Quantifizierung des Ethanolgehalts in Zebrafisch-Embryonen mittels Head Space Gas Chromatographie

Developmental Biology

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Summary

Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll zur Quantifizierung des Ethanolgehalts in einem Zebrafisch-Embryo mithilfe der Kopfraumgaschromatographie von geeigneten Expositionsmethoden für die Embryoverarbeitung und Ethanolanalyse.

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Lovely, C. B. Quantification of Ethanol Levels in Zebrafish Embryos Using Head Space Gas Chromatography. J. Vis. Exp. (156), e60766, doi:10.3791/60766 (2020).

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Abstract

Fetale Alkoholspektrumsstörungen (FASD) beschreiben ein hochvariables Kontinuum von Ethanol-induzierten Entwicklungsfehlern, einschließlich Gesichtsdysmorphologien und neurologischen Beeinträchtigungen. Bei einer komplexen Pathologie betrifft FASD etwa 1 von 100 Kindern, die jedes Jahr in den Vereinigten Staaten geboren werden. Aufgrund der sehr variablen Natur von FASD haben sich Tiermodelle in unserem aktuellen mechanistischen Verständnis von ethanolinduzierten Entwicklungsfehlern als kritisch erwiesen. Immer mehr Laboratorien konzentrieren sich auf die Verwendung von Zebrafischen zur Untersuchung von Ethanol-induzierten Entwicklungsfehlern. Zebrafische produzieren eine große Anzahl von extern befruchteten, genetisch befruchtbaren, durchscheinenden Embryonen. Dies ermöglicht es Forschern, Timing und Dosierung der Ethanol-Exposition in mehreren genetischen Kontexten präzise zu steuern und die Auswirkungen der embryonalen Ethanol-Exposition durch Live-Bildgebungstechniken zu quantifizieren. Zusammen mit dem hohen Grad an Erhaltung sowohl der Genetik als auch der Entwicklung beim Menschen hat sich der Zebrafisch als ein starkes Modell erwiesen, um die mechanistische Grundlage der Ethanol-Teratogenität zu untersuchen. Die Ethanolexpositionsschemas unterscheiden sich jedoch zwischen verschiedenen Zebrafischstudien, was die Interpretation von Zebrafischdaten in diesen Studien verwirrt hat. Hier ist ein Protokoll zur Quantifizierung der Ethanolkonzentrationen in Zebrafischembryonen mittels Kopfraumgaschromatographie.

Introduction

Fetal Alcohol Spectrum Disorders (FASD) beschreibt eine breite Palette von neurologischen Beeinträchtigungen und craniofacial Dysmorphologien im Zusammenhang mit embryonalen Ethanol-Exposition1. Mehrere Faktoren, einschließlich Timing und Dosierung der Ethanol-Exposition und genetischen Hintergrund, tragen zur Variation von FASD2,3. Beim Menschen macht die komplexe Beziehung dieser Variablen das Studium und Verständnis der Ätiologie der FASD schwierig. Tiermodelle haben sich als entscheidend für die Entwicklung unseres Verständnisses der mechanistischen Grundlage der Ethanol-Teratogenität erwiesen. Eine Vielzahl von Tiermodellsystemen wurde verwendet, um mehrere Aspekte der FASD zu untersuchen, und die Ergebnisse stimmten bemerkenswert mit dem überein, was bei der Exposition beim Menschen gefunden wird4. Nagetiermodellsysteme werden verwendet, um viele Aspekte von FASD zu untersuchen, wobei Mäuse die häufigsten5,6,7sind. Der Großteil dieser Arbeit konzentrierte sich auf Entwicklungsdefekte bei früher Ethanol-Exposition8, obwohl sich eine spätere Exposition gegenüber Ethanol als Entwicklungsanomalien sowie9erwiesen hat. Darüber hinaus haben die genetischen Fähigkeiten von Mäusen in unserer Fähigkeit, die genetischen Grundlagen von FASD10,11zu erforschen, stark unterstützt. Diese Studien an Mäusen deuten stark darauf hin, dass es Gen-Ethanol-Wechselwirkungen mit dem Schall-Igel-Signalweg, Retinsäure-Signalisierung, Superoxid-Dismutase, Stickoxid-Synthase I, Aldh2 und Fancd28,10,11,12,13,14,15,16,17,18 , 19,20,21. Diese Studien zeigen, dass Tiermodelle entscheidend sind, um unser Verständnis von FASD und seinen zugrunde liegenden Mechanismen zu fördern.

Der Zebrafisch hat sich als ein leistungsfähiges Modellsystem entwickelt, um viele Aspekte der Ethanolteratogenese22,23zu untersuchen. Aufgrund ihrer externen Befruchtung, hohen Fruchtbarkeit, genetischen Traktionsfähigkeit und Live-Bildgebung sind Zebrafische ideal geeignet, um Faktoren wie Timing, Dosierung und Genetik der Ethanol-Teratogenese zu untersuchen. Ethanol kann präzise inszenierten Embryonen verabreicht werden und die Embryonen können dann abgebildet werden, um die direkte Wirkung von Ethanol während der Entwicklungsprozesse zu untersuchen. Diese Arbeit kann direkt mit dem Menschen in Verbindung gebracht werden, da die genetischen Entwicklungsprogramme zwischen Zebrafischen und Menschen stark konserviert sind und daher helfen können, FASD-Humanstudien zu leiten24. Während Zebrafische verwendet wurden, um Ethanol-Teratogenese zu untersuchen, macht ein Mangel an Konsens bei der Meldung embryonaler Ethanolkonzentrationen den Vergleich mit Menschen schwierig25. In Säugetiersystemen korrelieren Blutalkoholwerte direkt mit dem Ethanolspiegel des Gewebes26. Viele der Zebrafisch-Studien behandeln Embryonen vor der vollständigen Bildung ihres Kreislaufsystems. Da keine mütterliche Probe zu untersuchen ist, ist ein Verfahren zur Bewertung der Ethanolkonzentrationen erforderlich, um den Ethanolgehalt im Embryo zu quantifizieren. Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Quantifizierung der Ethanolkonzentrationen in einem sich entwickelnden Zebrafisch-Embryo mittels Kopfraumgaschromatographie.

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Protocol

Alle zebrafischen Embryonen, die in diesem Verfahren verwendet wurden, wurden nach den etablierten IACUC-Protokollen27aufgezogen und gezüchtet. Diese Protokolle wurden von der University of Texas at Austin und der University of Louisville genehmigt.

HINWEIS: Die Zebrafischlinie Tg (fli1:EGFP)y1 wurde in dieser Studie verwendet28. Bei allem Wasser, das in diesem Verfahren verwendet wird, ist steriles Umkehrosmosewasser. Alle statistischen Analysen wurden mit Graphpad Prism v8.2.1 durchgeführt.

1. Herstellung von Embryomedien

  1. Um einen 20-fachen Vorrat an Embryomedien zu machen, lösen Sie 17,5 g NaCl, 0,75 g KCl, 2,9 g CaCl2, 0,41 g K2HPO4, 0,142 g NA2HPO4und 4,9 g MgSO4,7H2O in 1 L Wasser auf. Ignorieren Sie den weißen Niederschlag, der sich bildet; dies wirkt sich nicht auf die Medien aus. Filter sterilisieren die Lagerlösung und lagern bei 4 °C.
  2. Um die funktionierende Embryo-Medienlösung zu schaffen, lösen Sie 1,2 g NaHCO3 in 1 L 20x Embryomedienbestand auf und fügen Sie 19 L Wasser hinzu. Halten Sie die funktionierende Embryo-Medienlösung bei 28 °C.

2. Messung des embryonalen Volumens durch Wasserverschiebung

HINWEIS: In diesem Protokoll werden 24 h Postfertilisation (hpf) Embryonen verwendet (Abbildung 1). Die bei den Volumenmessungen verwendeten Embryonen werden in der Ethanolanalyse nicht verwendet.

  1. Platzieren Sie 10 Embryonen und extraembryonale Flüssigkeit in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr, das mit einem Volumen von 250 l markiert ist (Abbildung 2A). Fügen Sie der 250-L-Fülllinie Wasser hinzu (siehe Probe mit gefärbtem Wasser in Abbildung 2B).
  2. Wiederholen Sie Schritt 2.1, um Behälter für Embryonen einzurichten, deren Kränzen entfernt wurden.
    1. Um die Chorion zu entfernen, legen Sie die Embryonen in ihre Krähen in eine 100 mm Petrischale mit 2 mg/ml Protease-Cocktail in Embryomedien bei Raumtemperatur (RT) für 10 min. Alle paar Minuten die Embryonen sanft wirbeln, um den Chor ion zu brechen.
    2. Sobald alle Embryonen frei von ihrem Chorion sind, entfernen Sie die dechorionierten Embryonen aus protease Cocktail/Embryo-Medien und legen Sie sie in eine neue 100 mm Petrischale mit frischen Embryomedien, um die Embryonen zu waschen. Wiederholen Sie diesen Waschschritt 1 weitere Zeit (für insgesamt 2 Waschungen). Übertragen Sie die Embryonen in eine frische 100 mm Petrischale.
  3. Mit der kleinsten Spitze möglich und ohne die Embryonen zu beschädigen, entfernen Sie sorgfältig alle Flüssigkeit aus der Umgebung der Embryonen mit einem p200 Mikropipettor (Abbildung 2C) und wiegen Sie das Wasser mit einer Skala mit <0,1 mg Präzision. Um das Volumen der Probe von 10 Embryonen zu bestimmen, subtrahieren Sie das Gewicht/Volumen des Wassers (1 ml Wasser = 1 g Wasser.) entfernt von 250 l. Um das Volumen eines einzelnen Embryos zu bestimmen, teilen Sie die Differenz zwischen 250 l und dem Gewicht des entfernten Wassers durch 10.

Equation 1

Equation 2

3. Behandlung von Embryonen mit Ethanol

  1. Sammeln Sie Embryonen aus Paarungstanks und legen Sie sie in eine Standard 100 mm Petrischale. Zählen Sie nicht mehr als 100 Embryonen pro einzelne Petrischale aus und brüten Sie bei 28,5 °C.
    HINWEIS: Wenn die Chorion entfernt werden soll (Schritt 2.2), muss sie vor dem Hinzufügen von Ethanol entfernt werden.
  2. Bei 6 hpf, addieren Sie bis zu 100 Embryonen zu einer neuen Standard 100 mm Petrischale entweder mit Embryo-Medien oder Embryo-Medien + 1% Ethanol (v/v). Bedecken Sie, aber versiegeln Sie NICHT die Petrischale. Stellen Sie die Embryonen in einen Temperatur-Inkubator mit niedriger Temperatur einstellung bei 28,5 °C für 18 h, oder bis die Embryonen den Entwicklungszeitpunkt von 24 hpf erreichen.

4. Vorbereitung des Arbeitsablaufs vor der Verarbeitung der Embryonen für die Kopfraumgaschromatographie

  1. Machen Sie eine Lösung von 5 M NaCl in Wasser (450 l wird pro Probenröhrchen benötigt), um alle Proteine zu denaturieren und den Ethanolstoffwechsel zu verhindern. Herstellung des Protease-Cocktails (Table of Materials) in einer Konzentration von 2 mg/ml in Embryomedien.
  2. Etikettieren Sie ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr und eine 2 ml Gaschromatographendurchstechs für jede Probe. Etikettieren Sie zusätzliche 2 ml Gaschromatographen-Fläschchen für die unten beschriebenen Ethanol-Standards sowie Luft, Wasser und die 5 M NaCl/Protease-Cocktailrohlinge.
  3. Richten Sie drei p200 Mikropipettors zwei auf 50 l und der dritte auf 200 l; ein p1000-Mikropipettor auf 450 l und ein p2-Mikropipettor auf 2 L. Für die Glaspipetten, die verwendet werden, um Embryonen von den Petrischalen auf die 1,5 ml Mikrozentrifugenrohre zu übertragen, passieren Sie schnell die Pipettenspitze durch eine Flamme, um die Ränder zu glätten, um die Embryonen nicht zu beschädigen, wenn sie in die Pipette gezogen werden.

5. Verarbeitung von Embryonen für die Kopfraumgaschromatographie

HINWEIS: Sowohl Embryonen in ihren Krämungen als auch solche, die zuvor aus ihren Kränzen entfernt wurden, werden für die Konsistenz bei der Berechnung von Verdünnungsfaktoren gleich behandelt.

  1. Mit den beiden auf 50 l eingestellten mikropipetten p200 ziehen Sie 50 l der Protease-Cocktail-Lösung in einen und ziehen Sie 50 l Wasser in den zweiten.
  2. Mit der Glaspipette und dem Mikropipettor schnell 10 Embryonen (ab Schritt 3.2) in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr legen und die Kappe schließen (wie in Abbildung 2Abeschrieben). Wiederholen Sie dies für alle zu prüfenden, zu kontrollierenden und mit Ethanol behandelten Embryonen.
  3. Mit dem auf 200 l eingestellten Mikropipettor p200 öffnen Sie schnell die Kappe und entfernen Sie alle verbleibenden Embryomedien (wie in Abbildung 2Cbeschrieben). Legen Sie die Pipette mit 50 l Wasser schnell in das Rohr und schnell, aber schonend (um die Embryonen nicht zu beschädigen) hinzufügen, dann entfernen Sie das Wasser. Fügen Sie schnell 50 l der Protease-Cocktail-Lösung aus dem wartenden Pipettor hinzu und schließen Sie die Rohrkappe (Abbildung 2D).
    HINWEIS: Führen Sie diesen Prozess jeweils ein Beispiel durch.
  4. Lassen Sie die Probe 10 min bei RT sitzen, damit der Protease-Cocktail die Chorion abbauen kann. Dann schnell 450 l von 5 M NaCl hinzufügen und die Rohrkappe schließen (Abbildung 2E). Wirbel n. Chr. die Proben für 10 min. Um den Prozess zu beschleunigen, richten Sie den Mischer so ein, dass mehrere Samples gleichzeitig ausgewirbelt werden.
    HINWEIS: Fügen Sie eine kleine Menge (ca. 100 l) eines Kieselsäure-Perlengemisches (2 Größen, 0,5 mm und 1 mm Perle) zu einem Beliebigen Rohr mit Embryonen hinzu, die älter als 24 hpf sind. Bei älteren Embryonen bleibt der Notochord intakt, unabhängig davon, wie lange sie homogenisiert sind.
  5. Nach der Homogenisierung für 10 min, schnell entfernen 2 l homogenisierten Embryo Überstand und fügen Sie zu einem Gaschromatograph durchstechfum. Versiegeln Sie die Durchstechflasche schnell mit der Polytetrafluorethylenkappe.

6. Vorbereitung von Medien- und Ethanolstandards

  1. Um die Medienstandards vorzubereiten, verdünnen Sie die Medien um den Faktor 10 mit einer 5 M NaCl/Protease-Cocktaillösung. Fügen Sie 2 l jeder Probe in eine Gaschromatographen-Durchstechflasche und versiegeln Sie sie mit einer Polytetrafluorethylenkappe.
  2. Zur Herstellung der Ethanolstandards eine serielle Verdünnung von 100% Ethanol in 5 M NaCl/Protease-Cocktaillösung in folgenden Konzentrationen zu erstellen: 0,3125, 0,625, 1,25, 2,5, 5, 10, 20 und 40 mM. Fügen Sie 2 l jedes Standards zu einer Gaschromatographen-Durchstechflasche hinzu und versiegeln Sie sie mit einer Polytetrafluorethylenkappe.

7. Vorbereitung des Kopfraum-Gaschromatographen

HINWEIS: Dieses Setup und Protokoll müssen möglicherweise je nach verwendetem Gaschromatographgeändert werden. Die Kopfraumgaschromatographie wird zur Quantifizierung des Ethanolgehalts und nicht zur Trennung verwendet.

  1. Stellen Sie die Heizung für den Autosampler auf 58 °C ein und schalten Sie sie ein. Lassen Sie die Heizung 58 °C erreichen und schalten Sie die Luft- und Wasserstoffgasleitungen ein, die den Gaschromatographen einspeisen (für die Flammenionisierung zur Quantifizierung des Ethanols).
    HINWEIS: Der psi sollte so eingestellt sein, dass der Chromatograph gemäß den Spezifikationen des Herstellers ordnungsgemäß betrieben wird. Stellen Sie sicher, dass die Heliumlinie eingeschaltet ist und auf den richtigen psi eingestellt ist.
  2. Stellen Sie für das Septum sicher, dass die Anzahl der injizierten Proben nicht >100 ist. Stellen Sie bei der Injektionsfaser sicher, dass die Anzahl der injizierten Proben nicht >500 beträgt.
    HINWEIS: Wenn eine der beiden Injektionen über steigt, müssen sie vor dem Ausführen der Testproben geändert werden.
  3. Schalten Sie die Analysesoftware ein, und stellen Sie sicher, dass die Arbeitsstation ordnungsgemäß eingerichtet ist. Speichern Sie alle Daten gemäß labor-/abteilungsstandards. Erstellen Sie eine neue Beispielliste für die auszuführenden Beispiele.
  4. Initiieren Sie die Startmethode, und warten Sie, bis sich der Flammenionisationsdetektor stabilisiert hat, bevor die Proben ausgeführt werden. Sobald stabil, führen Sie die Software-Startmethode aus, um die Faser zu reinigen.

8. Probenmessungen mittels Kopfraumgaschromatographie

  1. Sobald die Startmethode abgeschlossen ist, erstellen Sie 1 neue Zeile pro Beispiel in der Beispielliste. Aus dem Methoden-Menü in der Analyse-Software, last 436 Current spme Ethanol 2013 3min absorbieren 2_5min rg laufen. METH für jede Probe in der Stichprobenliste.
    1. Füllen Sie die Probenliste aus, beginnend mit der Luft, Wasser, 5 M NaCl/Protease Cocktail-Rohlinge. Geben Sie dann die Standards in der Reihenfolge von 0,3125 bis 40 mM ein. Folgen Sie den Standards mit einer zweiten Runde luft-, wasser- und 5 M NaCl/Protease-Cocktailrohlinge.
    2. Geben Sie alle zu testenden homogenisierten Embryo-Überstandproben ein, von der niedrigsten bis zur höchsten vorhergesagten Ethanolkonzentration. Zum Ende eine dritte und letzte Runde der Luft, des Wassers und der 5 M NaCl/Protease-Cocktailrohlinge.
  2. Fügen Sie die Gaschromatographen-Fläschchen in der Reihenfolge, in der die Proben eingegeben wurden, zum Autosampler hinzu. Lassen Sie Proben für 10-15 min erwärmen. Starten Sie die Probeläuft in der Software.
  3. Nachdem alle Samples und die letzten Leerzeichen ausgeführt wurden, aktivieren Sie die Shutdown-Methode in der Software, indem Sie ein endgültiges Beispiel in der Beispielliste hinzufügen und den Standby-Vorgang ausführen. METH. Sichern Sie alle Daten, die während der Beispielläufe erfasst wurden. Schalten Sie das Gerät in der folgenden Reihenfolge aus: Autosampler-Heizung, Wasserstofftank und erst nach erreichen die Chromatographentemperatur 30 °C, den Lufttank. Lassen Sie den Heliumtank an, um die Wachssäule zu erhalten.

9. Proben-Ethanol-Spitzenintegration und Probenkonzentrationsanalyse

HINWEIS: Alle Werte ab 9.3 wurden in einer Excel-Datei berechnet, die alle Gleichungen vorgefüllt haben.

  1. Sobald die Herunterfahrmethode abgeschlossen ist, klicken Sie auf Chromatogramm öffnen. Öffnen Sie den Ordner mit den Ergebnissen. Samples werden automatisch in dieses Programm integriert.
  2. Stellen Sie in den Ergebnissen sicher, dass die richtigen Spitzen integriert wurden (Ethanolspitzen zwischen 2 und 2,5). Sobald alle Proben bestätigt wurden, drucken oder exportieren Sie die Ergebnisse.
  3. Zeichnen Sie die Spitzenhöhe der Ethanolstandards auf einem Diagramm. Berechnen Sie die Steigungs-, Y-Abfang- undR2-Werte für die Ethanol-Standards (R2 sollte >0,99) sein.
    HINWEIS: Diese Werte werden verwendet, um die Ethanolkonzentration aus der Probenspitzenhöhe zu bestimmen.
  4. Subtrahieren Sie für jede Probe die Spitzenhöhe der Probe vom Y-Abfang der Ethanolstandards. Dividieren Sie diesen Wert durch die Steigung der Ethanolstandards, um den Ethanolwert für jede Probe in den GC-Fläschchen zu erhalten.

Equation 3

  1. Um die Ethanolkonzentration in den Embryonen zu berechnen, berechnen Sie zunächst den Verdünnungsfaktor für jede Probe. Nehmen Sie die in Schritt 2.3 dieses Protokolls berechnete Volumenmessung und dividieren Sie sie durch die Volumenmessung plus 500 l. Dies entspricht der 5 M NaCl/Protease-Cocktaillösung, die jeder Probe während der Embryoverarbeitung zugesetzt wird (Schritte 5.3 und 5.4).

Equation 4

  1. Multiplizieren Sie diesen Probenverdünnungsfaktor mit dem Ethanolwert der Probe für jede Probe. Die Ergebnisse werden in mM-Konzentration sein. Berechnen Sie Medienreferenzproben, indem Sie den Ethanolwert des Mediums mit dem Verdünnungsfaktor 10 multiplizieren.

Equation 5

Equation 6

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Representative Results

Der Ethanolgehalt im Blut kann bei frühen embryonalen Zebrafischen nicht bestimmt werden, da es an einem voll ausgebildeten Kreislaufsystem fehlt. Um die Ethanolkonzentration in den Zebrafischembryonen zu bestimmen, werden die Ethanolwerte direkt aus homogenisiertem embryonalem Gewebe gemessen. Um die embryonalen Ethanolkonzentrationen richtig messen zu können, muss das embryonale Volumen berücksichtigt werden. Der Embryo (Dotter befestigt) sitzt in der Chorion (Eierschale) umgeben von extraembryonaler Flüssigkeit (Abbildung 1). Jedes Volumenmaß des Embryos muss zum Zeitpunkt der Exposition an Embryonen vorgenommen werden, da sich das embryonale Volumen im Laufe der Entwicklungszeit ändert, wenn der Embryo an Größe zunimmt. Darüber hinaus muss die Verarbeitung des Embryos sowie das embryonale Volumen berücksichtigt werden, da beide Elemente Verdünnungsfaktoren erzeugen, die zur Berechnung des embryonalen Ethanolgehalts verwendet werden.

Da der Embryo keine perfekte Kugel ist, vor allem nach 10 hpf, wurde Wasserverschiebung verwendet, um das embryonale Volumen zu beurteilen. In dieser Studie wurden Embryonen mit 24 hpf verwendet. Das Volumen der Embryonen sowohl in ihrem Chor ion als auch in den aus ihrem Chorion entfernten Embryonen wurde gemessen. Diese Volumina betrugen 1,97 (ca. 0,4 SD) für den Embryo mit extraembryonaler Flüssigkeit und 1,1 (ca. 0,22 SD) l für den Embryo allein(Tabelle 1). Dieser Unterschied zwischen dem Embryo mit extraembryonaler Flüssigkeit und dem Embryo allein ist das Volumen der extraembryonalen Flüssigkeit, die den Embryo innerhalb des Chorions umgibt (Abbildung 1). Dieser Unterschied ist entscheidend für die Bestimmung der Ethanolkonzentration des Embryos allein in den Proben. Aus der Analyse machte der Embryo 56% des Gesamtvolumens des Embryos mit extraembryonaler Flüssigkeit im Chorion aus (Tabelle 1). Mit dem Wuchs des Embryos nahm das embryonale Volumen im Laufe der Zeit zu, was zu einer Abnahme des Volumens der extraembryonalen Flüssigkeit25führte. Bei der Messung der Ethanolkonzentrationen von Embryonen, die sich noch in ihrem Chorion betätigt, muss der Wassergehalt sowohl im Embryo als auch in der extraembryonalen Flüssigkeit berücksichtigt werden.

Zuvor veröffentlichte Arbeiten haben gezeigt, dass der Wasseranteil im Embryo allein 73,6%29beträgt. Dieses Ergebnis wurde mit einer Kombination aus Volumenmessungen, Elektronenspinresonanzspektroskopie und Magnetresonanzmikroskopie erzielt. Um dieses Ergebnis zu bestätigen, wurden Embryonen vor und nach dem Backen bei 70 °C gewogen, wie zuvorbeschrieben 25. Dieser Prozess entfernt das gesamte Wasser aus dem Embryo. Die Gewichtsänderung stellt die Wassermenge im Embryo dar. Aus dieser Analyse wurde ein 24-hpf-Embryo mit 72 % Wasser und ein 48-hpf-Embryo mit 76 % enthalten. Beide Werte ähneln extrem dem zuvor berechneten embryonalen Wasservolumen von 73,6%29. Dies deutet darauf hin, dass sich das Wasservolumen des Embryos im Laufe der frühen Entwicklung kaum verändert.

Basierend auf der veröffentlichten Arbeit, die mehrere Ansätze zur Berechnung des Wasservolumens im Embryo verwendete, wurden 73,6 % als embryonaler Wassergehalt für alle vorgestellten Analysen verwendet. Dies führte zu Wasser, das 0,82 l des embryonalen Volumens von 1,1 l(Tabelle 1) umfasste. Daraus wurde das Volumen der extraembryonalen Flüssigkeit mit 0,86 l berechnet. Vom gesamten Wasservolumen des Embryos mit extraembryonaler Flüssigkeit sind 49 % im Embryo und 51 % in der extraembryonalen Flüssigkeit enthalten (Tabelle 1).

Für die Gaschromatographie-Analyse wurden nur noch 24 hpf-Embryonen verwendet (Abbildung 1). In diesem Ethanolschema wurden Embryonen mit einer Ethanol-Medienkonzentration von 1% (171 mM) von 6–24 hpf behandelt, wobei je nach experimentellem Design unterschiedliche Ethanolkonzentrationen und Belichtungszeitfenster verwendet werden können. Es wurden zwei Gruppen von 15 Proben (10 Embryonen pro Probe) und die Medien, mit denen sie über 2 verschiedene Versuchstage behandelt wurden (Tabelle 2), analysiert. Die Medienebenen können von Experiment zu Experiment variieren. Um dies zu berücksichtigen, wurden die Ethanolwerte der Medien 5x pro Versuchsgruppe gemessen. In dieser Analyse betrugder Medienpegel 143,6 mM für Gruppe 1 und 133,6 mM für Gruppe 2. Diese Werte unterscheiden sich bei einem ungepaarten t-Test signifikant (p = 0,0002). Die Embryonen mit extraembryonaler Flüssigkeit betrugen für die Gruppen 1 bzw. 2 durchschnittlich 63,5 mM und 53,1 (ca. 12,6 SD) mM. Die Konzentration unterschied sich jedoch nicht signifikant zwischen den beiden Gruppen von Embryonen mit extraembryonaler Flüssigkeit (ungepaarter t-Test, p = 0,07). Unbehandelte Kontrollembryonen wurden bei 0 mM gemessen. Aufgrund der unterschiedlichen Medienwerte wurde für jede Probe ein Verhältnis der embryonalen Ethanolkonzentration/Medienkonzentration von Ethanol berechnet. Gruppe 1 hatte 44 % des Ethanolgehalts der Medien, während Gruppe 2 40 % des Ethanolgehalts der Medien aufwies (Abbildung 3 und Tabelle 2).

Figure 1
Abbildung 1: Ein Bild eines Embryos bei 24 h Nachfertilisation (hpf) innerhalb der Chorion. Der Embryo und das Eigelb sind von der extraembryonalen Flüssigkeit umgeben, die sich alle im Chorion befinden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Protokoll zur Messung des embryonalen Volumens und zur Verarbeitung der Embryonen zur Analyse. (A) Zehn 24-hpf-Embryonen werden in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr übertragen, das mit einem Volumen von 250 l markiert ist. (B) Das Mikrozentrifugenrohr mit mit Wasser gefüllten Embryonen (Wasser ist gefärbt, so dass es leichter an der 250-L-Marke zu sehen ist). (C) Das gesamte Wasser wird aus dem Rohr entfernt und gewogen. (D) Zehn Embryonen werden in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr übertragen. Das Wasser wurde wie in (C) entfernt und durch 50 L Protease-Cocktail ersetzt. (E) Nach 10 min wurde dem Rohr 450 l von 5 M NaCl von (D )zugesetzt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Box- und Schnurrbartdiagramm des Verhältnisses der Ethanolkonzentration von Proben zu Medien. Die Ethanolkonzentration für jede Gruppe wurde durch den Durchschnitt der Medienproben dieser Gruppe dividiert. Gruppe 1 enthielt 44 % der Medienebenen, während Gruppe 2 40 % enthielt. In beiden Gruppen n = 15; 10 Embryonen pro Probe. Gruppen wurden mit einer einwegigen ANOVA mit einer Post-hoc-Analyse von Tukey (****p < 0,0001) verglichen. Die Schnurrhaare stellen ein Minimum bis zum Maximum dar. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Embryo und Embryo + Extraembryon-Wasservolumen (L)
Wassera
Gesamtvolumenb % des Gesamtvolumens (V) Embryonales Volumen (W) Extraembryonales Volumen (X) % Wasser im Embryo (Y) % Wasser in Extraembryonal (Z)
Embryo + Extraembryonal (EE)c 1,97 x 0,4
Embryo 24 hpf (E)c 1,11 x 0,22 56% 0.82 0.86 49% 51%
Berechnungen
V Embryo % des Gesamtvolumens = Gesamtvolumen von E n Gesamtvolumen eE
W Embryonales Wasservolumen = V bei 73,6%
X Extraembryonales Wasservolumen = W – Gesamtvolumen von EE
Y% Wasser im Embryo = (W + X)/W bei 100
Z% Wasser in Extraembryonnik = 100 – Y
a Das embryonale Wasservolumen wurde aus Hagedorn et al.29 berechnet.
b Die Werte werden als Standardabweichung (SD) angezeigt.
cn = 13; 10 Embryonen pro Probe

Tabelle 1: Berechnung des Wasservolumens für die Embryonen mit extraembryonaler Flüssigkeit. Das Volumen wurde aus 13 Proben (10 Embryonen pro Probe) von 24 hpf-Embryonen mit extraembryonaler Flüssigkeit berechnet, die sich noch im Chorion befinden, und Embryonen, die aus ihrem Chorion entfernt wurden. Die Werte werden als Mittelwert sD gemeldet.

Ethanol Konzentration von Embryonen und Medien (mM)
Gruppe 1 Gruppe 2 Kombiniert
Medien (M)b 143,6 € 2,3 133,6 € 2,7 138,6 € 5,8
Embryo + Extraembryonal (EE)c 63,5 x 17,1 53,1 x 12,6 58,3 € 15,7
Verhältnis von Ethanol - Embryo zu Medien (1) 0,44 € 0,12 0,40 x 0,09 0,42 € 0,11
Berechnungen
1 Verhältnis von Ethanol = EE n M
a Die Werte werden als SD-Wert gemeldet.
bn = 5
cn = 15; 10 Embryonen pro Probe
d Werte sind der Durchschnitt der Gruppen 1 und 2.

Tabelle 2: Berechnung der Ethanolkonzentration in Embryonen mit extraembryonaler Flüssigkeit und Medien (mM). Medienproben waren direkte Maßnahmen der Medien (n = 5 pro Gruppe). Die embryonale Ethanolkonzentration wurde aus 15 Proben (10 Embryonen pro Probe) aus 24 hpf-Embryonen mit extraembryonaler Flüssigkeit berechnet. Das Verhältnis der Ethanolkonzentrationen der Embryonen mit extraembryonaler Flüssigkeit zu den Medien wurde berechnet. Die Werte werden als Mittelwert sD gemeldet.

Berechnung von Ethanol im Embryoa,b
Embryo (Y) Verhältnis zu Medien (Z)
32,7 x 8,8 mM 0,24 € 0,06
Berechnungen
Y Embryonales Ethanol = 58,3 mM (Tabelle 2) bei 56 % (Tabelle 1)
Z Verhältnis von Ethanol = Y bei 138,6 mM (Tabelle 2)
a Werte sind der Durchschnitt der Gruppen 1 und 2.
b Die Werte werden als SD-Wert gemeldet.

Tabelle 3: Berechnung von Ethanol im Embryo. Die embryonale Ethanolkonzentration wurde als 56 % der gesamten Ethanolkonzentration des Embryos mit extraembryonaler Flüssigkeit berechnet. Dies wurde dann als Verhältnis von Embryo zu Medien berichtet. Die Werte werden als Mittelwert sD gemeldet.

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Discussion

Als Entwicklungsmodellsystem sind Zebrafische ideal geeignet, um die Auswirkungen von Umweltfaktoren auf die Entwicklung zu untersuchen. Sie produzieren eine große Anzahl von extern befruchteten Embryonen, was präzise Timing- und Dosierungsparadigmen in Ethanolstudien ermöglicht. Zusammen mit den Live-Bildgebungsfunktionen und der genetischen und Entwicklungserhaltung mit Menschen machen Zebrafische zu einem leistungsfähigen Modellsystem für teratologische Studien. Described ist ein Protokoll zur Messung embryonaler Ethanolkonzentrationen bei der Entwicklung von Zebrafischembryonen mittels Kopfraumgaschromatographie.

Die Bestimmung der embryonalen Ethanolkonzentration ist entscheidend für das Verständnis der Auswirkungen von Ethanol auf den sich entwickelnden Embryo. In Nagetiermodellen korrelieren die Ethanolkonzentrationen im Blut mit Gewebekonzentrationen26. Es ist jedoch nicht möglich, den Ethanolspiegel im Blut in der frühen embryonalen Entwicklung bei einem Zebrafisch zu bewerten. Kopfraumgaschromatographie wurde verwendet, um Ethanolspiegel in verschiedenen experimentellen Paradigmen zu messen, einschließlich Zebrafisch25,30,31,32,33,34,35. Dieses Protokoll kann jedoch zur Messung vieler verschiedener Umweltfaktoren verwendet werden, auch wenn die Volatilität dieser verschiedenen Faktoren hoch genug sein muss, um quantitativ zu messen, und eine Gaschromatographensäule auf der Grundlage der Polarität der betreffenden Verbindungen ausgewählt werden muss. Darüber hinaus eignen sich Zebrafische am besten, um die Auswirkungen wasserlöslicher Faktoren zu untersuchen, da die Exposition gegenüber hydrophoben Faktoren bei Fischen extrem schwierig zu analysieren ist.

Dieses Protokoll ermöglicht es forschern, die Ethanolkonzentrationen in Zebrafischembryonen direkt zu bewerten. Es müssen jedoch mehrere Faktoren berücksichtigt werden, um genaue Messungen der embryonalen Ethanolkonzentrationen zu gewährleisten. Da Ethanolgehalte in insgesamt embryonalen Geweben gemessen wurden, musste das embryonale Volumen berücksichtigt werden. Nach 10 hpf beginnt der Embryo die Soogenese (dahere Bildung) und ist keine Kugel mehr (Abbildung 1). Zur Beurteilung des embryonalen Volumens wurde die Wasserverschiebung an 10 gepoolten Embryonen pro Probe verwendet. Jede Probe bestand aus zwei Gründen aus 10 Embryonen: erstens, um Fehler durch pipetting kleine Volumina zu reduzieren, und zweitens, um kleine Schwankungen des Embryovolumens zu durchschnittlich. Bei der Messung des embryonalen Volumens ist es wichtig, die Präzision des Pipetierens und Wiegens zu berücksichtigen. Selbst die Verwendung von 10 Embryonen pro Probe ist an der unteren Grenze der Genauigkeit sowohl für die Pipetten als auch für die Skala, die zum Wiegen der Embryonen verwendet wird. Mit der verfügbaren Ausrüstung hätte die Verwendung von weniger als 10 Embryonen die Analysen beeinflusst. Dies hindert die Forscher nicht daran, weniger Embryonen pro Probe zu verwenden, solange die Präzision der Ausrüstung berücksichtigt wird.

Das embryonale Volumen ist ein Faktor, der die Probenanalyse beeinflusst. Ein zweiter Schlüsselfaktor ist die embryonale Verarbeitungsgeschwindigkeit, da Ethanol flüchtig ist. Darüber hinaus gleicht Ethanol in mehreren Tierstudien schnellaus 25,36,37. Unser Waschprotokoll wurde entwickelt, um schnell jegliches Ethanol zu entfernen, das an der Außenfläche des Chorions befestigt ist. In dieser Studie hatte dieses Waschprotokoll keinen Einfluss auf die embryonalen Ethanolspiegel, obwohl längere oder mehrfache Waschungen die embryonalen Ethanolkonzentrationen25,38beeinflussen könnten. Ein dritter Faktor, der zu berücksichtigen ist, ist jedoch die Verdünnung des embryonalen Volumens während der Verarbeitung. Dieses Protokoll verwendet einen Protease-Cocktail, um die Chorion zu degradieren, sowie 5 M NaCl, um alle Proteine, einschließlich alkoholverarbeitender Enzyme, zu denaturieren.

Schließlich wurde eine Reihe von Analyse- und Berichterstattungsmethoden in einer Vielzahl von Zebrafischstudien beschrieben. Aufgrund der Variation innerhalb verschiedener Proben einer Studie oder des Vergleichs verschiedener Studien ist eine ordnungsgemäße Berichterstattung über die Ethanolkonzentration kritisch25,38. Methoden, die indirekte (in der Regel enzymatische Maßnahmen) verwenden, basieren auf der Analyse eines sekundären Metaboliten. In diesem Fall kann die Rate der enzymatischen Aktivität variieren und eine genaue Analyse der Ethanolkonzentration behindern. Diese Methode misst direkt den Ethanolgehalt, und Ethanolkonzentrationen werden als Verhältnis von Embryo-Medienkonzentrationen berichtet. Unsere Ergebnisse stehen im Einklang mit einem wachsenden Konsens eines 24-hpf-Embryos, der 30 % der Medienkonzentrationen enthält (Tabelle 3)25,38,39,40. Überraschenderweise ist diese 30% embryonale Ethanolkonzentration unabhängig von der Medienkonzentration, und es ist nicht gut verstanden, was dieses Gleichgewicht schafft25,38. Embryonen, die älter als 24 hpf sind, zeigen eine Abnahme der Ethanolkonzentrationen, wobei 48 hpf-Embryonen fast die Hälfte des Ethanolgehalts eines 24-hpf-Embryos25enthalten. Unsere Ergebnisse bestimmen jedoch nicht das Ethanol-Wasser-Gleichgewicht. Angesichts der Geschwindigkeit, mit der Ethanol gleicht, sowie der Volatilität von Ethanol ist es unglaublich schwierig, Wasservolumenänderungen im Embryo selbst aufgrund der Ethanolexposition zu beurteilen. Der Versuch, das Volumen einer mit Ethanol behandelten Embryoprobe mit Wasserverschiebung zu messen, führt während der Messung zum Verlust von Ethanol aus dem Embryo. Mit präziseren Mikroskopie- und Spektroskopieverfahren als die oben beschriebenen kann es möglich sein, das Ethanol-Wasser-Gleichgewicht in einem Embryo zu bestimmen, indem beide gleichzeitig direkt gemessen werden.

Insgesamt ist das hier beschriebene Protokoll ein leistungsfähiges Instrument zur Beurteilung der embryonalen Ethanolkonzentrationen bei der Entwicklung von Zebrafischembryonen. Diese Informationen sind entscheidend für die Standardisierung von FASD-Studien mit Zebrafischen. Die Fähigkeit, Ethanol-Behandlungsparadigmen präzise zu steuern und embryonale Ethanolkonzentrationen direkt zu quantifizieren, stärkt die Funktionalität des Zebrafischmodells für menschliche FASD-Studien. Letztendlich wird diese Arbeit unser Verständnis von FASD erheblich verbessern.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Die in diesem Artikel vorgestellte Forschung wurde durch frühere Stipendien der National Institutes of Health/National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIH/NIDCR) R01DE020884 an J.K.E. unterstützt. und National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism (NIH/NIAAA) F32AA021320 to C.B.L. and by the current grant from National Institutes of Health/National Institute on Alcohol Abuse (NIH/NIAAA) R00AA023560 to C.B.L. Wir danken Rueben Gonzales für die Bereitstellung und Unterstützung bei der Analyse von Gaschromatographen. Wir danken Tiahna Ontiveros und Dr. Gina Nobles beim Schreiben.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Air Provided by contract to the university
Analytical Balance VWR 10204-962
AutoSampler, CP-8400 Varian Gas Chromatograph Autosampler
Calcium Chloride VWR 97062-590
Ethanol Decon Labs 2701
Gas chromatograph vial with polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap 2 mL Agilent 8010-0198 Can reuse the vials after cleaning, but not the caps/septa
Gas Chromatograph, CP-3800 Varian
Helium Provided by contract to the university
HP Innowax capillary column Agilent 19095N-123I 30 m x 0.53 mm x 1.0 μm film thick
Hyrdogen Provided by contract to the university
Magnesium Sulfate (Heptahydrate) Fisher Scientific M63-500
Microcentrifuge tube 1.5 mL Fisher Scientific 2682002
Micropipette tips 10 μL Fisher Scientific 13611106
Micropipette tips 1000 μL Fisher Scientific 13611127
Micropipette tips 200 μL Fisher Scientific 13611112
Petri dishes 100 mm Fisher Scientific FB012924
Pipetman L p1000L Micropipette Gilson FA10006M
Pipetman L p200L Micropipette Gilson FA10005M
Pipetman L p2L Micropipette Gilson FA10001M
Polytetrafluoroethylene/silicone septum and plastic cap Agilent 5190-7021 Replacement caps/septa for gas chromatograph vials
Potassium Chloride Fisher Scientific P217-500
Potassium Phosphate (Dibasic) VWR BDH9266-500G
Pronase VWR 97062-916
Silica Beads .5 mm Biospec Products 11079105z
Silica Beads 1.0 mm Biospec Products 11079110z
Sodium Bicarbonate VWR BDH9280-500G
Sodium Chloride Fisher Scientific S271-500
Sodium Phosphate (Dibasic) Fisher Scientific S374-500
Solid-phase microextraction fiber assembly Carboxen/Polydimethylsiloxane Millipore Sigma 57343-U Replacement fibers
Star Chromatography Workstation Varian Chromatography software
Thermogreen Low Bleed (LB-2) Septa Millipore Sigma 23154 Replacement inlet septa

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References

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