एक सबसेलुलर कंपार्टमेंट-विशिष्ट रेडॉक्स-संवेदनशील ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन का उपयोग करके सेलुलर ऑक्सीकरण का आकलन

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Biochemistry

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Summary

यह प्रोटोकॉल सेल के भीतर उपकोशिकीय डिब्बे-विशिष्ट रेडॉक्स स्थिति के आकलन का वर्णन करता है। एक रेडॉक्स-संवेदनशील फ्लोरोसेंट जांच अक्षुण्ण कोशिकाओं में सुविधाजनक अनुपातमेट्रिक विश्लेषण की अनुमति देती है।

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Tascioglu Aliyev, A., LoBianco, F., Krager, K. J., Aykin-Burns, N. Assessment of Cellular Oxidation using a Subcellular Compartment-Specific Redox-Sensitive Green Fluorescent Protein. J. Vis. Exp. (160), e61229, doi:10.3791/61229 (2020).

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Abstract

इंट्रासेलुलर ऑक्सीकरण/कमी संतुलन को मापने से किसी जीव की शारीरिक और/या रोगविज्ञानी रेडॉक्स स्थिति का अवलोकन होता है । थिओल्स अपने कम डिथिओल और ऑक्सीकृत डिसल्फाइड अनुपात के माध्यम से कोशिकाओं की रेडॉक्स स्थिति को रोशन करने के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं। इंजीनियर सिस्टीन युक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन रेडॉक्स-सेंसेसर के लिए एक नया युग खोलते हैं। उनमें से एक, रेडॉक्स-संवेदनशील ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (roGFP), आसानी से एडेनोवायरल ट्रांसडक्शन के साथ कोशिकाओं में पेश किया जा सकता है, जिससे सेलुलर प्रक्रियाओं को बाधित किए बिना उपकोशिकीय डिब्बों की रेडॉक्स स्थिति का मूल्यांकन किया जा सकता है। आरओजीएफपी के कम साइस्टीन और ऑक्सीडाइज्ड सिस्टाइन्स में क्रमशः 488 एनएम और 405 एनएम पर एक्सिडेंट मैक्सिमा होता है, जिसमें उत्सर्जन 525 एनएम होता है। इन कम और ऑक्सीकृत रूपों के अनुपात का आकलन सेल के भीतर रेडॉक्स बैलेंस की सुविधाजनक गणना की अनुमति देता है। इस विधि लेख में, मानव ट्रिपल नकारात्मक स्तन कैंसर कोशिकाओं (एमडीए-एमबी-231) को जीवित कोशिका के भीतर रेडॉक्स स्थिति का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। प्रोटोकॉल चरणों में एमडीए-एमबी-231 सेल लाइन ट्रांसडक्शन के साथ साइटोसोलिक रोगएफपी व्यक्त करने के लिए एडेनोवायरस के साथ, एच22के साथ उपचार और प्रवाह साइटोमेट्री और फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी दोनों के साथ सिस्टीन और सिस्टीन अनुपात का आकलन शामिल है।

Introduction

ऑक्सीडेटिव तनाव को 1 9 85 में हेल्मुट ज़ीज़ द्वारा "पूर्व के1पक्ष में प्रोऑक्सीडेंट-एंटीऑक्सीडेंट संतुलन में गड़बड़ी" के रूप में परिभाषित किया गया था, और जीवों की रोग-, पोषण-और उम्र बढ़ने-विशिष्ट रेडॉक्स स्थिति प्राप्त करने के लिए अधिकता शोध किया गया है1,2,,3।, तब से ऑक्सीडेटिव स्ट्रेस की समझ व्यापक हो गई है । रोगों और/या उम्र बढ़ने के खिलाफ एंटीऑक्सीडेंट का उपयोग करने की परिकल्पनाओं का परीक्षण करने से पता चला है कि ऑक्सीडेटिव तनाव न केवल नुकसान का कारण बनता है बल्कि कोशिकाओं में अन्य भूमिकाएं भी होती हैं । इसके अलावा, वैज्ञानिकों ने दिखाया है कि मुक्त कण संकेत लेनदेन2के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं । ये सभी अध्ययन मैक्रोमॉलिक्यूल्स के कमी-ऑक्सीकरण (रेडॉक्स) अनुपात में परिवर्तनों का निर्धारण करने के महत्व को मजबूत करते हैं। एंजाइम गतिविधि, एंटीऑक्सीडेंट और/या ऑक्सीडेंट, और ऑक्सीकरण उत्पादों का आकलन विभिन्न तरीकों से किया जा सकता है । इनमें से, थियोल ऑक्सीकरण निर्धारित करने वाले तरीके यकीनन सबसे अधिक उपयोग किए जाते हैं क्योंकि वे कोशिकाओं में एंटीऑक्सीडेंट और प्रोऑक्सिडेंट के बीच संतुलन पर रिपोर्ट करते हैं, साथ ही जीव4। विशेष रूप से, ग्लूटाथिएक (जीएसएच)/ग्लूटाथिएक डिफ्लाइड (जीएसएसजी) और/या सिस्टीन (सीवाईएसएस)/सिस्टीन (सीवाईएसएस) के बीच अनुपात का उपयोग जीवों की रेडॉक्स स्थिति की निगरानी के लिए बायोमार्कर के रूप में किया जाता है2

प्रोऑक्सिडेंट्स और एंटीऑक्सीडेंट के बीच संतुलन को परखने के लिए उपयोग की जाने वाली विधियां मुख्य रूप से कोशिकाओं के भीतर कम/ऑक्सीकृत प्रोटीन या छोटे अणुओं के स्तर पर निर्भर करती हैं । पश्चिमी ब्लॉट्स और मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग कम/ऑक्सीडाइज्ड मैक्रोमॉलिक्यूल्स (प्रोटीन, लिपिड आदि) के अनुपात का मोटे तौर पर आकलन करने के लिए किया जाता है, और जीएसएच/जीएसएसजी अनुपात स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री5के साथ मूल्यांकन किया जा सकता है । इन तरीकों की एक आम विशेषता सेल लाइसिस और/या ऊतक समरूपता द्वारा प्रणाली का शारीरिक क्षोभ है । ये विश्लेषण तब भी चुनौतीपूर्ण हो जाते हैं जब विभिन्न सेलुलर डिब्बों की ऑक्सीकरण स्थिति को मापना आवश्यक होता है। इन क्षोभ के सभी परख वातावरण में कलाकृतियों का कारण ।

रेडॉक्स-संवेदनशील फ्लोरोसेंट प्रोटीन ने कोशिकाओं में गड़बड़ी के बिना रेडॉक्स बैलेंस का मूल्यांकन करने के लिए एक लाभप्रद युग खोला6। वे सेलुलर ऑर्गेनेल्स के बीच क्रॉसटॉक की जांच करने के लिए डिब्बे-विशिष्ट गतिविधियों (उदाहरण के लिए, माइटोकॉन्ड्रिया और साइटोसोल की रेडॉक्स स्थिति को देखते हुए) के मात्राकरण की अनुमति देते हुए विभिन्न इंट्रासेलर डिब्बों को लक्षित कर सकते हैं। येलो फ्लोरोसेंट प्रोटीन (वाईएफपी), ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी), और हाइपीआर प्रोटीन की समीक्षा मेयेर और सहयोगियों द्वारा की जाती है6। इन प्रोटीनों में, रेडॉक्स-सेंसिटिव जीएफपी (roGFP) अपने सीवाईएसएस (पूर्व 488 एनएम/एम 525 एनएम) और सीवाईएसएस (पूर्व 405 एनएम/525 एनएम) अवशेषों के विभिन्न फ्लोरोसेंट रीडआउट के कारण अद्वितीय है, जो अन्य रेडॉक्स-सेंसिटिव प्रोटीन जैसे वाईएफपी7,,8के विपरीत अनुपात-संवेदनशील प्रोटीन की अनुमति देता है। रेशेमेट्रिक आउटपुट मूल्यवान है क्योंकि यह अभिव्यक्ति के स्तर, पता लगाने की संवेदनशीलता और फोटोब्लैचिंग8के बीच मतभेदों को प्रतिसंतुलित करता है। कोशिकाओं के उपकोशिकीय डिब्बों (साइटोसोल, माइटोकॉन्ड्रिया, न्यूक्लियस) या विभिन्न जीवों (बैक्टीरिया के साथ-साथ स्तनधारी कोशिकाओं),को रोगएफपी7,,9,10को संशोधित करके लक्षित किया जा सकता है।

विशेष रूप से वास्तविक समय के दृश्य प्रयोगों के लिए फ्लोरोसेंट इमेजिंग तकनीकों का उपयोग करके roGFP परख का आयोजन किया जाता है। पूर्व निर्धारित समय बिंदुओं के साथ प्रयोगों के लिए आरओजीएफपी के फ्लो साइटोमेट्रिक विश्लेषण भी संभव हैं। वर्तमान लेख में एडेनोवायरल ट्रांसडक्शन के माध्यम से रोगएफपी (साइटोसोल के लिए लक्षित) को अधिक उत्पादित करने वाले स्तनधारी कोशिकाओं में रेडॉक्स स्थिति का अनुपातमेट्रिक आकलन करने के लिए फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी और प्रवाह साइटोमेट्री के उपयोग दोनों का वर्णन किया गया है।

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Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल को 70%-80% कन्फ्लूंट एमडीए-एमबी-231 कोशिकाओं के लिए अनुकूलित किया गया था। अन्य सेल लाइनों के लिए, कोशिकाओं की संख्या और संक्रमण की बहुलता (एमओआई) को फिर से प्रचारित किया जाना चाहिए।

1. कोशिकाओं की तैयारी (दिन 1)

  1. 75 सेमी 2 फ्लास्क में एमडीए-एमबी-231 सेल लाइन बनाए रखें दुल्बेको के संशोधित ईगल माध्यम (डीएमईएम) के 10 एमएल के साथ 5% सीओ2 आर्द्रीकृत वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (एफबीएस) के साथ पूरक।2
    नोट: डीएमईएम 10% एफबीएस, 37 डिग्री सेल्सियस के साथ पूरक है, और पूरे प्रोटोकॉल में सभी लगाव और उपचार ऊष्मायन के लिए 5% सीओ 2 आर्द्रीकृत वातावरण का उपयोग कियाजाता है।
  2. प्रयोग के लिए एमडीए-एमबी-231 कोशिकाओं को तैयार करें।
    1. फ्लास्क के भीतर माध्यम को एएसपिएंट करें, 2 मिनट के लिए 0.25% ट्राइप्सिन-ईडीटीए समाधान के 2 मिलीलन के साथ कोशिकाओं को अलग करें, और 6 मिलील पूर्ण माध्यम (10% एफबीएस के साथ डीएमईएम) के साथ ट्राइपसिन गतिविधि को निष्क्रिय करें। कोशिकाओं को 5 मिनट के लिए 150 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र करें। सुपरनेट को एस्पिरेट करें और कोशिकाओं को पूर्ण माध्यम के 5 एमएल में निलंबित करें।
    2. बराबर वॉल्यूम सेल सस्पेंशन और 0.4% ट्राइपैन ब्लू मिलाएं। इस मिश्रण के 10 माइक्रोल लें और स्वचालित सेल काउंटर के साथ कोशिकाओं की गिनती करें।
      नोट: सेल काउंटिंग के लिए कूल्टर काउंटर या हीमोसाइटोमीटर का भी इस्तेमाल किया जा सकता है।
    3. कोशिकाओं को प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए 6 अच्छी तरह से प्लेट में बीज और बीज 150,000 कोशिकाओं को मध्यम के 1 एमएल में अच्छी तरह से। सेल अटैचमेंट के लिए 16 घंटे रुको।
    4. कोशिकाओं को फ्लोरोसेंट इमेजिंग के लिए 4 अच्छी तरह से कक्ष स्लाइड में बीज और बीज 25,000 कोशिकाओं में मध्यम के 0.5 एमएल प्रति अच्छी तरह से। सेल अटैचमेंट के लिए 16 घंटे रुको।
      नोट: उपचार कुओं के अलावा बीज नियंत्रण कुओं। सेल नंबर निर्धारित करने के लिए नियंत्रण कुओं में से एक का उपयोग करें (वैकल्पिक: यदि कोशिकाओं के लिए अनुलग्नक अवधि दोगुनी समय से कम है, तो सेल संख्या को सीडिंग घनत्व के समान माना जा सकता है) और दूसरा गैर संक्रमित नियंत्रण (0 एमओआई) के लिए।

2. एडेनोविराल रोगएफपी ट्रांसडक्शन (दिन 2 और 3)

सावधानी: एडेनोवायरस बीमारियों का कारण बन सकता है। कोशिकाओं को स्थानांतरित करते समय, फ़िल्टर किए गए सुझावों और 10% ब्लीच के साथ डिसेंटेमिनेट टिप्स, पाश्चर पिपेट और माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब का उपयोग करें।

नोट: इस प्रोटोकॉल को साइटोसोल-विशिष्ट रोगएफपी के साथ प्रदर्शित किया गया था, लेकिन अन्य सेलुलर डिब्बों (जैसे, माइटोकॉन्ड्रिया या माइटोकॉन्ड्रियल इंटरमेम्ब्रेन स्पेस) को इसी प्रोटोकॉल के साथ लक्षित किया जा सकता है।

  1. एमओआई के लिए एक खुराक-प्रतिक्रिया वक्र उत्पन्न करें, जो एमडीए-एमबी-231 सेल लाइन(तालिका 1)के लिए प्रत्येक एमओआई मूल्य के लिए आवश्यक एडेनोवायरस (एमएल) की मात्रा की गणना करके उच्चतम ट्रांसडक्शन दक्षता प्राप्त करने के लिए है:
    Equation 1
    नोट: एडेनोवायरल स्टॉक के प्रत्येक बैच का कार्यात्मक टाइटर, जिसे प्रति एमएल पट्टिका बनाने इकाई (पीएफयू) के रूप में व्यक्त किया जाता है, कंपनी द्वारा प्रदान किया जाता है। ट्रांसडक्शन के लिए इष्टतम एमओआई सेल प्रकारों के बीच अलग होता है। अधिकांश स्तनधारी कोशिकाओं के लिए, इष्टतम एमओआई रेंज 10 और 300 के बीच है। सेलुलर प्रतिक्रिया के अनुसार, एमओआई मूल्यों की पुनर्गणना की जानी चाहिए (उदाहरण के लिए, यदि कोशिकाओं में साइटोटॉक्सिक प्रतिक्रिया होती है, या यदि कोशिकाओं में कम ट्रांसडक्शन दक्षता होती है तो एमओआई रेंज को कम किया जाना चाहिए)।
  2. विश्वसनीय पाइपिंग के लिए सेल कल्चर मीडियम (10% एफबीएस के साथ डीएमईएम) के साथ 6 x10 10 10 पीएल एडेनोवायरल रोगएफपी समाधान का 1:100 कमजोर पड़ने का प्रयास करें।
  3. पिपेट और 50 के साथ 150,000 सेल को स्थानांतरित करने के लिए 6 अच्छी प्लेट के प्रत्येक कुएं में एडेनोवायरल रोगएफपी के 0.0125 एमएल (12.5 माइक्रोएल), 0.025 एमएल (25 माइक्रोएल), 0.05 एमएल (50 माइक्रोल) जोड़ें। प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण(तालिका1) के लिए क्रमशः 100, और 200 एमओआई।
  4. पिपेट और फ्लोरेसेंस इमेजिंग (टेबल 1) के लिए 100 एमओआई के साथ 25,000 कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए 4-कक्ष स्लाइड कुओं में एडेनोवायरल रोगएफपी कमजोर पड़ने के 0.0042 एमएल(4.2 माइक्रोएल)जोड़ें।
    नोट: एडेनोवायरल रोगएफपी निर्माण और कोशिकाओं के बीच उच्चतम बातचीत सुनिश्चित करने के लिए कुओं में न्यूनतम मात्रा में मध्यम का उपयोग किया जाना चाहिए। संस्कृति माध्यम की सीरम सामग्री को विभिन्न सेल लाइनों के लिए कम करने की आवश्यकता हो सकती है क्योंकि सीरम का उच्च स्तर कुछ कोशिका प्रकारों में ट्रांसडक्शन दक्षता को नकारात्मक रूप से प्रभावित कर सकता है।
  5. कोशिका रखरखाव की स्थिति के तहत 16-24 घंटे के लिए इनक्यूबेट कोशिकाएं। अगले दिन (3 दिन) माध्यम को सेल संस्कृति माध्यम (10% एफबीएस के साथ डीएमईएम) को बदलने के लिए एक अतिरिक्त 24 घंटे के लिए सेल रिकवरी की अनुमति देने के लिए माइक्रोस्कोप के नीचे कोशिकाओं को उनके आकृति विज्ञान का आकलन करने के लिए कल्पना करें; कोशिकाएं रोगएफपी व्यक्त कर सकती हैं, भले ही उनके पास रूपात्मक परिवर्तन हों।
    नोट: 3 दिन पर, कोशिकाओं को roGFP व्यक्त करना शुरू कर देना चाहिए; इसलिए, फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी (पूर्व 488/em. 525 के साथ फिल्टर) का उपयोग करके ट्रांसडक्शन दक्षता की निगरानी की जा सकती है। लगातार परख परिणाम प्राप्त करने के लिए, के बारे में पता है और चरण के विपरीत माइक्रोस्कोप के तहत रूपात्मक परिवर्तन दस्तावेज़ और परिवर्तन दक्षता का मूल्यांकन करते हुए आकृति विज्ञान का पालन करें ।
  6. चरण 2.3 में तैयार 50, 100 और 200 एमओआई नमूनों और प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण (चरण 3.1 और 4.1) से प्राप्त उनके ट्रांसडक्शन दक्षता परिणामों का उपयोग करके एक खुराक प्रतिक्रिया वक्र का निर्माण करें। रूपात्मक परिवर्तन (चरण 2.5) और एमओआई के खुराक-प्रतिक्रिया वक्र के प्रलेखन के साथ इष्टतम ट्रांसडक्शन दक्षता का आकलन करें।
    नोट: हालांकि 100 एमओआई और 200 एमओआई एक्सप्रेस रोगएफपी (प्रतिनिधि परिणाम देखें) में सेल आबादी का 98% से अधिक, 200 एमओआई समूह ने एमडीए-एमबी-231 कोशिकाओं की सेल आकृति विज्ञान में पर्याप्त परिवर्तन दिखाया। नतीजतन, एमडीए-एमबी-231 कोशिकाओं के लिए सबसे प्रभावोत्पादक एमओआई 100 एमओआई होना निर्धारित किया गया था।
  7. इष्टतम एमओआई (यहां, 100 एमओआई) के बाद एमडीए-एमबी-231 सेल लाइन के लिए चुना गया था, परीक्षण सामग्री (10 माइक्रोनएम एच22 और इसके वाहन 0.1% डिओनाइज्ड पानी) के साथ प्रयोग करें।
    1. धारा 1 के अनुसार कोशिकाओं को तैयार करें और बीज करें। चरण 2.1 में गणना किए गए 100 एमओआई के लिए एडेनोवायरल ट्रांसडक्शन वॉल्यूम का उपयोग करके, कोशिकाओं के 100 एमओआई एडेनोवायरल ट्रांसडक्शन के लिए 2.2−2.4 चरण दोहराएं। फिर कदम 2.5 के अनुसार प्लेट और कक्ष स्लाइड को इनक्यूबेट करें।

3. CyS/CySS शेष राशि का अधिग्रहण

  1. फ्लो साइटोमेट्री (दिन 4)
    1. 4 दिन, 1 घंटे के लिए 10 μM H 2 O2के साथ कदम2.7.1 से इनक्यूबेट कोशिकाओं।
      नोट: 10 μM H2O2 परीक्षण पदार्थ के रूप में इस्तेमाल किया गया था और ०.१% deionized पानी इस प्रोटोकॉल में वाहन उपचार के रूप में इस्तेमाल किया गया था । अन्य ऑक्सीकरण एजेंटों को यहां सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
    2. 6 अच्छी तरह से प्लेट से मीडिया Aspirate, 0.25% ट्राइप्सिन-EDTA समाधान के 750 माइक्रोन के साथ बदलें और कोशिकाओं को अलग करने के लिए 2 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें। पूर्ण माध्यम के 2 एमसीएल (10% एफबीएस के साथ डीएमईएम) के साथ निष्क्रिय ट्राइपसिन और वॉल्यूम को 15 एमएल शंकु ट्यूबों में एकत्र करें।
    3. 4ºC पर 5 मिनट के लिए 150 x ग्राम पर ट्यूबों को सेंट्रलाइज करें। सुपरनैंट को त्यागें और फॉस्फेट-बफर खारा (पीबीएस) के 500 माइक्रोन में कोशिकाओं को निलंबित करें।
    4. दोहराएं चरण 3.1.3
    5. 40 माइक्रोन जाल का उपयोग करके सेल निलंबन को प्रवाह साइटोमेट्री-संगत ट्यूबों में फ़िल्टर करें। ट्यूबों को बर्फ पर रखें और प्रकाश से दूर रखें और डेटा विश्लेषण के लिए चरण 4.1 का पालन करें।
  2. माइक्रोस्कोपिक इमेजिंग (4 दिन)
    1. 4 दिन, 10 माइक्रोन एच2O2के साथ कोशिकाओं का इलाज, तुरंत छवियों का अधिग्रहण (समय बिंदु 0) और उपचार के बाद 1 घंटे और डेटा विश्लेषण के लिए चरण 4.2 का पालन करें।

4. डेटा विश्लेषण

  1. फ्लो साइटोमेट्री क्वांटिफिकेशन
    1. नमूना अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के माध्यम से 3 अलग-अलग विश्लेषणों के लिए प्रवाह साइटोमेट्री विधि सेट करें (सामग्री की तालिकादेखें): कोशिका आकार और कोशिकाओं की जटिलता का आकलन करने के लिए वाई-एक्सिस पर एक्स-एक्सिस और साइड स्कैटर (एसएससी) पर फॉरवर्ड स्कैटर (एफसीएस)(एसएससी का उपयोग मृत और जीवित कोशिकाओं की किसी न किसी पहचान के लिए किया जा सकता है); पूर्व 488 एनएम/em. 525 एनएम (फ्लोरोसीन आइसोथिओसाइनेट [फिटसी]) वाई-एक्सिस पर एक्स-एक्सिस और एसएससी पर बैंडपास फिल्टर सीवाईएस-रोगएफपी का आकलन करने के लिए; पूर्व 405 एनएम/एम। 525 एनएम (ब्रिलियंट वायलेट 510 [बीवी 510]) वाई-एक्सिस पर एक्स-एक्सिस और एसएससी पर बैंडपास फिल्टर CySS-roGFP का आकलन करने के लिए।
    2. 0 एमओआई नियंत्रण प्राप्त करें और नमूना अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के साथ कोशिकाओं की कल्पना करें। शेष नमूनों (50, 100, 200 एमओआई समूहों और बाद में 10 μM H2O2 उपचारित कोशिकाओं और वाहन उपचारित कोशिकाओं) के लिए इस कदम को दोहराएं। डेटा विश्लेषण के लिए फ़ाइलों को सहेजें।
    3. डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर खोलें (सामग्री की तालिकादेखें) और 0 एमओआई नमूना फ़ाइल खोलें। ब्याज की सेल आबादी का आकलन करें (गेट 1)। पूर्व 488 एनएम/एम के लिए पृष्ठभूमि फ्लोरेसेंस को कम करने के लिए निम्नलिखित गेटिंग्स सेट करें। 525 एनएम (गेट 2) और पूर्व 405 एनएम/ईएम। 525 एनएम (गेट 3) नॉनइंफ संक्रमित (0 एमओआई) कंट्रोल सेल्स के साथ बैंडपास फिल्टर।
    4. खुराक-प्रतिक्रिया वक्र का आकलन करने के लिए डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर के भीतर 50, 100 और 200 एमओआई नमूना फाइलें खोलें। प्रत्येक नमूने के लिए गेट्स 2 और 3 के साथ मतलब फ्लोरेसेंस तीव्रता का विश्लेषण करें। परीक्षण नमूनों के लिए इस कदम को दोहराएं (10 μM H2O2 उपचारित कोशिकाओं और वाहन उपचारित कोशिकाओं)।
    5. निम्नलिखित समीकरण के साथ रोगएफपी के कम रूपों बनाम ऑक्सीकृत के बीच मतलब फ्लोरोसेंट तीव्रता अनुपात की गणना करें।

Equation 2

  1. छवि मूल्यांकन
    1. एक माइक्रोस्कोप का उपयोग करें जिसमें सीवाईएस-रोगएफपी और सीवाईएसएस-रोगएफपी (पूर्व 488 एनएम/एम) के लिए फ्लोरेसेंस फिल्टर होते हैं।
    2. चैंबर स्लाइड के प्रत्येक कुएं में, बड़े क्षेत्रों की कल्पना करने के लिए 4x उद्देश्य का उपयोग करके छवियों को प्राप्त करने के लिए 4 यादृच्छिक क्षेत्रों को चुनें।
      नोट: 20x उद्देश्य भी छवि प्रदर्शित करता है के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
    3. इमेजजे सॉफ्टवेयर11के साथ इमेज खोलें । विश्लेषण लागू करें । प्रत्येक छवि के लिए आदेश ों को मापें और डेटा की मात्रा निर्धारित करने के लिए चरण 4.1.5 में समीकरण का उपयोग करें।
      नोट: छवियों का परिमाणीकरण अनुपातमेट्रिक है; इसलिए, प्रोटोकॉल में पृष्ठभूमि का घटाव शामिल नहीं है। हालांकि, छवियों, चमक, विपरीत, और संतृप्ति की तुलना करने में सक्षम होने के लिए प्रत्येक छवि के लिए समान होना चाहिए। सांख्यिकीय महत्व विचरण (ANOVA) और Tukey के बाद तदर्थ परीक्षण के एक तरह से विश्लेषण के साथ मूल्यांकन किया गया था ।

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Representative Results

सीवाईएसएस/सीवाईएसएस की रेडॉक्स स्थिति को आसानी से ट्रांसड्यूडेड roGFPs के साथ परख लिया जाता है । फ्लोरोसेंट जांच कम और ऑक्सीकृत रूपों (उत्तेजन तरंगदैर्ध्य क्रमशः 488 एनएम और 405 एनएम) के बीच अनुपात की मात्रा निर्धारित करती है। फ्लोरेसेंस डेटा प्रवाह साइटोमेट्री और माइक्रोस्कोपी दोनों द्वारा प्राप्त किया जा सकता है।

प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके बड़ी संख्या में कोशिकाओं को लगातार और आसानी से प्राप्त किया जा सकता है। विश्लेषण में 3 मुख्य चरण होते हैं: 1) एफएससी क्षेत्र फ़िल्टर(चित्रा 1 ए)के साथ ब्याज की सेल आबादी का चयन करें; 2) पूर्व 488/em के साथ roGFP-व्यक्त कोशिकाओं गेट । एक चयनात्मक बैंडपास फिल्टर के साथ 525 एनएम(चित्रा 1B); और 3) पूर्व 405 एनएम/एम के साथ roGFP-व्यक्त कोशिकाओं से ऑक्सीकृत roGFP युक्त कोशिकाओं को गेट करें। 525 एनएम बैंडपास फिल्टर(चित्रा 1C)

प्रत्येक नई सेल लाइन का मूल्यांकन roGFPs की इष्टतम एडेनोवायरल ट्रांसडक्शन दक्षता के लिए किया जाना चाहिए। ट्रांसडक्शन दक्षता का मूल्यांकन कोशिकाओं के रूपात्मक मूल्यांकन के साथ किया जाना चाहिए और प्रवाह साइटोमेट्री और/या फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के साथ रोगएफपी अभिव्यक्ति विश्लेषण । यह प्रोटोकॉल roGFP विश्लेषण के लिए खुराक-प्रतिक्रिया वक्र निर्धारित करने और सबसे कुशल एमओआई इनपुट(चित्रा 2A− एच) का चयन करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करताहै। एमओआई डोज-रिस्पांस कर्व(चित्रा 2I) केअनुसार, 200 एमओआई ने उच्चतम रोगएफपी अभिव्यक्ति दी, लेकिन साइटोटॉक्सिकिटी का सुझाव देते हुए सेल आकृति विज्ञान प्रभावित हुआ। इसलिए, इष्टतम ट्रांसडक्शन दक्षता 100 एमओआई के साथ होना निर्धारित किया गया था।

विधि की प्रभावशीलता का मूल्यांकन करने के लिए, एच22 का उपयोग ऑक्सीकरण के लिए सकारात्मक नियंत्रण के रूप में किया गया था। इष्टतम ट्रांसडक्शन के लिए १०० एमओआई का इस्तेमाल किया गया था । वसूली अवधि के बाद, कोशिकाओं को प्रवाह साइटोमेट्री के माध्यम से फ्लोरेसेंस अनुपात प्राप्त करने के लिए 1घंटेके लिए 10 माइक्रोनएम एच 2 ओ2 के साथ इलाज किया गया। ऑक्सीडाइज्ड (एक्स 405 एनएम/एम 525एनएम) और कम (एक्स. 488 एनएम/एम 525 एनएम) रोगएफपी मतलब फ्लोरेसेंस तीव्रता वाहन के लिए फ्लो साइटोमेट्री एनालिसिस(चित्रा 3 ए, बी)और 10 μM H2O2 (चित्रा 3C, D)उपचार से प्राप्त किए गए थे। मढ़ा हिस्टोग्राम 10 माइक्रोन एच2 2 और वाहन उपचारित समूहों के सेल नंबरों में कम(चित्रा 3E)और ऑक्सीकृत(चित्रा 3F)roGFP के लिए बदलाव का प्रतिनिधित्व करते हैं । ऑक्सीकरण और कम roGFP के बीच अनुपात से पता चलता है कि 10 μM एच2O2 वाहन उपचार(चित्रा 3G)की तुलना में roGFP के ऑक्सीकरण में 3 गुना वृद्धि हुई ।

कोशिकाओं की फ्लोरोसेंट इमेजिंग भी 1 घंटे के लिए माइक्रोस्कोप के तहत 10 μM एच2O2 के साथ किया गया था । छवियों को 4x उद्देश्य के तहत लिया गया था, और प्रतिनिधि छवियों को 20x उद्देश्य(चित्रा 4A)के तहत लिया गया था । फ्लोरोसेंट तीव्रता का मूल्यांकन इमेजजे सॉफ्टवेयर के साथ किया गया था, और अनुपात की गणना की गई थी। एच 22-प्रेरितऑक्सीकरण में एक स्थिर राज्य वृद्धि का पता चला(चित्रा 4B); 1 एच के लिए एच22 के साथ इनक्यूबेशन ने रोगएफपी साइस्टीन के ऑक्सीकरण को बढ़ा दिया, जिसने वाहन नियंत्रण के बीच महत्वपूर्ण परिवर्तन का प्रदर्शन किया।

Figure 1
चित्रा 1: गैर-ट्रांसड्यूडेड एमडीए-एमबी-231 कोशिकाओं के साथ सीईएस-युक्त (कम) रोगएफपी और सीवाईएसएस युक्त (ऑक्सीकृत) रोगएफपी अवशेषों की फ्लोरोसेंट तीव्रता के लिए गेटिंग सेटअप। }Aब्याज की सेल पॉपुलेशन को एसएससी और एफएससी एरिया फिल्टर्स के साथ गेट 1 के रूप में चुना गया था । (ख)रोगएफपी-एक्सप्रेसिंग कोशिकाओं का चयन गैर-व्यक्त कोशिकाओं के अनुसार गेट 2 के रूप में पूर्व 488/em के साथ किया गया था । 525 एनएम बैंडपास फिल्टर। (ग)ऑक्सीडाइज्ड (सिस्टिन) रोगएफपी युक्त कोशिकाओं को पूर्व ४०५ एनएम/एम के साथ गेट किया गया था । 525 एनएम बैंडपास फिल्टर से 525 एनएम बैंडपास फिल्टर जो आबादी को व्यक्त करते हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एमओआई खुराक-प्रतिक्रिया वक्र मूल्यांकन के साथ प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए एमडीए-एमबी-231 सेल लाइन। (A,B) गैर संक्रमित कोशिकाएं और(सी,डी)50 एमओआई,(ई,एफ)100 एमओआई, और(जी,एच)200 एमओआई रोग-एक्सप्रेसिंग सेल आबादी क्रमशः गेटिंग सेटअप के लिए अधिग्रहीत की गई। (I)ट्रांसड्यूडेड कोशिकाओं का मूल्यांकन किया गया और ब्याज की सेल आबादी के अनुसार प्रतिशत के रूप में प्लॉट किया गया । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्र 3: रोगएफपी-ट्रांसड्यूडेड एमडीए-एमबी-231 सेल लाइन में सीवाईएस/सीवाईएसएस बैलेंस का फ्लो साइटोमेट्री असेसमेंट । वाहन-उपचारित कोशिकाओं का मूल्यांकन(ए)%रोगएफपी-एक्सप्रेसिंग कोशिकाओं के रूप में किया गया था, और(बी)% ऑक्सीडाइज्ड रोगएफपी-एक्सप्रेसिंग कोशिकाओं और एच22 उपचार का मूल्यांकन क्रमशः पैनलों(सी)और(डी)में समान मापदंडों के साथ किया गया था । सेल गिनती वाहन और एच22 उपचार के हिस्टोग्राम(ई)कम roGFP पूर्व 488/em के लिए मढ़ा गया । 525 बैंडपास फिल्टर और(एफ)ऑक्सीडाइज्ड roGFP ex. 405/em। 525 बैंडपास फिल्टर। (जी)ऑक्सीडाइज्ड/कम फॉर्म्स के बीच मतलब फ्लोरेसेंस तीव्रता अनुपात को बार ग्राफ में प्लॉट किया गया था । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: रोगएफपी-ट्रांसड्यूडेड एमडीए-एमबी-231 की फ्लोरोसेंट इमेजिंग। (A) वाहन या एच 22 के साथ1घंटे के उपचार के बाद प्रतिनिधि चित्र । (ख)ऑक्सीकृत/कम रूपों के बीच अनुपात 4 बेतरतीब ढंग से चुने गए क्षेत्रों में मूल्यांकन किया गया, और सलाखों का मतलब ± मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं । *(पी एंड एलटी; 0.05), **(पी एंड एलटी; 0.01), या ***(पी एंड एलटी; 0.005) के रूप में इंगित समूहों के बीच सांख्यिकीय महत्व। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

विश्लेषण प्रकार सेल संख्या प्रति अच्छी तरह से Adenoviral roGFP PFU/mL 1:100 adenoviral roGFP PFU/mL के कमजोर पड़ने Moi ट्रांसडक्शन वॉल्यूम (एमएल)
फ्लो साइटोमेट्री 150,000 6 x 1010 6 x 108 0 0
50 0.0125
100 0.025
200 0.05
फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी 25,000 6 x 1010 6 x 108 100 0.0042

तालिका 1: एमओआई मूल्यों की गणना।

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Discussion

किसी जीव में थिओल/डिसल्फाइड संतुलन कोशिकाओं की रेडॉक्स स्थिति को दर्शाता है। जीवित जीवों में ग्लूटाथिएक, सिस्टीन, प्रोटीन थिओल्स और कम आणविक वजन वाले थिओल्स होते हैं, जो सभी ऑक्सीकरण के स्तर से प्रभावित होते हैं और कोशिकाओं की रेडॉक्स स्थिति गूंजते हैं4। इंजीनियर roGFPs अपने CyS अवशेषों7के माध्यम से थिओल/disulfide संतुलन के गैर विघटनकारी मात्रा की अनुमति देते हैं । रोगएफपी की अनुपातमेदिक संपत्ति स्तनधारी कोशिकाओं के लिए विश्वसनीय रेडॉक्स माप प्रदान करती है। roGFP आसानी से ट्रांसफैक्शन विधियों और/या ट्रांसडक्शन वैक्टर के साथ कोशिकाओं में पेश किया जा सकता है, लेकिन एडेनोवायरल ट्रांसडक्शन में उच्च दक्षता है ।

कोशिकाओं की रेडॉक्स स्थिति आसानी से सेलुलर पर्यावरण (जैसे, कोशिकाओं की उदारता और मध्यम की मात्रा) से प्रभावित होती है। इस प्रोटोकॉल के लिए, अनुकूलित सेल सीडिंग की व्यापकता 60%-70% होने की ठान ली गई थी, जिसमें 15,000 कोशिकाएं प्रति सेमी2थीं; विश्लेषण के दिन, कोशिकाएं 70%-80% कॉन्फ्लूंट थीं। हालांकि, सेल आकृति विज्ञान और दोगुना समय सेल लाइनों के बीच भिन्न होता है। इस कारण से, यदि शोधकर्ता एक और सेल लाइन का उपयोग करना चाहता है, तो प्रवाह साइटोमेट्री और/या फ्लोरेसेस माइक्रोस्कोपी के साथ माप प्राप्त करते समय सेल में नरमी को समायोजित किया जाना चाहिए; यह उनके प्रयोगात्मक डिजाइन और जरूरतों के आधार पर सटीक परिणाम सुनिश्चित करेगा।

roGFPs आसानी से कई ट्रांसफैक्शन विधियों और/या ट्रांसडक्शन वैक्टर के साथ कोशिकाओं के लिए शुरू किया जा सकता है । वर्तमान प्रोटोकॉल साइटोसोल-विशिष्ट रोगएफपी निर्माण का उपयोग करता है, जिसे एडेनोवायरस के साथ कोशिकाओं में स्थानांतरित किया जाता है। एक प्रयोग शुरू करने से पहले, सेल लाइन के लिए एमओआई खुराक-प्रतिक्रिया निर्धारित करना आवश्यक है; यह इष्टतम, प्रजनन योग्य प्रोटोकॉल को डिजाइन करने के लिए न्यूनतम सेल विषाक्तता के साथ अधिकतम लेनदेन दक्षता के निर्धारण की अनुमति देता है।

रोगएफपी-ट्रांसड्यूडेड कोशिकाओं की सीवाईएसएस/सीवाईएसएस स्थिति का आकलन फ्लोरोसेंट इमेजिंग और फ्लो साइटोमेट्री दोनों के साथ किया जा सकता है । दोनों विश्लेषणों में उनके पेशेवरों और विपक्ष हैं; प्रवाह साइटोमेट्री एक बड़ी सेल आबादी को जल्दी से मूल्यांकन करने की अनुमति देता है, लेकिन फ्लोरेसेंस इमेजिंग में रोगएफपी-विशिष्ट कोशिकाओं के प्रति उच्च संवेदनशीलता होती है। इसके अलावा, यह जीएफपी (जैसे, साइटोसोलिक बनाम माइटोकॉन्ड्रियल) के सही उपकोशिक स्थानीयकरण की भी पुष्टि करता है। यहां शोधकर्ताओं द्वारा फ्लो साइटोमेट्री और फ्लोरोसेंट इमेजिंग दोनों का इस्तेमाल किया गया । हालांकि एच22 को रोगएफपी निर्माण7के लिए एक कमजोर ऑक्सीडेंट माना जाता है, प्रोटोकॉल ने प्रदर्शन किया कि दोनों विधियां एच22 उपचार के बाद ऑक्सीडाइज्ड और आरओजीएफपी के कम रूपों के बीच अनुपातीय परिवर्तनों का पता लगाने के लिए पर्याप्त संवेदनशील हैं।

इस रोगएफपी प्रोटोकॉल का उपयोग विभिन्न स्तनधारी सेल प्रकारों की रेडॉक्स स्थिति निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है। प्रोऑक्सिडेंट/एंटीऑक्सीडेंट बैलेंस के संदर्भ में मेनाडिएक-प्रेरित कार्डियोमायोसाइट डेथ को समझने के लिए, लोर और सहयोगियों ने कार्डियोमायोसाइट्स12में साइटोसोलिक और माइटोकॉन्ड्रियल रोगएफपी लेबलिंग दोनों का इस्तेमाल किया । roGFP कोशिकाओं की रेडॉक्स स्थिति के दृश्य की अनुमति देता है, जबकि वे जीवित हैं, और डिब्बे विशिष्ट लक्ष्यीकरण रोगों की एक बेहतर समझ सक्षम बनाता है । एस्पोसिटो और उनके सहयोगियों ने न्यूरोडीजेनेरेटिवरोगोंमें कोशिकाओं की रेडॉक्स स्थिति का निर्धारण करने के लिए रोगएफपी के उपयोग की समीक्षा की । क्योंकि पौधों14 और बैक्टीरिया 9 सहित विभिन्न जीवों में roGFP ट्रांसडक्शन, आसानी से पूरा होजाताहै, रोग राज्यों के दौरान बैक्टीरियल और मेजबान कोशिकाओं दोनों की रेडॉक्स स्थिति की निगरानी अभिनव उपचार दृष्टिकोण की सुविधा प्रदान कर सकता है । इसके अलावा, ट्रांसजेनिक जानवरों में डिब्बे-विशिष्ट रोगएफपी के साथ किए गए वीवो अध्ययनों में जीवों की रेडॉक्स स्थिति पर प्रकाश डाला जा सकता है15,,16

हालांकि, कुछ स्थितियों में, रोगएफपी बायोसेंसर कोशिकाओं के भीतर शारीरिक रूप से प्रासंगिक रेडॉक्स परिवर्तन5 और एच22 ऑक्सीकरण7 की जांच के लिए अपर्याप्त है। एच 2 2के लिए पेरोक्सिडेस चयनशीलता का उपयोग अधिक संवेदनशील जांच6इंजीनियर करने के लिए किया गया था। खमीर पेरोक्सिडास ओआरपी1 को रोगएफपी से जोड़ा गया ताकि एच22- मध्यस्थता वाले थिओल ऑक्सीकरण17,18,19केनाजुक माप को सक्षम किया जा सके । इसी तरह, रोगएफपी सेंसर में मानव ग्लूटारेडोक्सिन (Grx1) का समावेश विशेष रूप से,कोशिका डिब्बों6,18,19के भीतर जीएसएच/जीएसएसजी संतुलन की निगरानी करता है।,

यह आसानी से लागू प्रोटोकॉल शोधकर्ताओं को अक्षुण्ण कोशिकाओं में डिब्बे-विशिष्ट रेडॉक्स स्थिति की निगरानी करने की अनुमति देता है, सेल समरूपता के दौरान शारीरिक तनाव के कारण विरूपणक ऑक्सीकरण को कम करता है। वर्तमान प्रोटोकॉल 2 मात्राकरण विधियों को दर्शाता है: प्रवाह साइटोमेट्री (बड़ी कोशिका आबादी के त्वरित विश्लेषण के लिए फायदेमंद) और फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी (निरंतर समय-चूक इमेजिंग और कोशिकाओं की आकृति विज्ञान का निर्धारण करने की अनुमति)।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

कोशिकाओं में साइटोसोल-विशिष्ट रोगएफपी को व्यक्त करने के लिए निर्माण और पुन: संयोजन एडेनोवायरस क्रमशः पॉल टी शुमाकर, पीएचडी, फ्रीबर्ग स्कूल ऑफ मेडिसिन, नॉर्थवेस्टर्न यूनिवर्सिटी और विराक्वेस्ट इंक की प्रयोगशाला में उत्पन्न हुए थे। इस अध्ययन को एनआईएच नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जनरल मेडिकल साइंसेज सेंटर ऑफ बायोमेडिकल रिसर्च एक्सीलेंस (COBRE NIGMS), नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ जनरल मेडिकल साइंसेज सिस्टम्स फार्माकोलॉजी और विष विज्ञान प्रशिक्षण कार्यक्रम अनुदान T32 GM106999 के माध्यम से कैंसर थेरेपी ग्रांट P20GM109005 के लिए मेजबान प्रतिक्रिया के अध्ययन के लिए केंद्र द्वारा समर्थित किया गया था, UAMS फाउंडेशन/मेडिकल रिसर्च एंडोमेंट अवार्ड AWD00053956, UAMS वर्ष के अंत में चांसलर पुरस्कार AWD00053484 । प्रवाह साइटोमेट्री कोर सुविधा को कोबरे एनआईजीएमएस के माध्यम से माइक्रोबियल रोगजनन और मेजबान भड़काऊ प्रतिक्रियाओं अनुदान P20GM103625 के लिए केंद्र द्वारा भाग में समर्थित किया गया था । सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि एनआईएच के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व करें। ATA तुर्की के वैज्ञानिक और तकनीकी अनुसंधान परिषद (TUBITAK) 2214-एक छात्रवृत्ति द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.25% Trypsin-EDTA Gibco by Life Sciences 25200-056 Cell culture
4-well chamber slide Thermo Scientific 154526 Cell seeding material for fluorescent imaging
5 ml tubes with cell strainer cap Falcon 352235 Single cell suspension tube for flow cytometry analysis
6-well plate Corning 353046 Cell seeding material for flow cytometry analysis
15 ml conical tubes MidSci C15B Cell culture
75 cm2 ventilated cap tissue culture flasks Corning 4306414 Cell culture
Adenoviral cytosol specific roGFP ViraQuest VQAd roGFP roGFP construct kindly provided by Dr. Schumaker
Class II, Type A2 Safety Hood Cabinet Thermo Scientific 1300 Series A2 Cell culture
Countess automated cell counter Invitrogen C10227 Cell counting
Countess cell counter chamber slides Invitrogen C10283 Cell counting
DMEM Gibco by Life Sciences 11995-065 Cell culture
FBS Atlanta Biologicals S11150 Cell culture
Filtered pipette tips, sterile, 20 µl Fisherbrand 02-717-161 Cell culture
Filtered pipette tips, sterile, 1000 µl Fisherbrand 02-717-166 Cell culture
Flow Cytometer BD Biosciences LSRFortessa Instrument equipped with FITC and BV510 bandpass filters for flow cytometry analyses
Fluorescent Microscope Advanced Microscopy Group (AMG) Evos FL Fluorescent imaging
Hydrogen Peroxide 30% Fisher Scientific H325-100 Positive control
Light Cube, Custom Life Sciences CUB0037 Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 405 nm)
Light Cube, GFP Thermo Scientific AMEP4651 Fluorescent imaging of roGFP expressing cells (ex 488 nm)
MDA-MB-231 American Tissue Culture Collection HTB-26 Human epithelial breast cancer cell line
Microcentrifuge tubes, 2 ml Grenier Bio-One 623201 Cell culture
PBS Gibco by Life Sciences 10010-023 Cell culture
Pipet controller Drummond Hood Mate Model 360 Cell culture
Serologycal pipet, 1 ml Fisherbrand 13-678-11B Cell culture
Serologycal pipet, 5 ml Fisherbrand 13-678-11D Cell culture
Serologycal pipet, 10 ml Fisherbrand 13-678-11E Cell culture
Tissue Culture Incubator Thermo Scientific HERACell 150i CO2 incubator for cell culture
Trypan blue stain 0.4% Invitrogen T10282 Cell counting

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References

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