תא תרבויות העצבית מ Aplysia עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה של קונוסים צמיחה

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Aplysia נוירונים californica לפתח קונוסים צמיחה גדול בתרבות כי הם מעולה עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה של תנועתיות צמיחה חרוט והדרכה. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לנתיחה ו ציפוי של תא עצב Aplysia התיק, כמו גם להקמת תא הדמיה תא חי.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Lee, A. C., Decourt, B., Suter, D. M. Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones. J. Vis. Exp. (12), e662, doi:10.3791/662 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

קונוסים הצמיחה העצבית הם מבנים ניעתי מאוד בקצה של אקסונים כי ניתן לזהות רמזים הדרכה הסביבה transduce מידע זה לתנועה כיוונית לכיוון תא היעד המתאים. כדי להבין כיצד מידע והדרכה מועבר מתא השטח לרשתות הבסיסית cytoskeletal דינמי, צריך מערכת מודל מתאים הדמיה תא חי של הדינמיקה חלבון ברזולוציה של זמן ומרחב גבוהה. טיפוסית גביעי צמיחה חוליות קטנים מדי כדי לנתח באופן כמותי F-אקטין ודינמיקה microtubule. נוירונים של ארנבת ים Aplysia californica לפעמים 5-10 גדול יותר נוירונים החוליות, יכול בקלות להיות כל הזמן בטמפרטורת החדר הם תאים חזקים מאוד המיקרומניפולציה מדידות biophysical. קונוסים הצמיחה שלהם הגדירו מאוד אזורים cytoplasmic ומערכת היטב תיאר cytoskeletal. גופי התא העצבי יכול להיות microinjected עם מגוון רחב של בדיקות לחקר חרוט צמיחה תנועתיות והדרכה. בפרוטוקול הנוכחי אנחנו מדגימים נוהל דיסקציה של הגנגליון הבטן, תרבות של נוירונים תא שקית והקמת תא הדמיה הדמיה תא חי של קונוסים צמיחה.

Protocol

פתרונות

  • L15-ASW תרבית תאים בינוניים (1 ליטר)
    • 1 שקית אבקת L15
    • מוסיפים 800 מ"ל של H 2 O ultrapure
    • NaCl 400 מ"מ
    • MgSO 4 27 mM
    • MgCl 2 28 מ"מ
    • L-גלוטמין 4 מ"מ
    • גנטמיצין 50 מיקרוגרם / מ"ל
    • HEPES 5 מ"מ
    • התאם ל-pH 7.9
    • הוסף טיפה אחר טיפה CaCl 2 9.3 מ"מ (אם להפסיק משקעים)
    • הוסף H 2 O ultrapure כדי l 1
    • בדוק osmolarity (950-1000 mmol / ק"ג) עם (Wescor, לחץ אדים # 5520) osmometer
    • סנן 0.22 מיקרומטר באמצעות לחץ חיובי סינון יחידה (מסננים: SVGV010RS Millipore)
    • חנות ב 4 מעלות צלזיוס עד 1 בחודש
  • פולי-L-ליזין (70-150 KD) 200 מיקרוגרם / מניות פתרון מ"ל סטרילי H 2 O ultrapure המשיך -20 o C
  • 0.5 מ MgCl 2 פתרון

יום 1: Dissection של הגנגליון Aplysia בטן

הכנת התמיסה דיסוציאציה האנזימטית

  1. לשקול 90-10 מ"ג Dispase אנזים (וורטינגטון, חתול: LS02111) בצינור Eppendorf
  2. הוסף 900 μl של המדיום ASW-L15 התרבות, 100 μl של סטרילית H 2 O ultrapure
  3. מערבבים ומניחים בטמפרטורת החדר (RT)

Dissection של הגנגליון בטן

  1. ממלאים מזרק 50 מ"ל עם 0.5 פתרון M MgCl 2.
  2. קח חיה אחת פגז מטנק, לטפל בעדינות כדי למנוע הגנה דיות של החיה התגובה.
  3. מניחים את Aplysia על צידו על לוח דיסקציה (קלקר board), בצד מקורי לצד, ממש הזנב שמאלה.
  4. הכנס את המחט לתוך החיה מאחורי הראש להזריק כל פתרון MgCl 2 לחלל הגוף.
  5. לשפשף בעדינות את החיה לפזר את הפתרון MgCl 2 בכל חלל הגוף, לחכות כמה דקות על החיה להיות מורדם לחלוטין.
  6. פין ראש וזנב של החיה על קרש החיתוך עם שתי מחטים.
  7. שימוש במלקחיים להרים העור, לחתוך דרך העור שכבת השריר במספריים גדולים לכיוון הראש והזנב לעשות פתח גדול בצד.
  8. מצא את הגנגליון בטן תחת מברשת השחלה דמוי. שימוש במלקחיים כדי להחזיק את העצבים על חיבור 1 ס"מ מול הגנגליון בטן, לחתוך את העצבים במספריים לנתיחה מול עמדת מלקחיים מחזיק מאחורי הגנגליון הבטן.
  9. הגנגליון המקום לתוך הפתרון Dispase ו דגירה של 15-16 שעות ב 22 ° C בעזרת אמבט מים בטמפרטורה מבוקרת.

יום 2: ציפוי של תאים Aplysia שקית

הכנה מרובה ליזין מצופה coverslips

  1. בשנת ספסל זרימה, להכין שלושה 35mm בצלחות פטרי כמו עבודה כלים לניתוח של הגנגליון, למלא אותם עם בינוני 4 L15-ASW מ"ל כל אחד. מעבירים את הגנגליון בטן מפתרון dispase לאחד את הכלים לעבוד אחרי 15.5 שעות של מערכת העיכול.
  2. בעזרת מלקחיים לקחת חומצה לניקוי # 1.5 coverslips (22x22 מ"מ) לאחסן אתנול, להסיר אלכוהול לעקר coverslips ידי בוער להם בקצרה על מבער בונזן. תנו להם להתקרר בקצרה לפני הצבת coverslips לתוך הכלים תרבות.
  3. הכנת ציפוי קצה מעוקל על ידי כיפוף קצה צהוב מעל מבער בונזן (להבה לזמן קצר בלבד, כדי למנוע התכה של פלסטיק!).
  4. הכן את הכמות המתאימה של 20 מיקרוגרם / מ"ל פתרון מרובה ליזין על ידי דילול 200 מיקרוגרם / מ"ל מניות פתרון סטרילי עם H 2 O ultrapure.
  5. כיסוי כל coverslip עם μl של 500 מיקרוגרם 20 / ml poly-ליזין דגירה במשך 20 דקות ב RT.
  6. לשטוף כל coverslip 3-5 פעמים עם 500 μl סטרילי H 2 O ultrapure כל אחד.
  7. הסר מים coverslips; למלא צלחת עם כל 4 מ"ל של מדיום L15-ASW תרבות.

דיסוציאציה של תאים בשקית

  1. תחת מיקרוסקופ לנתיחה, לחתוך את הגנגליון בטן במחצית מספריים לנתיחה ו מלקחיים באמצעות ניקה בעבר עם אתנול 95% (איור 1 שורה 1).
  2. על חצי אחד של הגנגליון, לחתוך בין אשכול תיק התא בתאי hemiganglion (1 איור קו 2), לחתוך שלוחות העצבים שנותרו בצד השני של תאים שק (איור 1 שורה 3). עבודה על חצי אחד של גנגליון בכל פעם; לעזוב את החצי השני בצלחת ואילו תאים אשכול הראשונים הם להיות מצופה.
  3. השימוש בשתי מלקחיים (או אחד מלקחיים ומספריים דיסקציה), תיק שחרור תא מצרר על ידי לחיצה בצד את מעטפת רקמת החיבור שסביב אשכול תא שקית. גזור משם רקמת חיבור במספריים לנתיחה במידת הצורך. היזהרו לא לסחוט ולגעת אשכול תא שקית יותר מדי במהלך תהליך זה.
  4. כאשר רוב רקמת החיבור מוסר, להעביר את bאשכול AG תא לצלוחית עבודה חדש עם קצה צהוב כפוף מוכן קודם לכן. היזהרו שלא להניח את האשכול תא שקית להיות לכוד בתוך קצה צהוב או תקוע ממשק האוויר / בינוני.
  5. Triturate אשכול עם קצה צהוב להסיר תאים תיק בודדים. לעשות זאת על ידי pipetting אשכול פנימה והחוצה של קצה. התחל עם כוחות גזירה נמוכים ולהגדיל כוח כנדרש. השתמש תמיד הכוח הנמוך ביותר הנדרש כדי להסיר את הנוירונים בלי להרוג תאים רבים מדי.
  6. איסוף 3-5 תאים בריאים שקית ולהעבירם צלחת עם coverslip poly-ליזין מצופה. הימנע להרים תאים מתים (הם שחור / שקוף במרכז) ופסולת רקמת חיבור.
  7. חזור על שלב 6. מקום על 15-25 נוירונים חיים למרכז coverslip כל אחד. אם תאים מתים או פסולת מועברים גם להסיר את החומר לא רצויות על ידי מרים אותו או לפוצץ אותו הרחק תאים בריאים. תהליך זה לוקח בערך 2-3 שעות אשכולות שניהם.
  8. פעם סיים לשמור את הכלים תרבות על הספסל תזרים לפחות 2 שעות RT כדי לאפשר לתאים לצרף (לשמור על הספסל את זרימת מפוח כדי למנוע רעידות לא רצויות).
  9. מניחים את הכלים לתוך באינקובטור ב 14 מעלות צלזיוס למשך הלילה, או עד לשימוש נוסף. קונוסים הצמיחה עשויה להתפתח 40-10 שעות.

באיור 1. סכמטי של הגנגליון californica Aplysia הבטן. קווי צבע לציין היכן לחתוך כדי להשיג תא אשכולות שקית.
באיור 1. סכמטי של הגנגליון californica Aplysia הבטן. קווי צבע לציין היכן לחתוך כדי להשיג תא אשכולות שקית.

יום 3: הגדרת תא הדמיה חיה של תאים Aplysia שקית

האסיפה של הדמיה קאמרית

  1. לפני השימוש בתאי שקית ניסויים הדמיה לחיות התא, לבדוק תאים על מיקרוסקופ כוח נמוך. אם התאים לא פיתחו קונוסים צמיחה בריאה, אספקת אמצעי לעזוב טריים ב RT במשך 1-2 שעות.
  2. כדי לספק צלחות עם המדיום L15-ASW טריים, להסיר וחצי (~ 2ml) של המדיום הישן עם קו ריק, ולהוסיף 2 מ"ל חדש L15-ASW בינוני לכל צלחת פטרי. חשוב לא להסיר לחלוטין את כל מדיום מן המנה בבת אחת, כמו זה יהיה להסיר תאים coverslip.
  3. עבור הדמיה תא שקית, אנחנו להרכיב two coverslips ושני מפרידי הפלסטיק בתא כריך דמוי הדמיה. Coverslip העליון הכריך הוא חתך קצר יותר, כדי לאפשר חילופי קל בינוני ריאגנטים. במהלך האסיפה, coverslips עם תאים בתיק המצורף צריך להיות שקוע בינוני L15-ASW בכל עת כדי למנוע מתאי פירוק.
  4. כדי להכין את החדר, לחתוך ~ 2 מ"מ מן הצד הימני של מ"מ coverslips # 1 22x22 עם יהלום עט (חותך זכוכית) השליט.
  5. באמצעות מזרק 1 מ"ל, למרוח משחה ואקום גבוה לשני הצדדים של coverslip הקצר, ולצרף מפרידי פלסטיק לכל צד. למרוח משחה ואקום לחלק העליון של מפרידי שניהם.
  6. היפוך coverslip והרכבה spacer, ואת המקום לתוך צלחת פטרי המכילה תאים תיק על coverglass. יישר ולחץ בעדינות עד מקל coverslip coverslip מלמעלה למטה עם סיום הפוכה של שני Q-טיפים.
  7. בעזרת מלקחיים, בעדינות להרים הרכבה כריך מתוך צלחת פטרי ללא המדיום דולף החוצה. יישור שתי coverslips, במידת הצורך, ולנגב את עודפי בינוני עם Kimwipe. מניחים את הכריך על החלק התחתון של מחזיק שקופיות מיקרוסקופ ולצרף את המכסה עם טיפול באמצעות קליפים.
  8. נקו את מרכז בצד העליון של כריך עם Q-טיפים טפחה על לניקוי זכוכית (Sparkle משמש לניקוי זכוכית). יבש במהירות את מנקה זכוכית עם השני, יבש Q-טיפ להימנע קווי פס. לעשות את אותו הדבר עבור coverslip התחתונה. Coverslips נקי ללא קווי פס חשובים הדמיה באיכות גבוהה.

תיק תאים המיקרוסקופ

מאז תא Aplysia שקית תרבויות עצביים נמצאים בצפיפות נמוכה, עדיף אם ההתקנה מיקרוסקופ שלך יש מיצוב הבמה פונקציות כדי להקל על המעבר בין התאים. תאים תיק יכולים להישמר בקלות במשך כמה שעות על הבמה RT במהלך הניסויים הדמיה. הבורסה בינוני מעת לעת, כדי למנוע אידוי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

תא Aplysia נוירונים תיק לספק סרום ללא מערכת העצבית עם תרבית תאים לא עצביים תאים בודדים. נוירונים אלה מהווים קונוסים צמיחה גדול מאוד מתאים לכתובת מספר שאלות חשובות תא ביולוגי. תא עצב תיק יכול בקלות להיות מניפולציות צילמו בטמפרטורת החדר במשך כמה שעות. באמצעות פלורסנט מיקרוסקופית רבב (FSM) אפשר כמותית לנתח את הפרמטרים השונים של אקטין-F ו פילמור microtubule ודינמיקה טרנסלוקציה. כלים אלה הדמיה יחד עם מידע שפורסמו לאחרונה הגנום Aplysia כמו גם טכניקות ביטוי משופר את הנוירונים האלה מערכת מודל עוצמה לחקר המנגנונים המולקולריים ו הסלולר של תנועתיות עצבי חרוט צמיחה והדרכה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

ברצוננו להודות ריאן Maneri (Oystercatcher Productions, LLC) עבור הצילומים ההליך שלנו רודני McPhail (מחלקת מדעי הביולוגיה, אוניברסיטת Purdue) לקבלת סיוע עם עריכת וידאו לנתיחה. מחקר במעבדה סוטר הוא נתמך על ידי מענקים מ-NIH (R01 NS049233) והמרכז Bindley Bioscience באוניברסיטת Purdue כדי DMS

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
#1 glass coverslips 22x22 mm Tool VWR international 48366067
#1.5 glass coverslips 22x22 mm Tool Corning 2870-22
35 mm Petri dishes Tool Falcon BD 353001
Filters for medium filtration Tool EMD Millipore SVGV010RS
High vacuum grease Tool Dow Corning 1597418
Osmometer Tool Wescor 5520
Plastic shims Tool Small Parts, Inc. SHSP-200
Calcium chloride Reagent Fisher Scientific C79-500
Gentamicin Reagent Invitrogen 15750-060
HEPES Reagent Sigma-Aldrich H4030
L15 medium Reagent Invitrogen 41300-039
L-glutamine Reagent Sigma-Aldrich G8540
Magnesium chloride Reagent Mallinckrodt Baker Inc. 5958-04
Magnesium sulfate Reagent Mallinckrodt Baker Inc. 6070-12
Poly-L-lysine (70-150 kD) Reagent Sigma-Aldrich P6282
Sodium chloride Reagent Mallinckrodt Baker Inc. 7581
Neutral Protease (Dispase) Reagent Worthington Biochemical LS02111

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Forscher, P., Kaczmarek, L. K., Buchanan, J. A., Stephen, S. J. Cyclic AMP induces changes in distribution and transport of organelles within growth cones of Aplysia bag cell neurons. J. Neurosci. 7, 3600-3611 (1987).
  2. Suter, D. M., Errante, L. D., Belotserkovsky, V., Forscher, P. The Ig superfamily cell adhesion molecule, apCAM, mediates growth cone steering by substrate-cytoskeletal coupling. J. Cell. Biol. 141, 227-240 (1998).
  3. Schaefer, A. W., Kabir, N., Forscher, P. Filopodia and actin arcs guide the assembly and transport of two populations of microtubules with unique dynamic parameters in neuronal growth cones. J. Cell. Biol. 158, 139-152 (2002).
  4. Suter, D. M., Schaefer, A. W., Forscher, P. Microtubule dynamics are necessary for SRC family kinase-dependent growth cone steering. Curr. Biol. 14, 1194-1199 (2004).

Comments

4 Comments

  1. to the Suter lab,  Excellent video protocol!Can you provide more detailed information on the signal transduction pathways you looked at in the Aplysia model using the RBI assay? Thank you!Daniel

    Reply
    Posted by: Anonymous
    February 20, 2008 - 7:58 PM
  2. Dear Daniel, Thank you for your comment. We have studied the role of Src tyrosine kinases in apCAM-mediated growth cone steering using the RBI assay (Suter and Forscher, ²001; Suter et al., ²004). Daniel Suter 

    Reply
    Posted by: Daniel S.
    March 13, 2008 - 9:35 AM
  3. Can you please provide me with a list of neuronal cell lines from Aplysia that can be used for memory related studies

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 21, 2009 - 11:40 PM
  4. Hi Shilpa,

    As far as I know there are no Aplysia neuronal cell lines available. In vitro studies in this system are done with primary neuronal cell cultures.

    Daniel Suter

    Reply
    Posted by: Anonymous
    December 22, 2009 - 3:17 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics