Dal MEF per Matrigel 2: hESC scissione dal MEF sul Matrigel

Per mantenere la coltura di cellule staminali embrionali umane, i terreni di coltura devono essere cambiati ogni 24 ore. Per fare ciò, inizia con un flacone di terreno di coltura per cellule staminali embrionali conservato a quattro gradi Celsius. Estrarre la quantità di soluzione necessaria, che di solito è di circa 20 millilitri per sei.

Preparare bene e mettere quella quantità in un tubo Falcon da 50 millilitri e scaldare il tubo con il contenuto a 37 gradi Celsius a bagnomaria. Una volta che il terreno è riscaldato, aggiungere l'FGF, che è stato conservato a quattro gradi Celsius a una concentrazione finale di 10 nanogrammi per mil. Assicurati di ricordarti di rimettere il calcio BFGF a quattro gradi Celsius subito dopo l'uso.

Assicurarsi che il BFGF nel terreno di coltura di cellule staminali amox umane sia accuratamente miscelato. Quindi, rimuovere tutto il terreno da ogni pozzetto lasciando circa 500 microlitri per pozzetto. Quindi, aggiungere tre millilitri di terreno fresco a ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti e rimettere la piastra nell'incubatore.

Ora che ti abbiamo mostrato come mantenere le cellule staminali embrionali umane ONM, ti mostreremo come trasferirle al matrigel. Per dividere le cellule staminali embrionali umane coltivate in matrigel, iniziamo con una piastra Cofluent a sei pozzetti di cellule staminali su mes, che può essere divisa uno a due o uno a tre su matrigel. Piastre a sei pozzetti.

Ciò consentirà ai pozzi di tornare confluenti quattro o cinque giorni dopo la scissione. Quando si dividono le cellule staminali embrionali umane su matrigel, utilizzare terreni di condizione di metanfetamina per mantenere la pluripotenza I mezzi condizionati con metanfetamina vengono prodotti in anticipo. Questo viene fatto raccogliendo il terreno, che viene integrato con cinque nanogrammi per mil BFGF da una coltura di metanfetamina in crescita ogni giorno per sette giorni, il terreno di cellule staminali embrionali viene utilizzato per sostituire il terreno condizionato con metanfetamina rimosso.

Ogni giorno. I terreni condizionati con metanfetamina devono essere utilizzati per un massimo di un mese dopo la raccolta e la conservazione congelata. Il giorno prima della scissione delle cellule staminali embrionali umane, spostiamo le aliquote di matrigel nelle provette EOR da meno 20 gradi Celsius a quattro gradi per scongelarle durante la notte.

Un'aliquota contiene due milligrammi di gel matri, che è la quantità necessaria per un sei. Pozzetto piastra. Il giorno della scissione, prelevare una fiala di gel matri scongelato.

Per ogni sei, impiattare e mescolare ogni fiala con sei millilitri di terreno D-M-E-M-F 12 freddo. Ricordati di tenerlo in ghiaccio. Aggiungere un millilitro di soluzione a ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti.

Quindi agitare la piastra per distribuire il matrigel sulla superficie e incubare la piastra ricoperta di matrigel a temperatura ambiente per almeno un'ora prima di dividere le cellule staminali embrionali umane. Prima di dividere le cellule staminali embrionali umane, lavare le cellule staminali su MES una volta con un XPBS pH 7.4. Quindi, aggiungi un millilitro di collagenasi calda quattro a un milligrammo per mil a ciascun pozzetto per i pozzetti che stai dividendo, quindi incuba la piastra a 37 gradi Celsius per 5-10 minuti.

Dopo l'incubazione, aggiungere un millilitro di terreno di coltura di cellule staminali embrionali senza BFGF A ciascuno, utilizzare una pipetta da un millilitro per soffiare le cellule staminali dalla piastra. Raccogli tutti i terreni contenenti grumi di cellule staminali e mes morti in una provetta da 15 millilitri. Lascia che grandi grumi di cellule si depositino per cinque minuti in modo che i grumi di cellule staminali formino una pallina sul fondo del tubo mentre i mes rimangono sospesi nello snat.

Una volta che le cellule sembrano essersi depositate, scartare il surnatante e lavare le cellule sospendendo nuovamente il pellet di cellule staminali embrionali. Utilizzando terreni di coltura con cellule staminali embrionali senza BFGF, centrifugare successivamente a temperatura ambiente a 200 volte G per cinque minuti. Mentre le cellule girano, possiamo preparare le piastre matrigel per la placcatura con cellule staminali lavando le piastre con D-M-E-M-F 12 a temperatura ambiente a un mil per pozzetto e aggiungendo 2,5 millilitri di terreno condizionato integrato con 10 nanogrammi per mil.

BFGF per pozzetto dopo centrifugazione. Sospendere il pellet in un volume appropriato di mezzo condizionato con metanfetamina integrato con 10 nanogrammi per mil. BFGF, pipettare più volte la sospensione cellulare su e giù fino a quando i grumi diventano uniformi e di piccole dimensioni.

Quindi, aliquotare la sospensione a 0,5 millilitri per pozzetto sulla piastra matrigel per ottenere tre mil per pozzetto come volume finale. Per il matrigel, usiamo una densità di colonie più alta rispetto alla normale divisione in matematica una volta che le cellule sono state aggiunte. Posizionare la piastra in un incubatore per colture tissutali a 37 gradi Celsius.

Per mantenere le cellule staminali embrionali umane in condizione di matrigel meth. Terreni integrati con 10 nanogrammi per mil. Il BFGF viene cambiato ogni 24 ore per un massimo di quattro o cinque giorni.

cellule staminali embrionali umane sono solitamente contaminate con quantità residue di MEF dopo la prima scissione su matrigel, la seconda scissione da matrigel a Matrigel rimuoverà completamente qualsiasi traccia di cellule feeder che contaminano la coltura di cellule staminali.