형을 정규화하는 경우에, 플랑크토닉 세포의 처리는 면역 침전을 위해 제시된 가교된 제품의 불평등한 양이 귀착될 수 있습니다. 단백질 분석은 30 mg의 생물막과 일치하는 플랑크토닉 세포 물질의 동등한 양을 결정하기 위해 수행되었다(그림3). 6.0 OD600의 플랑크토닉 세포를 30 mg 생물막과 일치하도록 수확하였다.

생물막 응집체는 먼저 모든 세포에 대한 크로스 링커의 동등한 접근을 허용하기 위해 분리되어야 합니다. 우리는 세포를 균질화하는 가장 균일하고 높은 처리량 방법이 믹서 밀과 5 mm 스테인레스 스틸 비드를 사용하는 것을 발견했습니다(그림 4A). 플랑크토닉 세포는 ChIP-seq 실험에서 변수를 감소시키는 동일한 방식으로 처리된다(도4B).

DNA가 초음파 처리에 의해 단편화되고, 가교되고, RNase 및 Proteinase K로 처리되면, 2% 아가로즈 겔상에서 시각화될 수 있다. 초음파 처리된 DNA는 아가로즈 젤에 얼룩으로 나타나는 파편의 집합으로 분해됩니다. 초음파 파열의 수가 증가함에 따라 평균 단편 크기가 감소합니다(그림5). 에너지 전달은 다른 초음파 처리 장치에 따라 달라지므로 초음파 분석기는 DNA를 평균 1kb 미만으로 단편화하는 데 필요한 초음파 파열 수를 결정하는 것이 좋습니다. ChIP-seq 실험을 위해 5개의 버스트를 선택했습니다.

ENCODE 가이드라인은 면역블롯21을가진 항체 표적 결합 활성의 확인을 권장한다. 이 경우 우리는 ChIP를 위해 제조된 전체 세포 용해물에서 면역블롯에 의한 결합의 항체의 특이성 및 강도를 측정하였다(도6). 우리는 항체가 CsgD-3xFLAG에 결합한다는 것을 확인했습니다; 안티-FLAG 및 안티-CsgD 신호는 예상 분자량(28 kDa)(22)에서 동자화한다.

ChIP 절차는 수시로 DNA의 낮은 사격량을 산출합니다. 따라서, 오염물질을 제거하고 DNA의 높은 비율을 유지하는 정제 방법이 선택되었다. 자기 비드 정제는 낮은 농도의 ChIP DNA를 더 잘 유지했기 때문에 컬럼 기반 정제를 통해 선택되었다(도 7)및 제거된 오염물질(데이터는 도시되지 않음).

DNA의 감소된 시작 양 때문에, ChIP DNA의 도서관 준비는 희석된 어댑터 및 PCR 농축을 요구할 수 있습니다. 시퀀싱에 앞서 라이브러리는 BIOanalyzer 추적에 의해 시각화되어 PCR 농축 전후의 정확한 크기 분포를 확인할 수있습니다(그림 8). 추가적으로, 전사 인자의 공지된 조절 표적이 있는 경우에, qPCR은 면역침전 및 초음파 처리된 입력 DNA에 있는 공지된 표적 과 참조 유전자 서열 풍부 사이 접지 변화 (́Ct)를 비교하여 결합 지구의 풍부를 확인하기 위하여 이용되어야 합니다.

ChIP 시퀀싱 데이터는 품질 점수를 할당하고, 낮은 품질 베이스를 트리밍하고, 앞으로 및 역방향 읽기(페어링된 끝 시퀀싱)를 정렬하고, 고품질 참조 게놈으로 조립하고, 배경 위의 피크를 찾고, 다운스트림 분석을 수행하여 분석해야합니다(그림 9A). 다운스트림 분석에는 피크의 시각화 및 비고, 생물학적 복제 샘플과의 일관성 및 모티프 분석이 포함되어야 하며, 조건 또는 세포 유형 간의 차동 결합 분석, 알려진 경로의 유전자 발현과의 데이터 통합 등이 포함될 수 있습니다. 당사와 같은 ChIP-seq 데이터의 경우 피크는 단순히 접이식 변경이 아니라 p 값 으로 배경(그림9B, C,빨간색 막대)보다 크게 높은 것으로 식별되어야 합니다. 최종 분석에서, 매핑된 판독은 기준 게놈의 부각에 대하여 가시화된다(도9D). 가난한 ChIP-seq 결과는 배경 위에 중요한 피크없이 입력 -seq처럼 나타납니다.

Figure 1
그림 1: 세균성 생물막이 있는 ChIP-seq의 단계 의 그림. 기재된 절차에서, S. 티피무륨 세포는 28°C에서 트립톤 플라스크 배양액에서 1% 성장하여 흔들림(1)을 가지며, 무세포 조건부는 생물막 세포 유형(2)을 처리하기 위해 수집되며, 이는 적절한 양의 생물막 및 플랑크토닉 세포를 수집하는데 사용된다(3). 이들 세포는 PBS로 세척되고 균질화되어 생물막(4)을 분해한다. 단백질은 포름알데히드 가명으로 DNA에 가교되고, 그 후에 세포는 세포 내용물 (5)를 풀어 놓기 위하여 lysed됩니다. 세포 에서의 DNA는 초음파 처리 (6)에 의해 단편화된다. 표적 단백질에 가교된 DNA는 표적 단백질 및 단백질 G 자기 비드(7)에 결합하는 항체를 가진 면역침전을 통해 선택된다. 선택된 DNA는 단백질 G 자기 비드(8)로부터 세척 및 용출되고 라이브러리 준비 및 시퀀싱을 위해 정제된다(9). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: S를 공부하기 위한 시험관 내 플라스크 모델. 티피무리움 생물막 개발. (A) S. 28°C에서 13시간 동안 1% 트립톤에서 성장한 티피무리움 세포는 플라스크 배양의 액체 상에서 생물막 응집체 및 플랑크토닉 세포를 형성하기 위해 표현형 전환을 겪는다. (B)생물막 응집체 및 플랑크토닉 세포(A)에서 플라스크 배양으로부터 210 x g에서 원심분리를 통해 2분 동안 분리하였다. 상판은 플랑크토닉 세포 제제를 위해 수확되었고 펠릿은 생물막 세포 제제를 위해 수확되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: S로부터 수확된 플랑크토닉 세포 및 생물막 세포 샘플에 대한 총 단백질 농도. 티피무리움 플라스크 문화. 색색 단백질 분석이 수행되었고 BSA 표준 곡선에 상대적인 단백질 양은 750 nm에서 측정되었다. 4.0, 6.0 및 8.0 OD600에서 용해된 플랑크토닉 세포 샘플의 단백질 함량을 30 mg의 생물막 응집체와 비교하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
도 4: S로부터의 세포 샘플의 균질화. 티피무리움 생물막 플라스크 배양. (a)PBS에서 재혼된 플라스크 배양물로부터의 생물막 응집체(왼쪽)를 30 Hz에서 30 Hz에서 믹서 밀을 사용하여 균질화하여 5분(오른쪽). (b)PBS에서 재중단된 플라스크 배양으로부터의 플랑크토닉 세포를 세포 형 샘플 간의 일관성을 보장하기 위해 30 Hz에서 30 Hz에서 믹서 밀에 의해 5분 동안 처리하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5: 사전 ChIP 세포가 용해된 초음파 분석. 생물막 골재 및 플랑크토닉 세포 샘플을 분리, 균질화, 가교, 및 용해시켰다. DNA 단백질 복합체는 30s에서 최대 8회 까지 초음파 처리되었고 얼음에서 2분 간 초음파 처리하여 DNA를 더 작은 조각으로 부수게 했습니다. 초음파 처리된 라세이트의 일부를 2% 아가로즈 겔상에 분리하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
도 6: ChIP-seq에서 사용되는 항-FLAG 항체의 표적 결합 특이성. 항체 특이성은 S의 플라스크 배양물로부터 제조된 전체 세포 에 대한 면역블롯질에 의해 평가되었다. 그림과 같이 티피무륨 균주. 변형률 □csgD + p3xFLAG/csgD 및 WT 생물막 샘플은 플라스크에서 수확된 생물막 응집체를 나타내고, 반면, 균주는csgD ±p3xFLAG 및 WT 플랑크토닉 세포를 나타낸다. 정화된 그의 태그가 붙은 CsgD는 컨트롤로 로드되었습니다. 전체 세포 용해액을 정규화하여 각 레인에서 총 단백질 30 μg를 분석했습니다. 왼쪽의 숫자는 미리 염색된 분자량 마커의 크기(kDa)를 가리킵니다. 상부 블롯에 사용되는 1차 항체는 토끼-항-FLAG 폴리클로날 항체(Sigma-Aldrich #F7425)였고, 반면 하부 블롯은 CsgD 특이적 단일클론 항체2와함께 토끼 항-플래그로 배양되었다. 염소 항토끼 IgG(LiCor IRDye 680RD, 925-68071) 및 염소 항마우스 IgG(LiCor IRDye 800CW, 925-32210)를 이차 항체로 사용하였다. 형광 신호는 오디세이 CLx 이미징 시스템과 이미지 스튜디오 4.0 소프트웨어 패키지(Li-Cor Biosciences)를 사용하여 시각화되었습니다. 대표 이미지가 표시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 7
도 7: ChIP-seq 실험으로부터 유래된 소량의 DNA에 대한 컬럼-또는 자기 비드 기반 정제 전략. 공지된 양의 DNA 샘플을 컬럼 기반 키트 또는 자기 비드를 사용하여 정제하고 용리액의 농도를 정제후 측정하였다. 자기 구슬은 낮은 DNA 수준에서 더 나은 회복을 보였다, 일반적으로 ChIP-seq 프로토콜의 끝에서 발생하는 DNA의 낮은 양과 유사, 하지만 NGS 라이브러리 준비 전에. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 8
그림 8: 생물분석기별로 시각화된 ChIP DNA 제제 및 후속 라이브러리. (a)세포 매해 및 초음파 처리 후 게놈 DNA의 평균 단편 크기는 <1000 bp였으며, 200-500 bp 범위에서 대부분의 단편을 가지고 있었다. (b)라이브러리 준비를 위한 시작 재료는 검출 보다 하였다. (C)어댑터 결찰 및 PCR 농축을 통해 라이브러리 조각의 증폭이 가능합니다. (D)가난한 라이브러리 제제는 낮은 DNA 피크, 이상한 모양 또는 높은 분자량 피크, 또는 약 100 bp에서 풍부한 어댑터 피크를 가지고 있습니다.

Figure 9
그림 9: ChIP-seq 데이터는 생물 정보학 도구를 사용하여 분석하고 게놈 브라우저에서 시각화됩니다. ChIP-seq 데이터의 일반적인 생물 정보 분석을 위한 순서도. 생물막(μcsgD 스트레인 + p3xFLAG/csgD)과 플랑크토닉 세포(에서csgD + p3xFLAG)에 대한 원시 판독은 저품질의 판독 및 어댑터에 대해 세척하고, S에매핑하였다. 티피무리움 14028s 게놈(염색체의 경우 NC_016856.1, 플라스미드의 경우 NC_016855.1)은 기본 파라미터23을가진 Bowtie2(v2.3.3.1)에 의해. MACS2(v2.1.2)는 '-q 0.01 -- 노모델'의 매개 변수로 피크를 호출하는 데 사용되었으며, 바이오필름 복제를 테스트 데이터 세트로 사용하고 플랑크토닉 복제를 제어24로사용했습니다. MACS2 bdgcmp 모듈은 '-m FE'의 매개 변수로 접이식 농축 트랙을 생성하는 데 추가로 사용되었습니다. 접이식 농축 트랙이 있는 중요한 피크 파일은 베드툴/베드클립/베드그래프ToBigWig25를 사용하여 가발 파일로 변환되고 통합 유전체학 뷰어 v2.5.126을사용하여 참조 게놈에 시각화되었습니다. 대표 피크가 표시됩니다(빨간색 막대). (B)여러 피크를 포함하는 ~ 40 kbp의 큰 영역은 비정형 결과이지만 여전히 잠재적으로 가치가 있습니다. (C)이것은 두 개의 중요한 피크 영역을 보여주는 보다 일반적인 결과입니다. (D)C의 왼쪽 피크를 확대하여 S 영역에 대한 읽기 매핑을 표시합니다. Typhimurium 14028s 유전체는 uspAuspB에대한 발산 프로모터를 함유한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

세포 라기스 버퍼
리시스 버퍼
50 mM 트리스-HCl pH 8.1
10 mM EDTA
1% SDS
프로테아제 억제제
IP 희석 버퍼
20 mM 트리스-HCl pH 8.1
2 mM EDTA
150 mM 나클
1% 트리톤 X-100
0.01% SDS
면역 침전 버퍼
IP 세척 버퍼 1
20 mM 트리스-HCl pH 8.1
2 mM EDTA
50 mM 나클
1% 트리톤 X-100
0.1% SDS
IP 세척 버퍼 2
10 mM 트리스-HCl pH 8.1
250 mM 리클
1 mM EDTA
1% NP-40
1% 데옥시콜산
TE (T10E1)pH 8.0
10 mM 트리스-HCl
1 mM EDTA
용출 버퍼
1% SDS
100 mM NaHCO3

표 1. 버퍼 레시피.

Discussion

이 프로토콜은 순수 배양으로부터 살모넬라 테레리카 세로바르 티피무리움 생물막 및 플랑크토닉 세포와 함께 ChIP-seq를 수행하기 위한 기술을 개략적으로 설명하고, 마스터 생물막 조절기인 CsgD의 규제 대상을 찾아낸다. 우리는 두 가지 세포 유형에서 CsgD의 이중 안정성으로 인한 차동 결합 정보를 기대하며, 생물막 응집체의 높은 수준과 플랑크토닉 세포의 낮은 수준2,3. 그러나, 이 기술은 또한 다른 세균 전사 인자, 세포 유형, 또는 성장 조건에 적용될 수 있다. 특히, 이 기술은 생물막 세포의 단위 중량당 CFU에 대한 실험적으로 결정된 변환 인자를 사용하여 다른 세균 생물막에 적응될 수 있다.

ChIP-seq는 시퀀싱을 통해 기술적 오류를 증폭하는 경향이 있을 수 있습니다. 그러나 중요한 단계에서 확인하면 이27을방지할 수 있습니다. 1차 항체 특이성은 면역침전 동안 대조군 전사 인자 및 DNA만을 선택하는 데 중요하다7. 본 실험에서, csgD는 3' 유전자의 말단에서 플라스미드 인코딩된 3xFLAG 태그를 융합하였고, CsgD22의C-종단에 대응하였다. csgD가 없는 p3xFLAG 플라스미드는 "대조군"(S)으로사용되었다. 티피무리움 14028 □csgD + p3xFLAG). ENCODE 지침은 관심있는 단백질에 대하여 1 차적인 항체를 가진 면역blots를 능력을 발휘하는 것이 좋습니다, 및 ChIP 긴장 및 삭제 긴장21의용해. 전사 계수 바인딩 및 다운스트림 시퀀싱 결과의 가변성을 줄이기 위해 복제전반에 걸쳐 성장 조건이 일관되도록 하는 것이 중요합니다. 접종 크기 및 사전 접종 성장 조건이 일관되도록 주의하는 경우, 플라스크 배양에서의 생물막 성장은4. 모든 세포에 시약, 특히 포름알데히드 크로스 링커의 동등한 접근을 보장하기 위해 균질화 후 모든 생물막이 분해되었는지 확인하는 것이 중요합니다.

몇몇 수정은 연구원이 그밖 DNA 결합 단백질, 세포 모형, 긴장, 성장 조건, 또는 실험실 장비를 위해 이 프로토콜을 사용하는 가능하게 할 수 있습니다. S 이외의 생물막 형성 종에 사용되는 경우. 티피무리움, 생물막의 단위 중량당 콜로니 형성 단위의 변환 계수는 생물막의 상이한 양을 수확하고, 생물막을 철저히 균질화하고, 표준 곡선을 생성하기 위해 직렬 희석 및 플레이트 카운팅을 수행함으로써 실험적으로 결정되어야 하며, 이는 낮은 생물막 가중치에서 정확하지 않을 수 있다2. 초음파 처리기 에너지 전달 및 세포 유형 저항이 다를 수 있습니다. 따라서 초음파 분석기는 다운스트림 라이브러리 준비 및 시퀀싱(11)에필요한 조각 크기 범위를 생성하는 초음파 파열의 수를 찾는 것이 좋습니다. 마이크로 코칼 뉴클레아제에 의한 크로마틴 단편화는 점유 부위의 고해상도를 생성하는 초음파 처리의 대안입니다. 그러나,이 방법은 조각화 바이어스7,28을도입 할 수있다 . DNA 크기 범위는 다운스트림 라이브러리 준비 키트 및 시퀀싱 플랫폼에 따라 변경될 수 있습니다. 균질화의 다른 방법은 믹서 밀 대신에 사용될 수 있다. 예를 들어, 유리 조직 균질화제는 대체될 수 있지만, 에어로졸화되거나 불완전하게 생물막을 분해할 수 있다. 통제의 관점에서, 전 면역 침전제 DNA는 사후 염기서열 처리 및 분석에서 정규화될 수 있습니다. 종 일치 정상 항체 혈청을 이용한 모의 IP 대조군도13.

연구원은 ChIP-seq 실험을 고려할 때이 방법에 대한 한계를 고려해야합니다. 다른 생물막 유형에 적응하기 위해 상당한 수정이 필요할 수 있습니다. 예를 들어, 살모넬라 티피무리움이 PBS에서 생물막의 즉각적인 재중단을 통해 생물막 응집체의 측정 가능한 손실로 이어집니다. 박테리아에 있는 전사 인자의 규정하는 표적을 표적으로 하는 면역 침전은 DNA의 아주 작은 양이 귀착될 수 있습니다, 이는 나중 단계에서 정화 그리고 검출을 위한 도전입니다. 라이브러리 감지 시 전단 및 다운스트림 조작 중에 바이어스가 도입될 수있습니다 9. 또한, 이 방법은 전사 인자 결합에 반응하여 생체 내 발현 수준을 드러내지 않는다. 생물 정보학에 있는 작은 경험이 있는 연구원은 분석 파이프라인에 의해 도전될 수 있습니다. 이 방법은 시간이 많이 들고 비용이 많이 들 수 있습니다. 그러나 시퀀싱 비용은 마이크로어레이보다 낮은 경우가 많으며 기술 개선이 계속됨에 따라 시간이 지남에 따라 감소하고 있습니다.

문헌에서 몇 가지 방법은 박테리아와 ChIP를 설명하고, 대부분의 세균 실험은 간단한 성장 조건으로 시작13,14,15,17,18. 단일 셀을 사용하여 ChIP 샘플 준비는 간단하며 생물막 응집체를 가진 ChIP 샘플 준비보다 적은 과제를 제시합니다. ChIP-seq에 관해서는, 지수 농축 (SELEX), 전기 영동 이동성 변화 분석 (EMSA), ChIP 칩, 프로모터 삭제 및 리포터 분석에 의한 리간드의 체계적인 진화를 포함한 시스 규제 회로를 연구하는 이전 방법은 ChIP-seq29로보완되거나 대체되었습니다. ChIP-seq는 기술의 발전과 시퀀싱의 가용성으로 인해 ChIP 칩을 대체하고 있습니다. 심층 시퀀싱은 연구원에게 ChIP 칩11,30보다적은 시작 재료로 낮은 결합 선호도 및 더 높은 기본 쌍 해상도로 사이트를 식별 할 수있는 방대한 양의 데이터를 제공합니다. 고품질 기준 게놈을 가진 유기체에서 ChIP 데이터의 분석은 일반적으로 빠르고 구체적입니다. 부가적으로, ChIP-seq는 모든 세포 유형, 성장 단계, 또는 환경 조건에서 점유되지 않을 수 있는 실리코 예측 결합 부위에서 발견하기 위한 철저한 방법31이다.

미래에, 이 프로토콜은 세균성 병인, 특히 생물막 형성 유기체의 이해를 용이하게 하기 위하여 사용될 수 있다. 이 기술의 광범위한 채택 및 새로운 데이터 세트의 가용성은 생물막 형성 미생물(32)에있는 세포 프로세스를 통제하기 위하여 공동 지역화하는 단백질의 단을 확인하기 위하여 데이터 통합으로 이끌어 낼 수 있습니다. 또한, ChIP-seq 및 RNA-seq 데이터는 규제 시스템모델(33)을구축하기 위해 통합될 수 있다.

Disclosures

저자는 그들이 경쟁 적인 재정적 이익이 없다고 선언합니다.

Acknowledgments

이 연구는 자연 과학 및 공학 연구 위원회에서 보조금에 의해 지원 되었다 (NSERC) (#2017-05737) AW와 생명 공학에서 Jarislowsky 의자를 통해. MP는 서스 캐처 원 대학의 전염병, 식품 안전 및 공공 정책 (ITraP)의 통합 교육 프로그램을 통해 NSERC-CREATE 장학금을 지원받았습니다.

저자는 촬영 및 편집 다니 데일에게 감사드립니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose powder FroggaBio A87-500G
Balance (Explorer pro) Ohaus EP214
Benchtop Centrifuge (8510R) Eppendorf 022627023
Bioanalyzer 2100 Agilent G2939BA
BR dsDNA kit ThermoFisher Scientific Q32850
ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads Cell Signaling Technology 9006
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich COEDTAF-RO ROCHE
Conical tube 15 mL FroggaBio TB15-500
Conical tube 50 mL FroggaBio TB50-500
DC Protein Assay Kit II BioRad 5000112
Disposable Cuvette, 1.5 mL Fisher Scientific 14-955-127
Electrophoresis equipment (mini-PROTEAN) Bio-Rad 1658000
Floor centrifuge (Sorvall Evolution RC) Thermo Scientific 728211
Fluorometer (Qubit 3.0) Thermo Fisher Scientific Q33216
Formaldehyde Sigma-Aldrich 252549
GelRed® Nucleic Acid Gel Stain 10 000x in water Biotium 41003
High Sensitivity DNA kit Agilent 5067-4626
Incubator (shaking) VWR 1570-ZZMFG
Incubator (Water bath shaking) New Brunswick G76D
LB media VWR 90000-808
Magnetic stand (DynaMag) Fisher Scientific 12321D
Microcentrifuge (refrigerated) Eppendorf 5415R
Microcentrifuge Tubes, 1.5mL Fisher Scientific 05-408-129
MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycle) Illumina MS-102-3001
Mixer mill Retsch MM400
Nalgene 115 mL Filter Units, Sterile, 0.2 µm pore size Thermo Scientific 73520-980
NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina New England BioLabs E7370S
NGS Cleanup and Size Select magnetic beads Machery-Nagel 744970.5
Normal mouse serum AbCam ab188776
Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15 mm) Fisher Scientific FB0875712
Pipette controller FroggaBio MP001
Proteinase K ThermoFisher Scientific AM2542
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104
Rabbit Anti-FLAG Polyclonal Antibody Sigma-Aldrich F7425
RNase A (10 mg/mL; DNase and protease-free) ThermoFisher Scientific EN0531
Rotating wheel Crystal Technologies & Industries TR 01A
Safe-Lock Tubes (2.0 mL, colorless) Eppendorf 22363344
Serological pipette 25 mL FroggaBio 94024
Spectrophotometer Montreal Biotech Inc. Libra S22
Stainless Steel Beads, 5 mm Qiagen 69989
Tapered microtip 1/8" (3mm) Sonicator probe Sonics & Materials, Inc. 630-0418
Tryptone media VWR 90000-286
Ultrasonic Liquid Processor (Sonicator) Sonics & Materials, Inc. VC300
Vacuum equipment (Vacufuge plus) Eppendorf 022820001
Water bath 1 (Lab-line aquabath) Thermo Scientific 18000-1
Water bath 2 (Precision) Thermo Scientific 51221044

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References

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