Opprette svært spesifikke kjemisk indusert protein Dimerization Systems av trinnvis Phage utvalg av Kombinatorisk single-Domain antistoff bibliotek

* These authors contributed equally
Biochemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Biochemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Opprette kjemisk indusert protein dimerization systemer med ønsket affinitet og spesifisitet for et gitt lite molekyl ligand ville ha mange biologiske sensing og aktivering applikasjoner. Her beskriver vi en effektiv, generaliserings metode for de Novo engineering kjemisk indusert dimerization systemer via trinnvis utvalg av en phage Kombinatorisk ett domene antistoff bibliotek.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Gomez-Castillo, L., Watanabe, K., Jiang, H., Kang, S., Gu, L. Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library. J. Vis. Exp. (155), e60738, doi:10.3791/60738 (2020).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Protein dimerization hendelser som forekommer bare i nærvær av et lite molekyl ligand muliggjøre utvikling av små molekyl biosensors for disseksjon og manipulering av biologiske veier. Foreløpig bare et begrenset antall kjemisk indusert dimerization (CID) systemer eksisterer og engineering nye med ønsket følsomhet og selektivitet for bestemte små-molekylet ligander fortsatt en utfordring innen protein engineering. Vi her beskriver en høy gjennomstrømming screening metode, combinatorial binders-eYLL svalg av Cid (kombinerer-CID), for de Novo engineering av Cid-systemer som gjelder for et stort utvalg av ligander. Denne metoden bruker to-trinns valg av et phage-viste Kombinatorisk nanobody bibliotek for å få 1) "anker bindemidler" som først binder til en ligand av interesse og deretter 2) "dimerization bindemidler" som bare binder til anker bindemiddel-ligand komplekser. For å velge anker bindemidler er et Kombinatorisk bibliotek med over 109 komplementaritet-fastsettelse (CDR)-randomisert nanobodies vist med en biotinylated ligand og treff valideres med umerkede ligand av bio-Layer LABORATORIEFASILITETER (bli). For å få dimerization bindemidler, nanobody biblioteket er vist med anker bindemiddel-ligand komplekser som mål for positiv screening og de ubundne anker bindemidler for negativ screening. KOMBINERER-CID er grovt aktuelt å velge CID-bindemidler med andre immunglobulin, ikke-immunglobulin eller beregningsmessig utformet stillaser for å skape biosensors for in vitro-og in vivo-deteksjon av legemidler, metabolitter, signalmolekyler osv.

Introduction

CID-systemer, der to proteiner dimerize bare i nærvær av et lite molekyl ligand (figur 1), tilbyr allsidige verktøy for dissekere og manipulere metabolske, signalering, og andre biologiske trasé1. De har vist potensialet i biologisk aktivering, som for eksempel stoff-kontrollerte T celle aktivering2 og apoptose,for å forbedre sikkerheten og effekten avadoptiv-tcelle terapi. I tillegg gir de en ny metodikk for in vivo eller in vitro deteksjon av små molekyl mål. For eksempel kan CID proteiner være genetisk smeltet sammen med fluorescens reporter systemer (f. eks, fluorescens resonans energi overføring (bånd)5 og sirkulært permuted fluorescerende proteiner)6 for sanntids in vivo målinger, eller tjene som affinitet reagenser for sandwich enzym-knyttet immunosorbentanalyse analysen (Elisa)-lignende analyser.

Til tross for deres brede bruksområder, har det å skape nye CID-systemer som kan styres av et gitt lite molekyl ligand store utfordringer. Etablert protein binder engineering metoder inkludert dyr immunisering7, in vitro utvalg8,9, og beregningsorientert protein design10 kan generere ligand bindende proteiner som fungerer via binære protein-ligand interaksjoner. Disse metodene har imidlertid vanskeligheter med å skape et ligand-indusert trefoldig CID-kompleks. Noen metoder skaper Cid av kjemisk linking av to ligander som uavhengig binder til samme eller forskjellige proteiner11,12,13,14,15,16 eller stole på å velge bindemiddel proteiner som antistoffer rettet mot eksisterende små molekyl-protein komplekser17,18, og dermed har et begrenset utvalg av ligander.

Vi har nylig utviklet en combinatorial binders-eYLL svalg av Cid (kombinerer-CID) metode for de Novo engineering av Cid systemer19. Denne metoden kan få den høye spesifisitet av ligand-indusert dimerization (f. eks en anker-dimerization bindemiddel dissosiasjon konstant, Kd (uten ligand)/Kd (med ligand) > 1 000). Den dimerization spesifisitet oppnås ved hjelp av anker bindemidler med fleksible bindende nettsteder som kan innføre conformational endringer ved ligand binding, noe som gir grunnlag for valg av conformationally selektive bindemidler bare erkjenner ligand-bundet anker bindemidler. Vi demonstrerte et proof-of-prinsipp ved å skape cannabidiol (CBD)-indusert heterodimerer av nanobodies, en 12-15 KDA funksjonelt antistoff fragment fra Kamelid bestående av et universelt stillas og tre fleksible CDR løkker (figur 2)20, som kan danne en bindende lomme med tilpasningsdyktige størrelser for små-molekyl epitopes21,22. Spesielt, in vitro utvalg av et Kombinatorisk protein bibliotek bør være kostnadseffektiv og generaliserings for CID engineering fordi det samme høykvalitets biblioteket kan brukes på ulike ligander.

I denne protokollen og video, fokuserer vi på å beskrive de to-trinns in vitro utvalg og validering av anker (Figur 3A) og Dimerization bindemidler (Figur 3B) ved screening Kombinatorisk nanobody biblioteket med et mangfold høyere enn 109 bruker CBD som et mål, men protokollen bør være gjeldende for andre protein biblioteker eller små-molekylet mål. Screening av CID bindemidler tar vanligvis 6 – 10 uker (Figur 4).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. bibliotek konstruksjon

  1. Bruk et syntetisk Kombinatorisk antistoff bibliotek med et mangfold av ~ 1.23 – 7.14 x 109, som tidligere beskrevet19. Selv om denne protokollen ikke inkluderer biblioteket konstruksjon, kan det brukes til andre Kombinatorisk bindemiddel biblioteker.

2. Biotinylation av ligand mål eller ligand

  1. Biotinylate den valgte ligand, for eksempel CBD og tetrahydrocannabinol (THC)19, via ulike kjemiske syntese strategier, avhengig av egnede biotinylation områder av et mål.

3. Anchor bindemiddel screening

  1. Begynnelsen av det merkede området
    1. Begynn hver runde med valg ved å vaksinere en enkelt TG1 celle koloni, fersk dyrket i 6 mL 2YT ved 37 ° c og 250 omdreininger per minutt (rpm) til en 600 NM (OD600) absorbansen av ~ 0,5. Ruge cellene på isen for bruk i trinn 3.5.1.
  2. Negativt utvalg med biotin-bundet streptavidin perler
    1. Forbered "negative valg perler" ved å vaske 300 μL av streptavidin magnetiske perler ved hjelp av et magnetisk skille rack, 3x med 0,05% fosfat-bufret saltvann med mellom buffer (PBST, 1 x PBS med 0,05% Vol/Vol mellom 20%) og 2x med 1 x PBS.
    2. Resuspend perlene med 1 mL 1% kasein i 1 x PBS (pH = 7,4), og Mette perlene ved å legge til 5x den rapporterte bindings kapasiteten med biotin. Ruge ved romtemperatur (RT) på en Rotator for 1 t.
    3. Vask perlene 5x med 0,05% PBST og 3x med 1 x PBS, for totalt åtte vasker.
    4. Tilsett ~ 1013 phage partikler i 1% kasein/1% BSA i 1 x PBS (pH = 7,4) og RUGE ved RT på en Rotator for 1 t.
    5. Etter inkubasjons, samle supernatanten som skal brukes i trinn 3.3.6.
  3. Positivt utvalg med biotinylated ligand-bundet streptavidin perler
    1. Forbered "positive valg perler" ved hjelp av 1/2 volumet av perlene som brukes for "negative valg perler" følgende trinn 3.2.1.
    2. Re-suspendere perlene med 1 mL 1% kasein i 1 × PBS, pH 7,4 og Mette perlene ved å legge 5x full bindende kapasitet beregnet basert på manualen ved hjelp av biotinylated ligand av valget. Ruge på RT på en Rotator for 1 t.
    3. Vask perlene 5x med 0,05% PBST og 3x med 1 x PBS, for totalt åtte vasker.
    4. Blokker perlene med 1 mL 1% kasein/1% BSA i 1 x PBS (pH = 7,4) og ruge ved RT på en Rotator for 1 t for å forhindre ikke-spesifikk binding mellom phages og de streptavidin magnetiske perlene.
    5. Vask streptavidin magnetiske perler 3x med 0,05% PBST og en gang med 1 x PBS, for totalt fire vasker.
    6. Resuspend de streptavidin magnetiske perlene ved hjelp av de ubundne phages tatt fra trinn 3.2.5 og ruge ved RT på en Rotator for 1 t.
    7. Pakk ut supernatanten uten å forstyrre de magnetiske perlene. Lagre de ubundne phages som inn data, som skal brukes i trinn 3.5.1.
    8. Vask perlene 10x med 0,05% PBST og 5x bruker 1 x PBS. I mellom hver tre vasker overføre dem til et nytt rør for å unngå phages nonspecifically bundet til røret vegger.
  4. Eluering av phage-viste nanobodies
    1. Konkurransedyktige eluere bundet phages ved å legge til 450 μL av ikke-biotinylated ligand, ved hjelp av en konsentrasjon i micromolar området (for eksempel 10 – 50 μM) og INCUBATING ved RT på en Rotator i 30 min. Den valgte ligand konsentrasjon for konkurrerende eluering av bundne phages er avhengig av ønsket KD av "anker bindemiddel". Ligand konsentrasjoner kan være relativt høy i første valg runder og deretter redusert i senere runder.
    2. Samle supernatanten og lagre eluert phages som output, som skal brukes i trinn 3.5.2.
  5. Inn-/utgang titreringer og infeksjon
    1. For inn data titrering klargjør du 10x seriell fortynninger i 1 x PBS opp til 109-fold med inngangs phage fra trinn 3.3.7. Bruk de 107– 109 serielle fortynninger til å gjøre infeksjoner ved å overføre 10 μL-inndata phage fra hver FORTYNNING til 70 ΜL TG1 celler (OD600 på ~ 0,5). Ruge ved 37 ° c i 45 min., plate de infiserte TG1-cellene på 3 90 mm 2YT-agar-retter som inneholder 100 μg/mL Ampicillin og 2% (WT/Vol) glukose, og ruge over natten ved 37 ° c. Fra de over natten platene, phage input kan beregnes som følger:
      Equation 1
    2. For utdata infeksjon og titrering, overføre eluert phages fra trinn 3.4.2 til 3 mL TG1 celler (OD600 på ~ 0,5). Ruge i et vannbad ved 37 ° c for 45 min. Deretter forberede 10x seriell fortynninger i 2YT opp til 103-fold, plate hver fortynning på 90 mm 2YT-agar retter, og ruge over natten ved 37 ° c. Fra over natten platene, kan phage produksjon beregnes som følger:
      Equation 1
    3. Del de resterende infiserte TG1 cellene på 3 150 mm 2YT-agar plater som inneholder 100 μg/mL Ampicillin og 2% (WT/Vol) glukose. Ruge plater over natten ved 37 ° c.
  6. Bibliotek forsterkning og-gjenoppretting for ytterligere runder med valg
    1. Tilsett 3 mL 2YT per plate, skrap med en steril celle skraper og samle alle cellene i en 50 mL konisk rør. Bland de innsamlede cellene med steril glyserol (20% WT/Vol endelig konsentrasjon). Mål OD600 av blandingen og gjøre 3-5 lager alikvoter. Oppbevares ved-80 ° c for langtidsoppbevaring.
    2. For phage redning, fortynne den phagemid-inneholdende TG1 bakteriell blanding ved hjelp av 25 mL 2YT Media supplert med 2% glukose og 100 μg/mL Ampicillin til en OD600 på ~ 0,1. Kultur celler ved 37 ° c og 250 RPM til en OD600 på ~ 0,5.
    3. Superinfect cellene ved å legge til CM13 hjelper phage ved 5 x 109 PFU/ml og ruge ved 37 ° c og 250 rpm for 45 min. Den CM13 hjelperen phage gir nødvendig phage pels proteiner for montering av komplette phage partikler.
    4. Sentrifuger kulturen på 8 000 x g for 10 min for å fjerne glukose. Resuspend cellene med 50 mL 2YT medium supplert med 100 μg/mL Ampicillin og 50 μg/mL kanamycin og ruge ved 25 ° c og 250 RPM over natten.
    5. Sentrifuger cellene fra natten kulturen på 9 000 x g, 4 ° c for 30 min. Transfer supernatanten til et nytt rør og utløse phages i supernatanten med 1/5 volum Peg/NaCl løsning (20% WT/Vol polyetylen glykol-6 000 og 2,5 M NaCl). Bland forsiktig og Legg på isen i 1 time.
    6. Samle phage partikler ved sentrifugering ved hjelp av 12 000 x g ved 4 ° c i 30 min. Resuspend pellets med 1 ml 1 x PBS, og Overfør suspensjonen til et mikrosentrifugen rør. Sentrifuger røret ved 20 000 x g og 4 ° c i 10 min for å fjerne rester av bakterier.
    7. Overfør supernatanten til et nytt mikrosentrifugen rør uten å forstyrre bakterie pellet. Bruk en 1:100 fortynning til å måle absorpsjonen ved 269 NM og 320 NM. Det totale antallet phages kan beregnes ved hjelp av følgende formel23:
      Equation 3
    8. Oppbevar phage bibliotek ved 4 ° c for kortvarig bruk eller med 25% glyserol ved-80 ° c for langtidslagring.
    9. Gjenta runder med markering (trinn 3.1 – 3.6) i 3 – 6 runder eller til ønsket berikelse er observert (se resultater-delen). Plate og plukke enkelt kloner (del 4) for å karakterisere deres affinitet og spesifisitet til ligand (§ 5 – 7).

4. single klone isolasjon

  1. For å isolere individuelle kloner fra en beriket sublibrary, klargjør du 10x seriell fortynninger av de phage TG1 cellene (trinn 3.5.2). Plate seriell fortynninger på 90 mm 2YT-agar retter som inneholder 100 μg/mL Ampicillin og 2% (WT/Vol) glukose og ruge ved 37 ° c over natten.
  2. Fra natt platene plukker du enkelt kolonier til 250 μL av 2YT medier supplert med 100 μg/mL Ampicillin per brønn i sterile dype brønn plater og vokser ved 37 ° c over natten.
  3. Fra de over natten kulturer, vaksinere 10 μL til 500 μL av ferske 2YT medier supplert med 100 μg/mL Ampicillin.
  4. Vokse celler til en OD600 på ~ 0,5, legge CM13 Helper phage på 5 x 109 PFU/mL og ruge ved 37 ° c og 250 RPM for 45 min.
  5. Tilsett 500 μL av 2YT medier supplert med 100 μg/mL Ampicillin og 50 μg/mL kanamycin. Ruge ved 25 ° c og 250 RPM over natten.
  6. Sentrifuger den dype brønn plater fra over natten kulturer ved 3 000 x g for 10 min. samle supernatanten inneholder phage partikler uten å forstyrre cellen pellet.
  7. Phage partikler kan brukes for ELISA å bestemme spesifisitet av de valgte kloner til ligand. Biotin eller en strukturell homologe av målet kan brukes som en negativ kontroll.

5. Anchor bindemiddel validering av ELISA

  1. Coat 96 godt ELISA plater ved hjelp av 100 μL av 5 μg/mL streptavidin i belegg buffer (100 mM-buffer, pH = 8,6) ved 4 ° c over natten.
  2. Vask ELISA-platene 3x med 0,05% PBST og tilsett 100 μL av 1 μM biotinylated mål til mål brønnene. Tilsett 100 μL av 1 μM biotin eller mål homologe til kontroll brønnene. Ruge for RT for 1 h.
  3. Vask platene 5x med 0,05% PBST og blokker ikke-spesifikk binding ved å tilsette 300 μL av 1% kasein i 1 x PBS. Ruge for RT for 1 h.
  4. Vask ELISA-platene 3x med 0,05%-PBST og tilsett renset phage supernatanten. Ruge for 1 time ved RT.
  5. Vask ELISA platene 10x med 0,05% PBST og tilsett 100 μL pepperrot peroksidase (HRP)-M13 Major coat protein antistoff (1:10000 fortynning med 1 x PBS med 1% kasein). Ruge for RT for 1 h.
  6. Vask ELISA platene 3x med 0,05% PBST og tilsett 100 μL tetramethylbenzidine (TMB) substrat. Ruge i 10 minutter eller til det observeres en synlig fargeendring. Stopp reaksjonen ved å legge til 100 μL av 1 M HCl. Les platen ved 450 nm på en spektrofotometer.
  7. For protein uttrykk og rensing, Velg kloner viser høy affinitet og spesifisitet for målet (se diskusjon).

6. protein uttrykk, rensing og biotinylation

  1. Som tidligere rapportert19, subclone utvalgte kloner fra § 5 og uttrykke som C-terminal AVI-Tagged og hans-Tagged nanobodies.
  2. Express valgt nanobodies i periplasm av E. coli WK6 celler (vanligvis i 1 L kultur), utgivelse av osmotisk sjokk, og rense ved hjelp av en nikkel-NTA kolonne (se tabell over materialer).
  3. Exchange buffer med en avsaltingsspisser overlegne sammenlignet kolonne (1 x PBS med 5% glyserol, se tabell over materialer).
  4. Biotinylate nanobodies ved hjelp av et handels sett (se tabell over materialer) for videre bruk.

7. Anchor bindemiddel karakterisering av BLI

  1. Analyser bindingen affinitet og Kinetics av utvalgte anker bindemidler ved immobilizing 200 nM biotinylated anker bindemidler på streptavidin biosensors (se tabell av materialer) med binding analysen buffer (1 x PBS (pH = 7,4), 0,05% mellom 20, 0,2% BSA, 3% metanol).
  2. Beregn dissosiasjon konstanter (KD) av Anchor binder-ligand interaksjoner ved steady-state analyse ved hjelp av dataanalyse programvare (se tabell over materialer). Oppnådde KD -verdier varierer vanligvis fra enkelt til tosifret micromolar.

8. Dimerization bindemiddel screening

Merk: biopanning screening av "dimerization bindemidler" er omtrent det samme som anker bindemidler, med unntak av to viktige trinn: 1) Dimerization bindemidler velges ved hjelp av et valgt biotinylated anker bindemiddel og anker dokumentordneren-ligand kompleks for den negative og positive valg, henholdsvis. 2) under det eluering trinnet brukes 100 mM triethylamine til å eluere positivt utvalgte phages som bare var bundet til anker bindemiddelet – ligand mål kompleks. 100 mM trimetylamin oppløsning (pH = 11,5) brukes til å eluere positive kloner ved å forstyrre protein interaksjonen.

  1. Begynnelsen av det merkede området
    1. Begynn hver runde med valg ved å vaksinere en enkelt TG1 celle koloni, fersk dyrket på en minimal Media, i 6 mL 2YT ved 37 ° c og 250 RPM til en OD600 på ~ 0,5. Ruge celler på isen.
  2. Fjerning av negativt utvalgte nanobodies
    1. Forbered "subtraksjon rør" ved hjelp 400 μL av streptavidin-belagt magnetiske perler og Følg trinn 3,2. Men i stedet for mette med biotin, legge 5x den beregnede full bindende kapasitet ved hjelp av valgte biotinylated anker bindemiddel og lagre de ubundne phages som skal brukes i trinn 8.3.3.
  3. Valg av positivt utvalgt nanobodies
    1. Forbered "fange tube" ved hjelp 1/2 volumet av streptavidin magnetiske perler som brukes for "subtraksjon tube" og følgende trinn 3.3.2 til 3.3.3. Men i stedet for å mette med biotinylated ligand, legger du til fem ganger den beregnede fullstendige bindings kapasiteten ved hjelp av den valgte biotinylated anker dokumentordneren.
    2. For å danne anker perm-ligand kompleks for den positive dimerization bindemiddel utvalg, tilsett en høy nok konsentrasjon av ikke-biotinylated ligand. Dette vil tillate de fleste streptavidin anker bindemiddel å danne ligand-bundet kompleks.
    3. Følg trinn 3.3.3 til 3.3.8 ved hjelp av de ubundne phages som er Hentet fra "subtraksjon tube".
  4. Eluering av positivt utvalgte nanobodies
    1. Eluere phages bundet til anker bindemiddel-ligand kompleks ved å tilsette 450 μL av 100 mM triethylamine, og incubating ved RT på en Rotator i 10 min.
    2. Samle de konkurransedyktige eluert phages og følg trinnene 3.4.1 til 3.4.2.
  5. Ytterligere runder med valg av dimerization bindemiddel
    1. Følg trinn 3,5 og 3,6 for å forsterke og gjenopprette biblioteket for å utføre flere runder med valg. Gjenta runder med markering for 3 – 6 runder eller til ønsket berikelse er observert. Plate og plukke enkelt kloner (se avsnitt 4) for å karakterisere deres affinitet og spesifisitet til målet.

9. Dimerization ringperm karakterisering av ELISA

  1. Følg trinnene i del 4 for å isolere individuelle kloner for karakterisering via ELISA.
  2. For å teste affinitet av dimerization bindemiddel kandidater til anker bindemiddel-ligand kompleks, pels ELISA målet plate med 100 μL av 100 nM biotinylated anker bindemiddel. Etter inkubasjons for 1 t, tilsett 1 μM av ligand målet å danne ankeret bindemiddel-ligand kompleks.
  3. Kontroll platen skal være belagt med biotinylated anker bindemiddel alene til skjermen ut kloner som også kan binde seg til den frie ankeret bindemiddel. Tilsett 100 μL av 100 nM biotinylated anker bindemiddel og ruge ved RT for 1 time.
  4. Følg avsnittene 5.3 – 5.7.

10. Dimerization ringperm karakterisering av BLI

  1. Bindingen affinitet og Kinetics av dimerization bindemidler for ankeret bindemiddel--ligand kompleks kan analyseres ved immobilizing biotinylated dimerization bindemidler på streptavidin (SA) biosensors med bindingen analysen buffer og deretter analyseres med 1 μM anker bindemiddel pre-equilibrated med seriell fortynninger av ligand. Den kD, k, og koff av interaksjoner kan beregnes ved hjelp av vår rapporterte metode19.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Vi beskriver de to-trinns in vitro valg og validering av anker og dimerization bindemidler ved screening Kombinatorisk nanobody biblioteket med et mangfold høyere enn 109 bruker CBD som et mål. Vurdere berikelse av phage biopanning under suksessive runder av utvalget for både anker og dimerization bindemidler er viktig. Typiske berikelse resultater etter 4-6 runder av utvalget som vist i figur 5 er en god indikasjon på at det er en høy andel av potensielle treff i sublibraries, så ytterligere runder av utvalget kan ikke være nødvendig.

En enkelt klone ELISA er egnet til å analysere den relative bindende affinitet og selektivitet av anker og dimerization bindemidler. Figur 6a er en representant anker bindemiddel valgresultat etter seks runder med biopanning. Kloner som viser høy (f.eks. #87) eller lav (f.eks. #27) ligand selektivitet kan sammenlignes. Høy selektivitet kloner bør velges som anker bindemiddel kandidater. Likeledes viser figur 6B dimerization dokumentordneren utvalgs resultater etter fire runder med biopanning. Vi har vanligvis observert kloner som dannet en heterodimer med immobilisert anker perm bare med ligand (f. eks #49) eller uten (for eksempel #80). Den tidligere, viser dimerization spesifisitet, bør velges for videre validering.

Anchor bindemiddel ELISA avhengig av bruk av biotinylated målet. Derfor må vi bruke BLI for å ytterligere bekrefte bindingen til det ikke-merkede målet. BLI tillater også karakterisering av bindende Kinetics. Representative BLI-resultater av anker-og dimerization bindemidler er vist i henholdsvis figur 7A og 7b. Den venstre paneler viser ligand konsentrasjon-avhengige binding, noe som tyder på at de er egnet for å konstruere et CID-system. De riktige panelene viser de negative kontrollene. Den beregnede KD of Anchor og dimerization bindemiddel interaksjoner i nærvær av ligand vanligvis varierte fra tosifret nanomolar til tosifret micromolar. De kan variere avhengig av ligand og Kombinatorisk bibliotek av valget.

Analytisk størrelses ekskludering kromatografi (SEC) ble utført for å bekrefte heterodimer formasjon mellom anker og dimerization bindemidler. En dimerization topp ble observert da ankeret og dimerization bindemidler og CBD ble blandet (Figur 8A, rød linje). I kontrast ble ingen dimerization peak påvist i fravær av CBD (Figur 8A, blå linje) eller når hver dokumentordner var lastet til kolonnen alene (Figur 8B). Den kjemiske Cross Linking ble brukt til å stabilisere CID komplekser, og krysskoblet nanobodies har noe økt størrelser tilsvarende tidligere eluert topper.

Figure 1
Figur 1: mekanisme av kjemisk indusert protein dimerization. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: skjematisk fremstilling av en syntetisk nanobody Kombinatorisk bibliotek. Biblioteket er konstruert ved hjelp av en universell nanobody stillas og innlemme designet distribusjoner av aminosyrer til hver tilfeldig posisjon i tre komplementaritet-fastsettelse regioner (CDR) av en Trinucleotide mutagenese (TRIM) teknologi 24. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: flytdiagram av (A) anker og (B) dimerization bindemiddel screening. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: tidslinje for kombinerer-Cid. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: berikelse av phage titers etter hver runde av biopanning for ankeret bindemiddel valget. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: REPRESENTATIVE Elisa-resultater som viser positive (+) og negative (*) kloner. (A) anker bindemiddel Elisa resultater fra 96 tilfeldig plukket kloner etter seks runder med utvalg. (B) Dimerization bindemiddel Elisa resultatene av 96 tilfeldig plukket kloner etter fire runder med utvalg. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: Anchor og dimerization bindemiddel kinetisk analyse av bli. (A) analyse av anker bindemiddel med umerkede CBD (venstre) og THC (høyre). Biotinylated anker bindemiddel ble immobilisert på super Streptavidin (SSA) biosensors titrert med ulike konsentrasjoner av CBD. Målte data for CBD-binding (røde kurver) ble globalt montert (grå linjer). (B) Left, bli analyse av en sa Biosensor-immobilisert dimerization bindemiddel binding til ankeret bindemiddel preequilibrated med ulike KONSENTRASJONER av CBD. Høyre, var ankeret bindemiddel konsentrasjonen titrert og bundet til immobilisert dimerization bindemiddel i fravær av CBD. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 8
Figur 8: SEC-analyse av heterodimerization mellom ankeret og dimerization bindemidler. (A) dimerization og anker bindemidler (5 μM hver) i nærvær eller fravær av CBD ble krysskoblet av 100 μM BIS-N-succinimidyl-(pentaethylene glykol) Ester i 30 min ved RT før analysen. Eluering volumer av protein standarder er preget av trekanter. (B) ikke-krysskoblet anker og dimerization bindemidler (30 μM hver) ble injisert separat. Kromatogrammene i A og B vises i forskjellige Y-skalaer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Det er viktig å velge riktig konsentrasjoner av input phage biblioteker for ulike runder av biopanning. Vi vanligvis startet fra en input bibliotek av ~ 1012-1013 phage partikler med et mangfold > 109, slik at ~ 100-1000 eksemplarer av hver phage klone skal presenteres i pull-Down analysen. Hvis phage konsentrasjon i en bindende analysen er for høy eller lav, vil sannsynligheten for uspesifisert binding eller tap av positive kloner øke. Ankeret eller dimerization binder utvalget består vanligvis av tre til seks runder med biopanning, og output phage teller vanligvis starter fra ~ 104 og øker til ~ 108-109. Det er egnet til å plukke enkelt kloner for ELISA godkjenningen etter å observere en slik berikelse. Flere runder med biopanning kan redusere sjansene for å identifisere egnede lav-overflod positive kloner.

Det er viktig å konfigurere egnede negative kontroller og valg for å forbedre suksessen til valgene. For eksempel vil bruk av strukturelle analogs av ligand mål lette valg av ligand spesifisitet. I vårt arbeid, en svært lik analog, THC, ble brukt som en kontroll for CBD i ELISA og BLI validering av anker og dimerization bindemidler19. Hvis anker bindemidler har relativt lav ligand bindings affinitet i den dimerization dokumentordneren, kan både frie og ligand anker bindemidler presenteres som mål i det positive utvalget. Derfor er det viktig å fjerne bindemidler som binder seg til frie anker bindemidler under det negative valget. Dette kan oppnås ved å utføre flere runder av subtraksjon med gratis anker bindemidler.

En begrensning av vår protokoll er at målet molekyler må biotinylated for ankeret bindemiddel utvalg og bare én eller noen få anker bindemidler kan brukes til dimerization utvalg. Bruken av biotinylated mål kan berike bindemidler som delvis binder til linker mellom biotin og mål. Derfor er det viktig å validere treff ved hjelp av umerkede mål ved å BLI eller andre teknikker. Å velge en enkel eller noen få anker bindemidler for dimerization bindemiddel utvalg kan redusere sjansen for å identifisere CID-systemer med egnet følsomhet og spesifisitet. Således, det multipleksing evnen av valget venter fremme forbedring av kopling å annet teknikker — for eksempel, enkelt-molekylær-vekselvirkningen sekvensering (SMI-SEQ) hvilke setter i en "bibliotek-av-bibliotek" protein-protein vekselvirkningen skjermen25.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Et provisorisk patent relatert til dette arbeidet har blitt innlevert av University of Washington.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av University of Washington Innovation Award (til L.G.), et stipend fra US National Institutes of Health (1R35GM128918 til L.G.), og en oppstart fondet av University of Washington (til L.G.). H.J. ble støttet av en Washington Research Foundation Undergraduate fellesskap. KW ble støttet av et universitets stipend fra University of Washington Institute for protein design.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-Step Ultra TMB ELISA substrate solution Thermo Fisher Scientific 34029
Agar Thermo Fisher Scientific BP1423-2
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter unit (3 kDa cutoff) Millipore UFC900324
Ampicillin Thermo Fisher Scientific BP1760-25
Bio-Rad Protein Assay Kit II Bio-Rad 5000002
BirA biotin-protein ligase standard reaction kit Avidity BirA500
Bovine Serum Albumin (BSA) Sigma-Aldrich A2153-50G
Casein Sigma-Aldrich C7078-1KG
CM13 Helper phage Antibody Design Labs PH020L
D-(+)-Glucose monohydrate Alfa Aesar A11090
Dynabeads M-280 Streptavidin Thermo Fisher Scientific 11205D
DynaMag-2 Magnet Thermo Fisher Scientific 12321D
EDTA Thermo Fisher Scientific BP120-1
Fast DNA Ladder New England Biolabs N3238S
FastDigest BglI Thermo Fisher Scientific FD0074
Glycerol Thermo Fisher Scientific BP229-1
HiLoad 16/600 Superdex 200 pg GE Healthcare 28989335
HiPrep 26/10 Desalting Column GE Healthcare 17508701
HisTrap-FF-1ml GE Healthcare 11000458
Imidazole Alfa Aesar 161-0718
IPTG Thermo Fisher Scientific 34060
Kanamycin Thermo Fisher Scientific BP906-5
M13 Major Coat Protein Antibody Santa Cruz Biotechnology sc-53004
NaCl Sigma-Aldrich S3014-500G
NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers Thermo Fisher Scientific ND-2000
Nunc 96-Well Polypropylene DeepWell Storage Plates Thermo Fisher Scientific 260251
Nunc MaxiSorp Thermo Fisher Scientific 44-2404-21
Octet RED96 ForteBio N/A
pADL-23c Phagemid Vector Antibody Design Labs PD0111
PEG-6000 Sigma-Aldrich 81260-1KG
Platinum SuperFi DNA Polymerase Invitrogen 12351010
PureLink PCR Purification Kit Thermo Fisher Scientific K310001
QIAprep Spin M13 Kit Qiagen 27704
Recovery Medium Lucigen 80026-1
SpectraMax Plus 384 Molecular Devices N/A
Sucrose Sigma-Aldrich S0389-1KG
Super Streptavidin (SSA) Biosensors ForteBio 18-5057
Superdex 75 increase 10/300 GL Column GE Healthcare 28-9909-44
T4 DNA Ligase Thermo Fisher Scientific 15224-025
TG1 Electrocompetent Cells Lucigen 60502-1
Triethylamine Sigma-Aldrich 471283-100mL
Trizma Base Sigma-Aldrich T1503
Tryptone Thermo Fisher Scientific BP9726-5
Tween 20 Thermo Fisher Scientific BP337-500
Yeast Extract Thermo Fisher Scientific BP1422-2
Zeba Spin Desalting Column Thermo Fisher Scientific 89882

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stanton, B. Z., Chory, E. J., Crabtree, G. R. Chemically induced proximity in biology and medicine. Science. 359, (6380), (2018).
  2. Wu, C. Y., Roybal, K. T., Puchner, E. M., Onuffer, J., Lim, W. A. Remote control of therapeutic T cells through a small molecule-gated chimeric receptor. Science. 350, (6258), (2015).
  3. Straathof, K. C., et al. An inducible caspase 9 safety switch for T-cell therapy. Blood. 105, (11), 4247-4254 (2005).
  4. Di Stasi, A., et al. Inducible apoptosis as a safety switch for adoptive cell therapy. The New England Journal of Medicine. 365, (18), 1673-1683 (2011).
  5. Mank, M., et al. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophysical Journal. 90, (5), 1790-1796 (2006).
  6. Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2+. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, (6), 3197-3202 (2001).
  7. Hunter, M. M., Margolies, M. N., Ju, A., Haber, E. High-affinity monoclonal antibodies to the cardiac glycoside, digoxin. Journal of Immunology. 129, (3), 1165-1172 (1982).
  8. Bradbury, A. R. M., Sidhu, S., Dubel, S., McCafferty, J. Beyond natural antibodies: the power of in vitro display technologies. Nature Biotechnology. 29, (3), 245-254 (2011).
  9. Chen, G., et al. Isolation of high-affinity ligand-binding proteins by periplasmic expression with cytometric screening (PECS). Nature. Biotechnology. 19, (6), 537-542 (2001).
  10. Tinberg, C. E., et al. Computational design of ligand-binding proteins with high affinity and selectivity. Nature. 501, (7466), 212-216 (2013).
  11. Spencer, D. M., Wandless, T. J., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. Controlling signal transduction with synthetic ligands. Science. 262, (5136), 1019-1024 (1993).
  12. Ho, S. N., Biggar, S. R., Spencer, D. M., Schreiber, S. L., Crabtree, G. R. Dimeric ligands define a role for transcriptional activation domains in reinitiation. Nature. 382, (6594), 822-826 (1996).
  13. Belshaw, P. J., Ho, S. N., Crabtree, G. R., Schreiber, S. L. Controlling protein association and subcellular localization with a synthetic ligand that induces heterodimerization of proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, (10), 4604-4607 (1996).
  14. Farrar, M. A., AlberolaIla, J., Perlmutter, R. M. Activation of the Raf-1 kinase cascade by coumermycin-induced dimerization. Nature. 383, (6596), 178-181 (1996).
  15. Erhart, D., et al. Chemical Development of Intracellular Protein Heterodimerizers. Chemistry & Biology. 20, (4), 549-557 (2013).
  16. Ballister, E. R., Aonbangkhen, C., Mayo, A. M., Lampson, M. A., Chenoweth, D. M. Localized light-induced protein dimerization in living cells using a photocaged dimerizer. Nature Communications. 17, (5), 5475 (2014).
  17. Hill, Z. B., Martinko, A. J., Nguyen, D. P., Wells, J. A. Human antibody-based chemically induced dimerizers for cell therapeutic applications. Nature Chemical Biology. 14, (2), 112-117 (2018).
  18. Foight, G. W., et al. Multi-input chemical control of protein dimerization for programming graded cellular responses. Nature Biotechnology. 37, (10), 1209-1216 (2019).
  19. Kang, S., et al. COMBINES-CID: An efficient method for de novo engineering of highly specific chemically induced protein dimerization systems. Journal of the American Chemical Society. 141, (28), 10948-10952 (2019).
  20. Muyldermans, S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).
  21. Fanning, S. W., Horn, J. R. An anti-hapten camelid antibody reveals a cryptic binding site with significant energetic contributions from a nonhypervariable loop. Protein Science. 20, (7), 1196-1207 (2011).
  22. Zavrtanik, U., Luken, J., Loris, R., Lah, J., Hadzi, S. Structural basis of epitope recognition by heavy-chain camelid antibodies. Journal of Molecular Biology. 430, (21), 4369-4386 (2018).
  23. Denhardt, D. T., Dressler, D., Ray, D. S. The Single-Stranded DNA Phages. 605-625 (1978).
  24. Virnekas, B., et al. Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis. Nucleic Acids Research. 22, (25), 5600-5607 (1994).
  25. Gu, L., et al. Multiplex single-molecule interaction profiling of DNA-barcoded proteins. Nature. 515, (7528), 554-557 (2014).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics