Geração de transgênicos Estável C. elegans Usando microinjeção

Published 8/15/2008
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Biology

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Summary

Este vídeo demonstra a técnica de microinjeção no gônadas de C. elegans para criar animais transgênicos.

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Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection. J. Vis. Exp. (18), e833, doi:10.3791/833 (2008).

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Abstract

Elegans Caenorhabditis transgênicos podem ser facilmente criados através de microinjeção de uma solução de DNA plasmidial para o 1 gonadal. O DNA plasmidial se reorganizam para formar concatamers extracromossómicos que são herdados de maneira estável, embora não com a mesma eficiência como cromossomos reais 2. Um gene de interesse é co-injetado com um marcador fenotípico óbvio, como rol-6 ou GFP, para permitir a seleção de animais transgênicos sob um microscópio de dissecação. O gene exógeno pode ser expressa de seu promotor nativo para estudos de localização celular. Alternativamente, o transgene pode ser conduzido por um promotor diferentes tecidos específicos para avaliar o papel do produto do gene em que determinada célula ou tecido. Esta técnica eficiente drives expressão do gene em todos os tecidos de C. elegans, exceto para o embrião ou início de linha germinal 3. Criação de animais transgênicos é amplamente utilizado para uma série de paradigmas experimentais. Este vídeo demonstra o processo de microinjeção para gerar vermes transgênicos. Além disso, a seleção e manutenção de transgênicos estável C. elegans é descrita linhas.

Protocol

Construção expressão Plasmid

Dois plasmídeos são necessários: um para o tecido-específicos a expressão do gene de interesse e um segundo como marcador de transformação selecionáveis.

Experimental Plasmid

  1. Selecione um promotor que se expressa no tipo de tecido / células de interesse, por exemplo, um nervo ou músculo-específicos promotor. Se uma é a de expressar genes múltiplos dentro do mesmo tecido, uma fita cassete promotor plasmídeo no sistema Gateway (Invitrogen) pode ser usado. Esta abordagem permite a inserção de qualquer gene de interesse a jusante do promotor por 4 a clonagem recombinational. Geralmente, 2-5 kb de sequências a montante é suficiente para ter expressão correta e precisa.

  2. O cDNA do gene de interesse pode ser clonado de duas maneiras:
    1. Clonagem convencional, usando enzimas de restrição.
    2. Para clonagem Gateway, que é amplificado PCR usando primers que contêm o Gateway att seqüência B recombinational. O cDNA amplificado é primeiro recombinados no pDONR201 vetor doador para criar o vetor de entrada e depois transformado em E. coli DH5a tensão. Após a selecção de recombinantes de sucesso e mini-prep isolamento de DNA, o vetor de entrada é recombinados no vetor destino promotor contendo para criar a expressão plasmídeo. Detalhes sobre a clonagem recombinational estão disponíveis a partir de qualquer manual de gateway da Invitrogen ou em Caldwell et al. 5.

Marcador selecionável Plasmid

Exemplos de plasmídeos marcador transgênicos incluem rol-6 ou o uso do promotor de parede muscular do corpo unc-54 para dirigir a expressão da proteína fluorescente. Estes plasmídeos marcador normalmente estão disponíveis dentro da comunidade de pesquisa, mediante solicitação.

Microinjeção de C. elegans

Preparação

  1. Realizar o isolamento do DNA dos dois plasmídeos que estão a ser injetado. Quantificar-los e misturar na proporção de 1:1 de 50 ng / mL cada.

  2. Prepare almofadas agar:
    1. Faça uma solução de 2% agarose em água, calor ou microondas até dissolver.
    2. Estabelecidos vários 22 x 50 mm na tampa óculos de uma bancada.
    3. Com uma pipeta Pasteur, colocar uma gota do agarose derretida em uma tampa de vidro e coloque imediatamente uma tampa de vidro, o segundo sobre a queda em um ângulo de 90 com o primeiro. Repita o procedimento para vários copos cobrir outro. O diâmetro do disco achatado de agarose deve ser entre 15-20 mm.
    4. Após a agarose solidificou (este só tem momentos), retire a tampa de vidro e permitir que a almofada de ar para secar completamente (várias horas durante a noite).
    5. Armazenar os blocos em uma caixa de vidro da tampa à temperatura ambiente.

  3. Faça carregadores de agulha para a solução de DNA:

    Carregadores de agulha são criados a partir de 100 l tubos capilares que são aquecidas no meio sobre uma flama aberta e rapidamente puxado para cerca de duas vezes o seu comprimento. As duas metades são agarrados à parte uma vez que o tubo capilar esfria. Estoque 10-20 carregadores agulha para a injecção. Guardar na posição vertical em um rack tubo de microcentrífuga. Tenha cuidado para não empalar-se nos pontos.

  4. Faça agulhas microinjeção:

    A agulha é feita a partir de um tubo especial capilar que contém um filamento de vidro interno; este filamento serve como um pavio para a solução de DNA. Essas são puxados em uma máquina de agulha extrator. Nós usamos um Narishige PP-830 com uma configuração extrator de calor de 24,8. Agulhas diversas são puxados em um momento e são armazenadas em uma pequena caixa de plástico. Várias agulhas podem ser facilmente "montado" em uma tira de massa de modelar para armazenamento de longo prazo.

  5. Ponta da agulha "breakers":

    A ponta da agulha microinjeção é puxado tão fina que é realmente fechado para ele final e deve ser quebrado usando cacos de vidro pequena tampa. Estes são preparados por um embrulho 18 x 18 mm de tampa de vidro um papel toalha e gentilmente aplicando pressão até que quebre em vários pedaços. Fragmentos de um tamanho útil é de aproximadamente 3 x 4 mm.

  6. Crescer tipo selvagem (N2) worms para a fase adulta cedo para injeção usando procedimentos padrão 6. Prepare corretamente cerca de 100 encenou worms / construir injetado.

Procedimento

  1. Abra a válvula principal em um tanque de hélio que está conectado a um braço e agulha microinjeção titular. Fechar a válvula reguladora para permitir que o gás entrar na linha, trazendo a pressão para 35 psi. Observe que o gás pode ser liberado através de um pedal.

  2. Inserir uma agulha em um carregador de tubos padrão boca pipeta (encontrado em embalagens de tubos capilares de vidro) e elaborar uma pequena quantidade da mistura de plasmídeo (~ mL 1).

  3. O carregador de agulha é cuidadosamente colocada na extremidade traseira de uma agulha de injeção e gentilmente inserido todo o caminho até o comprimento dea agulha até sentir resistência. Expulsar a solução de DNA por soprando suavemente, em seguida, retire o carregador.

  4. Inserir a agulha no braço microinjeção, tendo o cuidado de colocá-lo dentro da junta de borracha pequena interna.

  5. Coloque um pedaço de agulha quebra de vidro da tampa sobre uma extremidade de um bloco de ágar. Cobrir o shard, bem como toda a superfície do pad agar, com o petróleo halocarbonos. Coloque o bloco de ágar no palco de um microscópio invertido.

  6. Posição da agulha no centro do campo de visão usando o objetivo de 4X e iluminação de campo claro, mas ainda não diminuí-lo para o óleo. Além disso, a posição da borda interna do caco de vidro no centro da capa, então o foco sobre ele (ainda usando objetivo 4X). Abaixe a agulha no petróleo, trazendo-o no mesmo plano focal como o caco de vidro da tampa. Elevar a ampliação mudar para a objetiva de 40X. Recentrar na borda do fragmento e reposicionar a ponta da agulha, se necessário.

  7. Para abrir a ponta da agulha de injeção, cutucar gentilmente a agulha contra a borda da tampa de vidro caco, enquanto ao mesmo tempo, a aplicação de um pulso curto de gás através do pedal. A agulha vai ser suficientemente arrombado quando pequenas gotas de líquido escapar da ponta da agulha. Fluxo de líquido em excesso, devido à abertura de uma muito grande não é desejável, uma vez que irá matar os animais.

  8. Remover o bloco de ágar do palco, levantando a agulha para cima, mas não altere a X ou eixo Y posição. Deslize o estágio de baixo da agulha, retire o bloco de ágar e colocá-lo em um microscópio de dissecação. Transferência de um worm para o bloco, abaixo da superfície do óleo. Se o verme se contorce, gentilmente acariciá-lo até que o bloco de contatos agar. O worm úmido devem aderir ao agarose seca.

  9. Injeção
    1. Colocar rapidamente as costas pad agar para o palco, centrando o worm no campo de visão.
    2. Abaixe a agulha no mesmo plano de foco como o worm.
    3. Mudar os filtros para Hoffman Iluminação (um tipo de filtro de contraste). Isso permite que os detalhes morfológicos do verme para se tornar visível. Se Nomarski / DIC óptica estão disponíveis no âmbito invertido que vai funcionar tão bem. Usando a objetiva de 40X, o foco no centro de "granulado" sincicial da gônada worm, abaixo do padrão de "favo de mel" dos núcleos germinativas (escolher qualquer das gônadas é posicionado no lado do worm enfrentar a agulha).
    4. Afinar a posição da agulha até que a ponta também está em foco (o mesmo plano que o "grão" gônadas).
    5. Insira cuidadosamente a agulha no centro da gônada e aplicar um breve pulso de pressão de gás para expulsar uma gota ou duas de DNA no braço gonadal. Você deve observar uma onda de propagação de líquido através da gônada distal. Não assuma mais líquido é melhor, desde muito líquido pode fluir para dentro da curva proximal do braço gônadas, o que pode encerrar a produção de oócitos. Se possível, dependendo da posição do worm, injetar o braço gônadas outros da mesma maneira.
    6. É importante trabalhar rapidamente, enquanto a injeção de um worm, pois ele pode facilmente desidratar. A decisão de injetar o braço gônadas segunda é dependente de como rapidamente você pode re-posicionar a agulha e worm. Todo o processo devem, idealmente, ter menos de 1-2 minutos.

  10. Remova a tampa de vidro do palco e colocá-lo em um escopo de dissecação. Aplicar 1μl de tampão M9 (22mm KH 2 PO 4, 42mm Na 2 HPO 4, NaCl 85mm, 1mM MgSO 4) diretamente sobre o worm injetado (isso implicaria submergindo a ponta da pipeta abaixo da superfície do óleo halocarbonos). O buffer deve hidratar o worm, que então flutuam na superfície pad agarose. Transferir o worm para um prato regular usando uma picareta worm. A almofada de agarose podem ser reutilizados várias vezes mais até que ela se tornou muito saturado com tampão e os vermes já não aderir.

Seleção de transgênicos

  1. Worms injetada, a P 0 geração, são transferidos para nova individuais, placas de bactérias semeadas (60 mm) e permissão para reproduzir. Normalmente, os animais injetados são incubados a 20 ° C por 2-3 dias até que os filhotes aparecem.

  2. A F 1 filhos são observados para a evidência do marcador de transgênicos (como fluorescência) usando um estereomicroscópio fluorescente. Cada operadora, fluorescente F 1, animal clonado é separado em um prato novo (já que a prole de cada F 1 são considerados uma linha distinta). A F 1 hermafroditas têm permissão para se reproduzir. Novamente, isso é normalmente realizada em menos 20 ° C por 2-3 dias até que os filhotes aparecem.

  3. A geração F 2 é observado para os animais transgênicos também. F 2 animais que herdaram e expressar a matriz transgênicos são considerados uma linha de "estável".

    NOTA: No 1 º Fidade pode haver muitos animais transgênicos, mas eles não são estáveis. A maioria dos animais transgênicos F 1 não serão propagadas em F 2 linhas estável.

    NOTA: Para controlar a variabilidade no número de cópias do gene, gerar um mínimo de três linhas independentes estável por construir injetado.

  4. Cada linha independente e estável deve ser mantida como uma linha separada de vermes. Cada linha pode ser propagada através da transferência de vários animais transgênicos para um prato novo a cada geração, o que deve ser realizada em um estereomicroscópio fluorescentes se o marcador selecionável é fluorescente.

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Discussion

Ao fazer este procedimento, é importante lembrar-se de:
- Injectar directamente no centro da gônada
- Não injetar muito líquido
- Trabalhar com rapidez para evitar dessecação.

Se você tiver problemas com a agulha, tal como ela é quebrada muito grande, o melhor é remake de uma agulha fresco, ao invés de tentar injetar com menos de agulha ideal.

A geração de worms transgênico tem muitas aplicações, tais como:
- Identificação de genes mutantes, no método chamado de resgate de transformação
- Mapeamento de domínios de proteínas através da expressão de proteínas truncadas
- Caracterização do papel de um gene em processos celulares e da doença.

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Acknowledgements

Gostaríamos de agradecer o espírito cooperativo de todos os membros Caldwell Lab. Pesquisa distúrbios do movimento no laboratório tem sido apoiado pela distonia Bachmann-Strauss & Parkinson Foundation, Parkinson United Foundation, Parkinson Disease Association americana, doença de Parkinson Associação de Alabama, a Michael J. Fox Foundation for Research de Parkinson, e um de Iniciação Científica.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Agarose Ultrapure Invitrogen 15510-027
Halocarbon Oil, Voltalef Hulle 10S elfatochem, France
Coverglass 18x18 mm Fisher Scientific 12-548-A
Coverglass 20x30 mm Fisher Scientific 12-548-5A
Coverglass 22x50 mm Fisher Scientific 12-545-E
100 ul Capillary VWR international 53432-921
Glass Capillary for Needles "Kwik-Fil" World Precision Instruments, Inc. 1B100F-4
Needle Puller Tool Narishige International Model PP-830
microINJECTOR System Tritech Research, Inc. MINJ-1000 Scope, Stage, Manipulator
Dissecting, with Fluorescence Microscope Nikon Instruments SMZ800
Dissecting Microscope Nikon Instruments SMZ645

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stinchcomb, D. T., Shaw, J. E., Carr, S. H., Hirsh, D. Extrachromosomal DNA transformation of Caenorhabditis elegans. Mol. Cell. Biol. 5, 3484-3496 (1985).
  2. Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences. EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).
  3. Kelly, W. G., Xu, S., Montgomery, M. K., Fire, A. Distinct requirements for somatic and germline expression of a generally expressed Caenorhabditis elegans gene. Genetics. 146, 227-238 (1997).
  4. Cao, S., Gelwix, C. C., Caldwell, K. A., Caldwell, G. A. Torsin-mediated neuroprotection from cellular stresses to dopaminergic neurons of C. elegans. J Neurosci. 25, 3801-3812 (2005).
  5. Caldwell, G. Integrated Genomics: A Discovery-Based Laboratory Course. John Wiley and Sons. West. Sussex, England. (2006).
  6. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).

Comments

11 Comments

  1. Dear Dr. Laura A,   I am very much interested to work with you as a Researcher. Regarding myself, I would like to inform you that I did my Ph.D. degree from the Faculty of Science, Hiroshima University, Japan. I completed my M.Phil. M.Sc. and B.Sc. (Honours) degree from the University of Rajshahi, Bangladesh. Now I am working on toxic response and behavior of C. elegans as a postdoctoral researcher at Pusan National University, S. Korea.    I would be glad if you would kindly accept me as a Researcher in your Laboratory and provide me a fellowship or any financial support.   I look forward to your kind reply at your earliest convenience.   With best regards   Sincerely yours, Dr. M. Golam Mortuza Present Address Postdoctoral Researcher Lab of Ecology and Behavior System Division of Biological Sciences Pusan National University Busan 609-735, S. Korea E-mail: mortuzaru@yahoo.com   Permanent Address Professor Department of Zoology Rajshahi University Rajshahi 6²05, BANGLADESH E-mail: mortuza@ru.ac.bd

    Reply
    Posted by: Anonymous
    April 15, 2009 - 2:41 AM
  2. Hi, i am learning microinjection in C. elegans and am having problems recovering the worms.  They seem to recover fine initially and are thrashing around in the buffer on the plate, but after a day when I look back they have all died on the plate where they were placed.  I don't know what is wrong, do you have any suggestions? Thanks. Jane

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 22, 2009 - 1:57 PM
  3. Dear Jane,
    Death post injection is likely from two causes. The first is that the worms spent too much time stuck down on the agar pad before being hydrated off. Often they will be alive (barely) but then die. Reducing the time they spend stuck down will stop this source of death. As you become more adept and quicker with the process this will improve. The second cause of post injection death is from the worm getting stabbed too much- either from being injected in the wrong place (intestine), being injected too deeply (the &#x²01C;shish-kabob&#x²01D; mistake) or using too big of a needle. Often one can tell if this is the problem when the next day the injected worm has exploded out its guts. Make sure you are using a very tiny, fine tip in the needle and only barely enter under the cuticle into the gonad. Again these will improve with practice.

    One last thought- when you transfer the worm from the injection pad to the plate sometimes oil comes along with it. Gently move the worm out from the oil droplet onto the food. This will help it recover.
    Good luck!

    Laura

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 26, 2009 - 1:18 PM
  4. Hi Laura,
    Thanks so much for replying to my message. I think my problem is that I am always injecting in the wrong place. Occasionally they explode after injection, in which case I know I have injected too much or stabbed too much. My needle is very fine and is penetrating quite easily but only every once in a while dŒs it look like I have hit the gonad. I am trying to line it up so that I can see the nuclei on either side, but I still seem to miss most of the time. It mostly seems to be in the body of the worm. Do you have any tips for how I can improve my accuracy of hitting the gonad?

    Reply
    Posted by: Anonymous
    May 28, 2009 - 3:20 PM
  5. Dear Jane,
    I was trying to figure out how to help you visualize exactly where to inject. Here are some additional pointers and details from the video.

    I discuss how the dead center best spot for injecting is in the grainy interior of the gonad. Depending on your optics this may be very faint and hard to see. This graininess is like sand compared to the &#x²01C;pebble&#x²01D;-like appearance of the intestine. The gonad interior has also been described as a fine &#x²01C;velvetly&#x²01D; texture.

    If you go back and watch the video at time 8:08 that worm is a little too dry- see how the embryos (which don&#x²019;t dry out) are standing out more.
    In frame 8:²7 a nice view of the gonad with the arrow is shown. You can see an impression of the germ nuclei, but the &#x²01C;graininess&#x²01D; isn&#x²019;t too visible.
    Starting at 8:4² there is also a nice view of the animal and its major features. The lower left portion curving up towards the left is intestine. On the upper side moving towards the right are oocytes from the distal arm of the gonad. In the middle, between the oocytes and the intestine, lies a view of the proximal gonad exactly where it should be injected. At 8:53 the needle seems to be positioned correctly but what you see upon injection is the oocytes expanding outward, indicating that the needle tip wasn&#x²019;t positioned properly.
    At 9:06 shows a perfect gonad hit.

    Also, I try (if possible) to position the worm such that I am injecting closer to parallel to the worm rather than perpendicular to it. The force needed to puncture the cuticle when coming in at a 90o angle to the long axis of the worm is higher and results in a greater chance of going through into the intestine or even &#x²01C;shish-kabob&#x²01D;. I usuall try to position the worm and the needle at 15-30o angles to each other. For example see 8:53 & 9:06 (preferred) vs 8:57

    Hope these will help you.
    Laura

    Reply
    Posted by: Laura B.
    June 15, 2009 - 11:47 AM
  6. Hello!

    I am currently designing an automated system for c.elegans injections that involves circulating worms through microchannel in a PDMS chip and positioning them for injection from a microneedle. One of the important aspects of our design is to fabricate microneedles which can more easily puncture the worm's cuticle due to smaller needle size.

    However, we have been unable to find any reference, print or electronic, that has measured the force needed to puncture the worm. This force is important in choosing how thin our needles can be, and of course the force dŒs vary with needle tip size. We may need to experimentally determine this "puncture strength" ourselves as the first to ever do so, but I am wondering if you might know of anyone who has measured similar parameters that we can at least get a ballpark place to start.

    Thanks so much!

    -- Andrew

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 22, 2009 - 5:52 PM
  7. Andrew,

    We are not aware of the type of precise information on puncture strength or penetration forces required for C. elegans, as we are molecular biologists, but your question reminded me of a method I remembered (and once tried without success) from the late 1990s. The technology you describe is likely much improved or can be. Check out this paper and maybe contact the authors regarding your question.

    Genetic transformation of nematodes using arrays of micromechanical piercing structures.
    Hashmi S, Ling P, Hashmi G, Reed M, Gaugler R, Trimmer W.
    Biotechniques. 1995 Nov;19(5):766-70.

    Best of luck with your experiments. If you are ever interested in us to beta-test something as collaborators, please let us know.

    Guy

    Reply
    Posted by: Anonymous
    November 22, 2009 - 8:38 PM
  8. Hello,

    I am currently trying to inject double stranded DNA as an alternative approach to do tissue specific knockdown. I am following a protocol in which DNA sense and antisense fused to tissue specific promoter are injected together with a marker. According to the protocol, I should inject the PCR product directly and at the concentration of 100 ng/ul. However, when I injected this mixture into the gonad, most of the worms don't survive more than one day, which is not the case with the normal injection for generating the transgenic line.

    DŒs someone have any experience with this and can suggest me something that I should change or incorporate in my protocol to make the injection work?

    Thanks before,
    Yemima

    Reply
    Posted by: Anonymous
    June 6, 2011 - 12:21 PM
  9. We would like to start doing microinjections in our lab and I am would like to know where you acquired the halocarbon oil. In the Wormbook microinjection protocol, Series 700 Halocarbon oil from Halocarbon Products in NJ was used. Do you know how this compares to the Voltalef halocarbon oil that you used?

    Thank you very much for your help and for the wonderful instructional video!

    -Erin

    Reply
    Posted by: Erin M.
    March 13, 2013 - 1:40 PM
  10. Dear Erin,
    We no longer can get the Voltalef oil and have too switched to using Halocarbon oil 700 (but ours is from Sigma). It is a bit thinner than the Voltalef, but it works as well, if not even a little better. Glad you like the video. Good luck with the injections. --Laura

    Reply
    Posted by: Laura B.
    March 13, 2013 - 2:59 PM
  11. Thank you so much!

    -Erin

    Reply
    Posted by: Erin M.
    March 17, 2013 - 11:51 AM

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