MeCP2 प्रोटीन वेरिएंट के लिए एक इलेक्ट्रोकेमिल्यूमिनेसेंस-आधारित परख

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Biochemistry

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Summary

इलेक्ट्रोकेमिल्यूमिनेसेंस इम्यूनोसे (ईसीलिया) एंडोजेनस और एक्सोजेनसरूप से लागू मेसीपी2 प्रोटीन वेरिएंट का मात्रात्मक पता लगाने के लिए एक उपन्यास दृष्टिकोण है, जो एक विस्तृत कार्य श्रृंखला में कम अंतर और अंतर-परख त्रुटि के साथ अत्यधिक मात्रात्मक, सटीक और प्रजनन योग्य माप पैदा करता है। यहां, 96-अच्छी तरह से प्रारूप में MeCP2-ECLIA के लिए प्रोटोकॉल वर्णित है।

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Steinkellner, H., Beribisky, A. V., Mausberg, P., Christodoulou, J., Scheiber-Mojdehkar, B., Huber, A., Sarne, V., Laccone, F. An Electrochemiluminescence-Based Assay for MeCP2 Protein Variants. J. Vis. Exp. (159), e61054, doi:10.3791/61054 (2020).

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Abstract

ईसीलिया एक बहुमुखी विधि है जो 96-अच्छी तरह से प्रारूप में एंडोजेनस और पुनः संयोजन प्रोटीन मात्रा की मात्रा निर्धारित करने में सक्षम है। ईसीएए दक्षता प्रदर्शित करने के लिए, इस परख का उपयोग माउस मस्तिष्क ऊतक में MeCP2 के आंतरिक स्तर और मानव डर्मल फाइब्रोब्लास्ट में TAT-MeCP2 के तेज का विश्लेषण करने के लिए किया गया था। MeCP2-ECLIA कम अंतर और अंतर परख त्रुटि के साथ अत्यधिक सटीक और प्रजनन माप पैदा करता है । सारांश में, हमने MeCP2 प्रोटीन वेरिएंट के मूल्यांकन के लिए एक मात्रात्मक विधि विकसित की है जिसका उपयोग उच्च-थ्रूपुट स्क्रीन में किया जा सकता है।

Introduction

इलेक्ट्रोकेमिमिनसेंस इम्यूनोसे (ईसीलिया) एक प्रक्रिया पर आधारित है जो इलेक्ट्रोकेमिकल रूप से उत्तेजित होने पर ल्यूमिनेसेंस उत्सर्जित करने के लिए डिज़ाइन किए गए लेबल का उपयोग करती है। यह बुनियादी उद्योग और अकादमिक अनुसंधान, खाद्य उद्योग के साथ-साथ नैदानिक निदान1में जैविक एनालाइट्स का मात्रात्मक पता लगाने के लिए एक मोटे तौर पर लागू तकनीक है । आमतौर पर, कार्बन इंक इलेक्ट्रोड के साथ एक डिस्पोजेबल 96-अच्छी तरह से प्लेट का उपयोग किया जाता है। ये इलेक्ट्रोड इम्यूनोसेकेस के लिए ठोस चरण वाहक के रूप में कार्य करते हैं। एक माध्यमिक एंटीबॉडी को इलेक्ट्रोकेमिल्यूमिनेसेंट लेबल के लिए संयुग्मित किया जाता है और जब सिस्टम पर बिजली लागू होती है, तो रासायनिक लेबल का हल्का उत्सर्जन शुरू हो जाता है। एक अल्ट्रा-कम शोर चार्ज-युग्मित डिवाइस (सीसीडी) प्रकाश तीव्रता को रिकॉर्ड करता है जो सीधे एंटीजन के आनुपातिक है जो कैप्चर एंटीबॉडी से बंधे हैं जिसके परिणामस्वरूप नमूना2के लक्षित एनालाइट का परिमाणीकरण होता है। एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसोरबेंट परख (एलिसा) की तुलना में, ईसीएए को लाभप्रद माना जाता है क्योंकि यह उच्च संवेदनशीलता और प्रजनन क्षमता के साथ-साथ बेहतर स्वचालन और स्थिरता3प्रदान करता है।

यहां हमने मानव और मूत्र मूल के नमूनों में मिथाइल-सीपीजी बाध्यकारी प्रोटीन 2 (MeCP2) के स्तर के साथ-साथ नए विकसित ईसीलिया सिस्टम का उपयोग करके रिकॉम्बिनेंट प्रोटीन के विभिन्न वेरिएंट का विश्लेषण किया। MecP2 एक एक्स-लिंक्ड न्यूक्लिक एसिड-बाध्यकारी प्रोटीन है जो मिथाइलेटेड डीएनए दृश्यों के साथ बातचीत करने के लिए जाना जाता है। इस प्रोटीन को जीन अभिव्यक्ति 44,5के नियमन में फंसाया गया है . जीन में मनोहारी उत्परिवर्तन जो इस प्रोटीन को एन्कोड करता है, मुख्य अपराधी हैं जो रेट सिंड्रोम (आरटीटी) का कारण हैं, जो एक गंभीर न्यूरोडेवलपमेंटल डिसऑर्डर6है। एक और MeCP2 से संबंधित विकार, MECP2 दोहराव सिंड्रोम, भी न्यूरोलॉजिकल लक्षण है कि RTT7के उन लोगों के साथ ओवरलैप कर सकते है की ओर जाता है । विशेष रूप से, महिलाएं ज्यादातर आरटीटी से प्रभावित होती हैं जबकि पुरुष ज्यादातर MECP2 दोहराव सिंड्रोम6,,7से पीड़ित होते हैं।

ये विकार केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में क्रमशः अपर्याप्त या अतिरिक्त MeCP2 स्तरों से जुड़े होते हैं। इसलिए, आरटीटी के लिए उपचार विकल्प जिसमें सीएनएस में MeCP2 के स्तर में वृद्धि शामिल है, को MeCP27से अधिक से जुड़े हानिकारक प्रभावों से बचने की आवश्यकता होगी। इस तथ्य के कारण, ईसीपीएयू प्रणाली द्वारा प्रदान किए गए MeCP2 प्रोटीन स्तरों का अत्यधिक संवेदनशील और सटीक मात्रा, आरटीटी के साथ-साथ MECP2 दोहराव सिंड्रोम अनुसंधान की उन्नति के लिए महत्वपूर्ण है। मानव कोशिका रेखाओं और माउस ऊतक नमूनों से एंडोजेनस और एक्सोजेनस MeCP2 स्तरों के सटीक माप के साथ-साथ मानव MeCP2 आइसोफॉर्म बी (जिसे आइसोफॉर्म ई1 के रूप में भी जाना जाता है) से युक्त एक पुनर्संयोजन प्रोटीन, और एक न्यूनतम एन-टर्मिनल एचआईवी-टैट ट्रांसड्यूक्शन डोमेन (TAT-MeCP2) जो रक्त-मस्तिष्क-बाधा8,9 को पार करने की क्षमता रखताहै,इस काम में प्रस्तुत किया जाता है।

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Protocol

अनुसंधान प्रयोजनों के लिए त्वचा बायोप्सी खरीद के लिए अनुमोदन वेस्टमीड, ऑस्ट्रेलिया में बाल अस्पताल की मानव अनुसंधान नैतिकता समिति से प्राप्त किया गया था । पशु प्रयोगों के लिए सहमति ऑस्ट्रिया के संघीय विज्ञान, अनुसंधान और अर्थव्यवस्था मंत्रालय से प्राप्त की गई थी, जो स्थानीय पशु कल्याण नियमों (GZ: 66.009/0218-II/3b/2015) के अनुसार किया गया था ।

नोट: ECLIA प्रणाली के सिद्धांत चित्रा 1में चित्रित किया गया है ।

1. एंटीबॉडी चयन

  1. विभिन्न MeCP2 एंटीबॉडी की एक श्रृंखला के लिए सिग्नल-टू-शोर अनुपात का मूल्यांकन करें और प्राथमिक माउस मोनोक्लोनल मेसीपी 2 एंटीबॉडी (क्लोन मेक-168) और खरगोश पॉलीक्लोनल मेसीपी2 डिटेक्शन एंटीबॉडी (कस्टम मेड) के संयोजन के भीतर सबसे अच्छी सिग्नल ताकत और उच्चतम विशिष्टता की पहचान करें। माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए, सिस्टम-विशिष्ट एंटीबॉडी(सामग्री की तालिका) काउपयोग करें, जिसे प्रायोगिक रूप से सत्यापित भी किया गया था।
    नोट: तालिका 1 MeCP2-ECLIA विकास और उनके परीक्षण कमजोर पड़ने पर्वतमाला के दौरान सभी सत्यापित एंटीबॉडी का अवलोकन देता है।
समारोह नाम क्लोन कमजोर पड़ना
प्राथमिक माउस, विरोधी MeCP2 एमईसी-168 1:500−1:10,000
प्राथमिक माउस, विरोधी MeCP2 4B6 1:250−1:4,000
प्राथमिक माउस, विरोधी MeCP2 पुरुष-8 1:500−1:4,000
प्राथमिक माउस, विरोधी MeCP2 1B11 1:500−1:4,000
प्राथमिक खरगोश, विरोधी MeCP2 D4F3 1:500−1:4,000
द्वितीयक खरगोश, विरोधी MeCP2 पॉलीक्लोनल 1:2,000−1:20,000
द्वितीयक खरगोश, विरोधी MeCP2 पॉलीक्लोनल 1:2,000−1:20,000
डिटेक्शन सल्फो-टैग लेबल एंटी-खरगोश पॉलीक्लोनल 1:500−1:1,000

तालिका 1: एंटीबॉडी की सूची और काम करने वाले कमजोर होने का इस्तेमाल किया।

  1. वैकल्पिक रूप से, मेसीपी 2-एंटीबॉडी की प्रत्येक जोड़ी का उपयोग करें जो पारंपरिक एलिसा के साथ अच्छी तरह से काम करता है।

2. TAT-MeCP2 फ्यूजन प्रोटीन के साथ एचडीएफ का उपचार

नोट: TAT-MeCP2 को एस्चेरिचिया कोलाई में फिर से व्यक्त किया गया था और मानक क्रोमेटोग्राफिक तकनीकों का उपयोग करके शुद्ध किया गया था जैसा कि पहले8 वर्णित था और -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया गया था।

  1. प्लेट 1 x 106 मानव डर्मल फाइब्रोब्लास्ट (एचडीएफसी) कोशिकाएं 100 मिमी व्यंजनों में और 5% सीओ2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर कोशिकाओं को विकसित करें जब तक कि वे लगभग 90% कन्फ्रिलेशन तक न पहुंच जाएं।
  2. TAT-MeCP2 फ्यूजन प्रोटीन की एक शीशी निकालें। बर्फ पर गल और धीरे मिश्रण ।
  3. पतला TAT-MeCP2 एचडीएफसी कल्चर मीडिया के 50 एमएल में 500 एनएम की अंतिम एकाग्रता के लिए।
  4. 100 मिमी व्यंजनों से मीडिया निकालें और 24 घंटे तक विभिन्न इनक्यूबेशन अवधि के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 500 एनएम TAT-MeCP2 के साथ कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
  5. कोशिकाओं से TAT-MeCP2 समाधान निकालें। कोशिकाओं 2x को पूर्व-गर्म डुल्बेकको के फॉस्फेट-बफरलव (डीपीबीएस) के साथ धोएं।
  6. 37 डिग्री सेल्सियस10पर 5 मिन के लिए 0.05% ट्राइप्सिन-ईटीए समाधान के 2 मिलील के साथ कोशिकाओं का इलाज करें।
  7. ट्राइप्सिन को निष्क्रिय करने और 15 मिलील ट्यूबों में कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए एचडीएफसी कल्चर मीडिया के 6 मिलीएल जोड़ें।
  8. कमरे के तापमान पर 5 00 x ग्राम पर केंद्रीकरण द्वारा कोशिकाओं को गोली मार।
  9. अधिनेता निकालें और कोशिकाओं 2x को बर्फ-ठंडे डीपीबीएस से धोएं। बर्फ पर गोली स्टोर और नमूना तैयारी के साथ आगे बढ़ें।

3. नमूना तैयारी

  1. एचडीएफसी की मुश्किलें
    1. सुजुकी एट अल11के अनुसार साइटोप्लाज्मिक और परमाणु उपकोशिकी डिब्बों में उपकोशिकीय अंशीकरण के लिए रीप विधि का उपयोग करMeCP2 के उच्चतम प्रोटीन स्तर निर्धारित करें। प्रति प्रयोग छह से अधिक नमूनों तक अंशीकरण को सीमित करें।
  2. माउस मस्तिष्क lysates
    1. प्रत्येक हाइपोटोनिक लाइसिस रिएजेंट और एक्सट्रैक्शन बफर का 100 मीटर तैयार करें।
      1. हाइपोटॉनिक लाइसिस रिएजेंट के लिए, अच्छी तरह से 10 mM HEPES, 1.5 m मैग्नीशियम क्लोराइड और 10 mM पोटेशियम क्लोराइड मिलाएं।
      2. निष्कर्षण बफर के लिए, अच्छी तरह से 20 mM HEPES, 1.5 m मैग्नीशियम क्लोराइड, 0.42 मीटर सोडियम क्लोराइड, 0.2 मीटर EDTA, और 25% (v/v) ग्लाइसेरोल मिलाएं।
      3. दोनों बफ़र्स के पीएच को 7.9 पर समायोजित करें।
      4. दोनों बफ़र्स हौसले से 1 mM dithiothreitol (DTT) और 1x प्रोटीज अवरोधक कॉकटेल जोड़ें । उपयोग से पहले बर्फ पर ठंडा करें।
    2. कुल माउस मस्तिष्क के १०० मिलीग्राम निलंबित (तनाव: C57BL/6J, वाइल्डटाइप पुरुष और महिला और B6.129P2 (C)-Mecp2tm1.1Bird/J,hemizygous पुरुष और विषमता महिला; उम्र: 4−8 सप्ताह पुरानी) बर्फ के 1 mL में ठंडा हाइपोटॉनिक लाइसिस रिएजेंट ।
    3. मस्तिष्क को पहले से ठंडा करने वाले ड्रोम ऑल-ग्लास टिश्यू समरूपता के साथ क्रमशः समरूपता ए (ढीली, बड़ी निकासी के लिए) और बी (तंग, छोटी निकासी के लिए) के 15 स्ट्रोक से होमोजेनरेट करें।
    4. समरूप कोशिकाओं को एक साफ ट्यूब पर स्थानांतरित करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिन के लिए 10,000 x ग्राम पर अपकेंद्री रखें। अधिनेता को त्यागें (या इसे आगे के उपयोग के लिए साइटोप्लाज्मैटिक अंश के रूप में रखें)।
    5. शुरू सामग्री के प्रति 100 मिलीग्राम निष्कर्षण बफर के 140 μL में गोली को फिर से निलंबित करें। ट्यूब को प्री-कूल्ड थर्मोब्लॉक में रखें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 सीन के लिए धीरे-धीरे मिलाएं।
    6. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिन के लिए 16,000 ग्राम पर ट्यूब को सेंट्रलाइज करें। सुपरनेटेंट (यानी, परमाणु अंश) को एक नई प्री-चिल्ड ट्यूब पर स्थानांतरित करें और उपयोग तक -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: माउस मस्तिष्क और एचडीएफ से प्राप्त लाइसेट्स की प्रोटीन एकाग्रता का आकलन बीसीए प्रोटीन परख द्वारा किया जा सकता है।

4. MeCP2-ECLIA प्रोटोकॉल

  1. धुलाई समाधान की तैयारी, बफर और परख दिलूंट समाधान अवरुद्ध (दिन 1)
    1. पीबीएस समाधान में 0.05% ट्वीन 20 तैयार करने के लिए ट्वीन 20 से 1 एल के 500 माइक्रोन जोड़ें, जोरदार ढंग से मिलाएं और "वाशिंग सॉल्यूशन" के रूप में लेबल करें।
      नोट: सुनिश्चित करें कि केवल हौसले से तैयार वाशिंग बफर का उपयोग किया जाता है।
    2. फॉस्फेट-बफर्ड लवलाइन (पीबीएस) में 3% अवरोधक ए(सामग्री की तालिका) काअवरुद्ध समाधान तैयार करें। कोमल सरगर्मी से मिलाएं, स्टरलाइज करें और अधिकतम दो सप्ताह तक उपयोग न करें, उन्हें फ्रिज में रखें।
    3. परख दिलूंट समाधान (पीबीएस में 1% अवरोधक ए) तैयार करने के लिए पीबीएस के 10 मीटर के लिए अवरुद्ध समाधान के 5 mL जोड़ें।
  2. उच्च बांध प्लेटों की कोटिंग
    1. एक 96-अच्छी तरह से बहु-सरणी एकल स्थान उच्च बांध प्लेट निकालें।
      नोट: उच्च बांध प्लेटों में अधिक बाध्यकारी क्षमता होती है और इसलिए हाइड्रोफोबिक सतहों के साथ मानक प्लेटों की तुलना में एक बड़ी गतिशील सीमा होती है।
    2. बर्फ पर मोनोक्लोनल माउस एंटी-मेसीपी2 एंटीबॉडी को पिघलाएं और पीबीएस के 4 मिलील (पीबीएस में 1:6,000 एंटीबॉडी कमजोर पड़ने) के साथ एंटीबॉडी के 0.67 माइक्रोन को मिलाएं। भंवर एंटीबॉडी समाधान अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए और "कोटिंग समाधान" के रूप में ट्यूब लेबल ।
    3. मल्टीचैनल पाइपेटर का उपयोग करके प्रत्येक कुएं के निचले कोने में ध्यान से 25 माइक्रोन समाधान वितरित करें; इसे समाधान कोटिंग विधि कहा जाता है। यह सुनिश्चित करने के लिए कि कोटिंग समाधान प्रत्येक कुएं के नीचे को कवर करता है, प्रत्येक तरफ धीरे-धीरे 96-अच्छी तरह से प्लेट पर टैप करें।
    4. एक चिपकने वाली पन्नी के साथ प्लेट को सील करें और रात भर 4 डिग्री सेल्सियस (12−16 घंटे) पर फ्रिज में प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  3. अवरुद्ध (दिन 2)
    1. फ्रिज से प्लेट निकालकर पन्नी निकाल लें।
    2. इसे अपशिष्ट टोकरी में फ्लिक करके एंटीबॉडी कोटिंग समाधान निकालें और कुओं से सभी कोटिंग समाधान को हटाने के लिए प्लेट को कागज के तौलिया पर टैप करें।
    3. प्रति अच्छी तरह से अवरुद्ध समाधान के 125 μL जोड़ें। प्लेट को फिर से सील करें और इसे ऑर्बिटल माइक्रोप्लेट शेकर पर रखें।
    4. 800 आरपीएम पर लगातार मिलाते हुए कमरे के तापमान पर 90 न्यूनतम के लिए प्लेट को इनक्यूबेट करें।
  4. मानकों और नमूनों की तैयारी
    1. इनक्यूबेशन समय के दौरान, MeCP2 और/या TAT-MeCP2 प्रोटीन मानकों और विभिन्न नमूनों को तैयार करें ।
      नोट: मानक कमजोर पड़ने के लिए उपयोग किए जाने वाले लिसिस बफर का विश्लेषण किए गए नमूनों में उपयोग किए जाने वाले समान होना चाहिए।
    2. मेपीसी2 और/या टैट-मेसीपी2 प्रोटीन स्टॉक सॉल्यूशन (250 μg/mL), माउस ब्रेन लाइसेट्स और एचडीएफसी की एक शीशी -80 डिग्री सेल्सियस से बाहर निकालें। उन्हें बर्फ पर गल।
    3. तालिका 2के अनुसार स्वच्छ ट्यूबों में मानक स्टॉक समाधान (MeCP2 और/या TAT-MeCP2) को पतला करें ।
    4. लिसिस बफर में नमूनों को पतला करें: लाइसिस बफर के प्रति 25 माइक्रोन के 1−20 माइक्रोन और लाइसिस बफर के प्रति 25 माइक्रोन के 0.25−1 माइक्रोन। ट्रिपलेट में विश्लेषण करने के लिए प्रत्येक नमूने की पर्याप्त मात्रा तैयार करें।
मानक एकाग्रता कमजोर पड़ना
मानक 1 1,800 एनजी/एमएल 1.08 μL मानक स्टॉक समाधान + 148.92 μL Lysis बफर
मानक 2 600 एनजी/एमएल 50 μL मानक 1 + 100 μL Lysis बफर
मानक 3 200 एनजी/एमएल 50 माइक्रोन मानक 2 + 100 μL Lysis बफर
मानक 4 66.67 एनजी/एमएल 50 μL मानक 3 + 100 μL Lysis बफर
मानक 5 22.22 एनजी/एमएल 50 माइक्रोन मानक 4 + 100 μL Lysis बफर
मानक 6 7.41 एनजी/एमएल 50 μL मानक 5 + 100 μL Lysis बफर
मानक 7 2.47 एनजी/एमएल 50 माइक्रोन मानक 6 + 100 μL Lysis बफर
मानक 8 0.82 एनजी/एमएल 50 माइक्रोन मानक 7 + 100 μL Lysis बफर
मानक 9 0.27 एनजी/एमएल 50 माइक्रोन मानक 8 + 100 μL Lysis बफर
मानक 10 0 एनजी/एमएल 150 μL Lysis बफर

तालिका 2: 0 से १,८०० एनजी/एमएल तक मानक श्रृंखला ।

  1. नमूने और मानक समाधान जोड़ना
    1. इसे अपशिष्ट टोकरी में फ्लिकिंग करके अवरुद्ध समाधान निकालें और कुओं से सभी अवरुद्ध समाधान को हटाने के लिए प्लेट को कागज के तौलिया पर टैप करें।
    2. वॉशिंग सॉल्यूशन जोड़कर वॉशिंग सॉल्यूशन के 150 माइक्रोन के साथ प्लेट 3x को धोएं और तुरंत हटा दें।
    3. एक ही चैनल पिपेट का उपयोग करके अच्छी तरह से नीचे के कोने में मानकों और नमूनों के 25 उल जोड़ें।
    4. थाली सील और 800 आरपीएम पर लगातार मिलाते हुए के साथ कमरे के तापमान पर 4 घंटे के लिए थाली इनक्यूबेट।
  2. अवेलेबल डिटेक्शन एंटीबॉडी
    1. बर्फ पर पॉलीक्लोनल खरगोश विरोधी MeCP2 एंटीबॉडी गल। परख दिलूंट समाधान में एंटीबॉडी 1:6,000 पतला।
    2. इसे कचरे की टोकरी में फ्लिक करके मानकों और नमूनों को हटा दें और प्लेट को पेपर तौलिया पर टैप करें।
    3. वॉशिंग सॉल्यूशन जोड़कर वॉशिंग सॉल्यूशन के 150 माइक्रोन के साथ प्लेट 3x को धोएं और तुरंत हटा दें।
    4. मल्टीचैनल पाइपटर के साथ प्रत्येक कुएं में अवेलेबल डिटेक्शन एंटीबॉडी के 25 माइक्रोन जोड़ें। प्लेट को सील करें और कमरे के तापमान पर 800 आरपीएम पर लगातार मिलाते हुए 1 घंटे के लिए इसे इनक्यूबेट करें।
  3. विशिष्ट संयुग्मित एंटीबॉडी
    1. फ्रिज से विशिष्ट माध्यमिक एंटीबॉडी(सामग्री की तालिका)निकालें और इसे बर्फ पर रखें। परख दिलूंट समाधान में एंटीबॉडी 1:666.67 पतला करें और धीरे-धीरे मिलाएं।
    2. इसे कचरे की टोकरी में फ्लिक करके मुफ्त अवेलेबल सेकेंडरी एंटीबॉडी निकालें और प्लेट को पेपर तौलिया पर टैप करें।
    3. वॉशिंग सॉल्यूशन जोड़कर वॉशिंग सॉल्यूशन के 150 माइक्रोन के साथ प्लेट 3x को धोएं और तुरंत हटा दें।
    4. मल्टीचैनल पाइपटर के साथ प्रत्येक कुएं में विशिष्ट कॉन्जुगेटेड एंटीबॉडी(सामग्री की तालिका)के 25 माइक्रोन जोड़ें। कमरे के तापमान पर 800 आरपीएम पर लगातार मिलाते हुए प्लेट को सील करें और 1 एच के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. थाली पढ़ना
    1. इसे कचरे की टोकरी में फ्लिक करके और प्लेट को पेपर तौलिया पर टैप करके मुफ्त कॉन्जुगेटेड एंटीबॉडी(सामग्री की तालिका)निकालें।
    2. प्लेट 3x को धोने के घोल के 150 माइक्रोन के साथ धोएं।
    3. प्लेट में प्रकाश पीढ़ी के लिए एक सह-प्रतिक्रियाकर्ता के रूप में ट्राइप्रोपाइलमाइन युक्त सर्फेक्टेंट के साथ 1x ट्रिस-आधारित गोल्ड रीड बफर(सामग्री की तालिका)के 150 माइक्रोन जोड़ें। रिवर्स पाइपिंग तकनीकों का उपयोग करके किसी भी हवा के बुलबुले से बचें।
    4. प्लेट को माइक्रोप्लेट डिटेक्शन प्लेटफॉर्म(सामग्री की तालिका)पर रखें और माप तुरंत शुरू करें। 96-अच्छी तरह से प्लेट अधिग्रहण के लिए सेटिंग्स का उपयोग करें।
    5. इलेक्ट्रोकेमिल्यूमिनेसेंस सिग्नल को इलेक्ट्रोकेमिल्यूमिनेसेंस डिटेक्शन सिस्टम(टेबल ऑफमैटेरियल) में बिल्ट-इन सीसीडी कैमरे द्वारा कैप्चर करें और सिग्नल काउंट रिकॉर्ड करें, जो सापेक्ष प्रकाश इकाइयों (आरबीयू) के अनुरूप हैं और सीधे प्रकाश की तीव्रता के आनुपातिक हैं।
      नोट: इलेक्ट्रोकेमिकल उत्तेजना पर, कार्बन इलेक्ट्रोड के लिए बाध्य रुथेनियम लेबल 620 एनएम पर ल्यूमिनेसेंस प्रकाश का उत्सर्जन करता है। उपकरण के साथ सॉफ्टवेयर(सामग्री की तालिका)के साथ डेटा का विश्लेषण करें ।

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Representative Results

ईसीलिया प्रणाली का सिद्धांत चित्र 1में वर्णित है। दो MeCP2 वेरिएंट के लिए मानक घटता चित्र ा 2में दिखाया गया है । सांद्रता की एक विस्तृत श्रृंखला (1−1,800 एनजी/एमएल) पर सटीक मात्रा संभव थी। चित्रा 3में, माउस मस्तिष्क और एचडीएफ से प्राप्त lysates के MeCP2 स्तरों का विश्लेषण किया गया। मस्तिष्क परमाणु में MeCP2 अभिव्यक्ति विषमता, वाइल्डटाइप और नॉकआउट चूहों से परमाणु lysates चित्रा 3Aमें तुलना की गई थी, जबकि चित्रा 3B में कोई MeCP2 प्रोटीन MECP2 में पाया गया था-कमी मानव फाइब्रोब्लास्ट (c.806delG) ECLIA का उपयोग कर । MECP2-कमी सेल लाइन (c.806delG) द्वारा TAT-MeCP2 के तेज भी समय के साथ जांच की गई थी(चित्रा 4)। अंत में, इंटर और इंट्रा-परख परिशुद्धता का प्रदर्शन किया गया जैसा कि तालिका 3में दिखाया गया है ।

Figure 1
चित्र 1: MeCP2 इलेक्ट्रोकेमिल्यूमिनेसेंस परख का आरेख। यह आंकड़ा www.meso-scale.com से अनुकूलित किया गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: कई माप में मानव MeCP2 से उत्पन्न MeCP2 मानक वक्र। पता लगाने की निचली सीमा (एलओएलओडी), को खाली से ऊपर 2.5 मानक विचलन (एसडी) के रूप में परिभाषित किया गया है, 1.00 एनजी/एमएल है। Recombinant मानव MeCP2 (Abnova) सही १.०० एनजी/mL (LLOD) से १,८०० एनजी/mL (पता लगाने की ऊपरी सीमा [ULOD]) से एक सीमा पर मात्रा में निर्धारित किया जा सकता है R2 = ०.९९६ के साथ । त्रुटि सलाखों n = 3 के मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा स्टीनकेलनर एट अल8से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: माउस मस्तिष्क और एचडीएफ में MeCP2 स्तर। (A)MeCP2-प्रोटीन के स्तर को मस्तिष्क परमाणु रूपों में विषमता (ग्रे, एचटी) और मादा जंगली प्रकार के चूहों (काला, वाइल्डटाइप) (एन = 4) और एक Mecp2-नॉकआउटमाउस (RTT) से मापा गया; (ख)मनुष्यों में MeCP2 प्रोटीन के स्तर और एक स्वस्थ नियंत्रण (काला) का आकलन करने के लिए नवजात एंसेफेलोपैथी के साथ एक पुरुष रोगी से प्राप्त MeCP2-कमी फाइब्रोब्लास्ट सेल लाइन (c.806delG) से सेल lysates । प्रस्तुत डेटा का मतलब है ± ट्रिपलीकेट कुओं के एसडी (एन = 3)। इम्यूनोफ्लोरेसेंस या ईसीलिया का उपयोग करके उत्परिवर्ती कोशिका रेखाओं में कोई MeCP2 प्रोटीन (डिटेक्शन रेंज से नीचे) का पता नहीं चला, आगे यह प्रदर्शित किया गया कि यह TAT-संलयन प्रोटीन के साथ आगे के अध्ययन के लिए एक अत्यधिक संवेदनशील प्रणाली है । इस आंकड़े को स्टीनकेलनर एट अल8से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: TAT-MeCP2 के समय निर्भर तेज । C.806delG HDFs में परमाणु अंशों के MeCP2 स्तर ५०० एनएम recombinant TAT-MeCP2 संलयन प्रोटीन के साथ इलाज किया गया । मेसीपी2-ईसीएए के साथ विश्लेषण किया गया। निर्धारित समय बिंदुओं पर, कोशिकाओं को डीपीबीएस के साथ धोया गया और एक्सट्रासेलुलर-बाउंड TAT-MeCP2 को खत्म करने के लिए 5 मिन के लिए ०.०५% ट्राइप्सिन-EDTA के साथ इनक्यूबेटेड किया गया । सीरम के साथ मीडिया को जोड़कर ट्राइप्सिनाइजेशन बंद कर दिया गया। सेल निलंबन 5 00 x ग्राम पर 500 x g पर 5 00 x पर सेंटीमीटर किया गया था। सेल पैलेट 2x को बर्फ से ठंडा डीपीबीएस से धोने के बाद प्रोटोकॉल सेक्शन में बताए गए न्यूक्लियर अंश को निकालने के लिए सैंपल तैयार किया गया था। इस आंकड़े को स्टीनकेलनर एट अल8से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

इंट्रा परख अंतर परख
एनजी MeCP2 प्रति mL प्रोटीन एनजी MeCP2 प्रति mL प्रोटीन
वैसे 1 खैर 2 वैसे 3 मतलब एसडी एसईएमबी % सीवीसी मतलब एसडी एसईएमबी % सीवीसी
ह्यूमन फाइब्रोब्लास्ट 6.42 6.30 6.45 6.39 0.08 0.05 1.24 6.61 0.64 0.37 9.71
माउस मस्तिष्क lysate 9.92 10.16 10.36 10.14 0.22 0.13 2.17 11.22 0.94 0.54 8.33
एक मानक विचलन, बीमानक त्रुटि मतलब, भिन्नता के सीगुणांक

तालिका 3: एचडीएफसी और वाइल्डटाइप माउस मस्तिष्क के लगातार तीन दिनों में अंतर-परख परिशुद्धता का निर्धारण। प्रति अच्छी तरह से 1−10 माइक्रोन प्रोटीन सेल लाइसेट लगाया गया था। एक एसडी, मानक विचलन; एसईएम, मानक त्रुटि का मतलब है; सीवी, भिन्नता का गुणांक। इस तालिका को स्टीनकेलनर एट अल8से संशोधित किया गया है ।

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Discussion

एंडोजेन्सी MeCP2, recombinant MeCP2 और TAT-MeCP2 स्तरों को मापने के लिए, एक ९६-अच्छी तरह से थाली ECLIA विकसित किया गया था । यह दिखाया गया है कि MeCP2 प्रोटीन समारोह के नुकसान RTT सिंड्रोम6की ओर जाता है, जिसके लिए उपचार वर्तमान में लक्षण प्रबंधन और शारीरिक चिकित्सा तक ही सीमित है । एक आशाजनक उपचार एवेन्यू तथाकथित प्रोटीन रिप्लेसमेंट थेरेपी है, जहां MeCP2 के स्तर को उनकी आवश्यक एकाग्रता12,,13,,14,,15तक टिटकिया जा सकता है। रक्त-मस्तिष्क बाधा को पार करने के लिए टैट -फ्यूजन प्रोटीन की क्षमता पिछले दो दशकोंमें 12, 13 ,,1413,15में सफल साबित हुई है ।, जैसे, MeCP2 वितरण के लिए यह विधि प्रोटीन रिप्लेसमेंट थेरेपी प्रशासन के संदर्भ में उपयोगी हो सकती है। MeCP2 प्रोटीन के स्तर को बहाल करने के लिए TAT-संलयन प्रोटीन और अन्य उपचारों की क्षमता का आकलन करने के लिए, एक कुशल और सस्ती परख विकसित करना जो उन्हें निर्धारित कर सकता है, अत्यंत महत्वपूर्ण है। इस काम में वर्णित परख, ईसीलिया, अनुकूल अंतर-और अंतर-परख मूल्यों(तालिका 3)के साथ, MeCP2 के स्तर को सही और लगातार निर्धारित करने में सक्षम है।

निम्नलिखित MeCP2-ECLIA प्रोटोकॉल के लिए, माउस मस्तिष्क lysates और HDFs ब्याज की कोशिकाओं के रूप में कार्यरत थे । हालांकि, इस प्रोटोकॉल का उपयोग कम से कम मानव और मूत्र मूल के अन्य सभी सेल प्रकारों के साथ किया जा सकता है। इसके अलावा, विभिन्न MeCP2 प्रोटीन वेरिएंट को मापने के लिए इस परख की क्षमता दिखाने के लिए टीटी-MePC2 फ्यूजन प्रोटीन के साथ एचडीएफ का इलाज किया गया । नमूना तैयारकरने के दौरान, डीटीटी या मर्काप्टोथेनॉल जैसे लाइसिस बफर में एजेंटों को कम करने से बचना या कम करना, तकनीक की दक्षता को संरक्षित करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस विधि में अतिरिक्त महत्वपूर्ण चरणों में माउस एंटी-मेसीपी 2 एंटीबॉडी, प्लेट ब्लॉकिंग और नमूना जोड़ के साथ प्लेट कोटिंग शामिल है, जिसके बाद खरगोश विरोधी MeCP2 एंटीबॉडी के साथ 4 एच इनक्यूबेशन है। एक विशिष्ट माध्यमिक एंटीबॉडी(सामग्री की तालिका)और ल्यूमिनेसेंस प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक अभिकर्मकों को जोडऩे के साथ बाद में इनक्यूबेशन में इस प्रक्रिया के अंतिम महत्वपूर्ण कदम शामिल हैं।

ईसीएए के प्रदर्शन को अनुकूलित करने के लिए, निम्नलिखित कदम उठाए जा सकते हैं। इस परख के लिए संकेत के लिए अधिकतम उत्पादन १,०००,००० मायने से अधिक नहीं होना चाहिए । तरल पदार्थ को इलेक्ट्रोड से परे फैलने से रोकने के लिए, स्पॉट कोटिंग नामक तकनीक का उपयोग कुएं में कोटिंग समाधान पेश करने के लिए किया जा सकता है। इस तकनीक के लिए उच्च सटीक पाइपिंग या पिपेट रोबोट के उपयोग की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, विभिन्न एंटीबॉडी सांद्रता का परीक्षण परख विशिष्टता बढ़ाने और पृष्ठभूमि संकेत को कम करने दोनों के लिए उपयोगी हो सकता है। बाद को संबोधित करने के लिए, विभिन्न ब्लॉकर्स (जैसे एमएसडी, ब्लॉकर डी-एम) का उपयोग 0.1% की अंतिम एकाग्रता के लिए भी किया जा सकता है। सिग्नल गुणवत्ता को अनुकूलित करने के लिए, विभिन्न इनक्यूबेशन बार (300 आरपीएम पर या उससे ऊपर मिलाते हुए) का परीक्षण करने की सिफारिश की जाती है। अंत में, सीरम, प्लाज्मा, मूत्र या सेरेब्रोस्पाइनल तरल पदार्थ जैसे विशिष्ट मीडिया में वसूली और कमजोर ख़ून की रेखा को बढ़ाने के लिए, कई डिल्यूएंट्स का परीक्षण किया जा सकता है।

अर्ध-मात्रात्मक पश्चिमी दाग और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध MeCP2-एलिसा आम तौर पर MeCP2 प्रोटीन के स्तर का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है । एलिसा के पीछे काम करने का सिद्धांत हमारे ईसीएए के समान है जिसमें उल्लेखनीय अंतर का पता लगाने का मोड है। इन तरीकों की तुलना में, MeCP2-ECLIA तेजी से और अधिक सुविधाजनक है। ECLIA का उपयोग पश्चिमी ब्लॉटिंग (डेटा नहीं दिखाए गए डेटा) द्वारा प्राप्त एक ही नमूनों से MeCP2 मात्रा की तुलना में MeCP2 मात्रा की तुलना में निष्कर्षों के साथ वाइल्डटाइप, विषमगोज़ीगौस और Mecp2-नॉकआउट माउस मस्तिष्क नमूनों(चित्रा 3A)के लिए परख के लिए किया गया था । एक उल्लेखनीय अंतर महिला वाइल्डटाइप और विषमता माउस मस्तिष्क के नमूनों के MeCP2 स्तरों में देखा गया था जो पश्चिमी दाग द्वारा सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण के रूप में पता नहीं चला था । यह उच्च ECLIA परख सटीकता उपन्यास यौगिकों की खोज में महत्वपूर्ण हो सकती है जो MeCP2 प्रोटीन के स्तर को ऊंचा कर सकते हैं।

इसके अलावा, MeCP2-ECLIA अपने MeCP2-एलिसा समकक्ष की तुलना में कम महंगा है और 1 एनजी/mL से १,८०० एनजी/mL (R2 = ०.९९६) के लिए अपनी उच्च गतिशील रेंज के कारण, कम MeCP2 मात्रा वाले नमूनों के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है । जब सभी व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एलिसा किट की तुलना में, ECLIA बहुत उन्हें मात देता है। ईसीएए के पास अपने एलिसा समकक्षों की तुलना में 1−1,800 एनजी/एमएल से अधिक अनुकूल गतिशील रेंज है, जो 0.312−20 एनजी/एमएल (माउस, क्लाउड-क्लोन कॉर्प) और 0.156−10 एनजी/एमएल (मानव, क्लाउड-क्लोन कॉर्प) पाए गए। पता लगाने की एक कम सीमा की एक स्पष्ट परिभाषा के अभाव के कारण, उन दो परख के बीच अपनी सीधी तुलना इस काम के प्रयोजनों के लिए संभव नहीं है ।

संक्षेप में, यह दिखाया गया है कि MeCP2-ECLIA सही वीवो और इन विट्रो में MeCP2 राशि निर्धारित कर सकते हैं । आरटीटी प्रभावित रोगियों के न्यूरॉन्स में MeCP2 प्रोटीन के स्तर की भरपाई करते समय वास्तव में एक आशाजनक उपचार एवेन्यू है, अत्यधिक MeCP2 की उपस्थिति के परिणामस्वरूप गंभीर न्यूरोलॉजिकल लक्षण भी हो सकते हैं, जो MECP2 दोहराव सिंड्रोम16,,17,,18से जुड़े हैं। इस प्रकार, प्रोटीन रिप्लेसमेंट थेरेपी के दौरान मेसीपी2 को शुरू की गई मेसीपी 2 की मात्रा को अनुकूलित करने में यह विधि अभिन्न महत्व की हो सकती है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम ईसीएए साधन के साथ उनके समर्थन के लिए डॉ ब्रिजित स्टर्म के बहुत आभारी हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1,4-Dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich D9779 Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate Bio-Rad Laboratories Inc. 500-0006 Sample preperation
Detection AB SULFO-TAG labeled anti-rabbit Meso Scale Diagnostics R32AB-1 Antibody
Discovery workbench 4.0 Meso Scale Discovery Software
DMEM (1X) gibco by Life Technologies 41966-029 Sample preperation
Dulbecco’s PBS (sterile) Sigma-Aldrich D8537-500ML Sample preperation, Washing solution, Coating solution
EDTA Sigma-Aldrich EDS Extraction Buffer
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich F9665 Sample preperation
Glycerol Sigma-Aldrich G2025 Extraction Buffer
Gold Read Buffer T (1x) with surfactant Meso Scale Diagnostics R92TG MeCP2 ECLIA protocol
HEPES Sigma-Aldrich H3375 Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
KIMBLE Dounce tissue grinder set Sigma-Aldrich D8938 Sample preperation
Laboratory Shaker, rocking motion (low speed) GFL 3014 MeCP2 ECLIA protocol
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl*6H20) Sigma-Aldrich M2670 Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
MeCP2 (Human) Recombinant Protein (P01) Abnova Corporation H00004204-P01 Cell treatment
Microseal B seal Bio-Rad Laboratories Inc. MSB1001 for plate sealing
Monoclonal Anti-MeCP2, produced in mouse, clone Mec-168, purified immunoglobulin Sigma-Aldrich M6818-100UL; RRID:AB_262075 Antibody, Coating solution
MSD Blocker A Meso Scale Diagnostics R93BA-4 Blocker
MSD SECTOR Imager 2400 Meso Scale Diagnostics I30AA-0 MeCP2 ECLIA protocol
Multi-Array 96-well Plate Meso Scale Diagnostics L15XB-3/L11BX-3 MeCP2 ECLIA protocol
Penicillin-Streptomycin gibco by Life Technologies 15140122 Sample preperation
Polyclonal Anti-MeCP2, produced in rabbit Eurogentec S.A. custom-designed Antibody
Potassium chloride (KCl) Merck KGaA 1049361000 Hypotonic lysis reagent
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (1B11) Sigma-Aldrich SAB1404063; RRID:AB_10737296 Antibody
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (4B6) Sigma-Aldrich WH0004204M1; RRID:AB_1842411 Antibody
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Mec-168) Sigma-Aldrich M6818; RRID:AB_262075 Antibody
Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Men-8) Sigma-Aldrich M7443; RRID:AB_477235 Antibody
Primary AB Rabbit, anti-MeCP2 (D4F3) Cell Signaling Technology 3456S; RRID:AB_2143849 Antibody
Protease Inhibitor Cocktail (100X) Sigma-Aldrich 8340 Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer
Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2 Eurogentec S.A. custom Antibody
Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2 Merck 07-013 Antibody
Sodium chloride (NaCl) Sigma-Aldrich S3014 Extraction Buffer
SULFO-TAG Labeled Anti-Rabbit Antibody (goat) Meso Scale Diagnostics W0015528S Antibody
TAT-MeCP2 fusion protein in-house production Cell treatment
Trypsin EDTA 0.25% (1X) gibco by Life Technologies 25200-056 Cell treatment
Tween 20 Sigma-Aldrich P9416 Washing solution

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