Дважды Всего горе на месте гибридизация раннего куриных эмбрионов

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Это видео демонстрирует, 2-цветный целом монтировать на месте гибридизация, метод, которым пространственной и временной экспрессии в 2 разные гены могут быть визуализированы в молодых куриных эмбрионов. Этот метод впервые был введен Дэвид Уилкинсон, Домингос Энрике, Фил Ингам и Дэвид Иш-Horowicz.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Psychoyos, D., Finnell, R. Double Whole Mount in situ Hybridization of Early Chick Embryos. J. Vis. Exp. (20), e904, doi:10.3791/904 (2008).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Куриного эмбриона является ценным инструментом для изучения раннего эмбрионального развития. Его прозрачность, доступность и легкость манипуляций, делают его идеальным инструментом для изучения экспрессии генов в мозге, нервной трубки, сомитов и формирование зачатков сердца. Это видео демонстрирует различные этапы в 2-х цветный целом монтировать на месте гибридизации; Во-первых, эмбрион расчлененное из яйца и зафиксирована в параформальдегида. Во-вторых, эмбрион обрабатывается для prehybridization. Эмбрион, то гибридизированных с двумя различными датчиками, один связан с DIG, а один связан с FITC. После ночи гибридизации, эмбрион инкубировали с антителами DIG связаны. Цветная реакция на подложке DIG выполняется, и область интереса появляется синий. Эмбрион затем инкубировали с FITC связанных антител. Эмбриона обрабатывается для цветной реакции с FITC, и область интереса появляется красное. Наконец, эмбрион является фиксированной и обработаны для phtograph и секционирования. Руководство по устранению неисправностей также представлен.

Protocol

Часть 1: Крепление эмбрионов

  1. Заполните рассечение блюдо с ледяной DEPC-би-эс. Держите на льду. Открытое яйца, нажав оболочки щипцами и удалить оболочку штук.
  2. Удалить толстые альбумина щипцами. Tilt желточного мешка с грубыми щипцами, чтобы эмбрион лица вверх.
  3. Использование ножницы, разрезать квадрат желточного мешка вокруг эмбриона.
  4. Использование ложкой, удалить эмбрион с желтком и поставьте на лед холодной DEPC-би-эс.
  5. Под микроскопом, удалите мембраны и желток и трансфер в фиксации блюдо.
  6. Pin вниз, удалить DEPC-би-эс. Заменить на 4% PFA в DEPC-би-эс и исправить O / N при 4 ° C.
  7. Удалить фиксатором. Замените ледяной DEPC-би-эс. Использование тупым концом иглы или микрокапиллярных микродиссекции нож, перфорировать нервной системы и полостей сердца, чтобы предотвратить захват зонда.
  8. Вымойте 2x 10 млн. DEPC-PBS с 0,1% Твин-20 (PBT). Дегидрировать 10 млн. каждый на 25%, 50%, 75% метанола в PBT. Дегидрировать эмбрионов два раза в 100% метанола. Хранить при температуре от -20 ° C в метаноле.

Часть 2: Prehybridization

  1. Увлажняет эмбрионов 10 млн. каждый на 75%, 50% и 25% метанола в PBT. Вымойте 2x 10 млн. в PBT.
  2. Между тем, готовить ледяной фиксатор (4% параформальдегида в PBT). Замените PBT с протеиназы К решению (3 мл / флакон; [? 5 г / мл] финала в PBT). Убедитесь, что весь флакон подвергается решение протеиназы К, осторожно вращая флакон, см. Поиск и устранение неисправностей для экспозиции.
  3. Использование РНКазы свободной пипетки Пастера удалить протеиназы К и добавить фиксатор (2 мл). Сразу же место на льду ровно 20 млн.
  4. Все РТ моет выполняются на nutator. Вымойте 2x 10 млн. в PBT, и 1x 10mn в PBT, содержащей 50% гибридизации буфера.
  5. Вымойте 1x в гибридизации буфера. Инкубировать при 65 ° С в 2 мл буфера для гибридизации 4-5 часов.

Часть 3: гибридизации эмбрионов с зондами

  1. DIG и FITC связанных зонд синтез описан в Приложении. Зонд должны дать сильный сигнал, должно быть synhesized с FITC-содержащих нуклеотидов; слабее зонд должен быть синтезирован с с DIG-содержащих нуклеотидов.
  2. Prewarm зондов при гибридизации буфер (500 нг / мл) с использованием 2 мл флакон. Незамедлительно заменить гибридизации буфер с зондом решение. Не позволяйте эмбрионов сухой. Инкубируйте в течение 16 ч при 65 ° C.
  3. Замените датчик с гибридизации буфер, 2 мойки, 30 млн. каждый при температуре 65 ° C. Вымойте 15 млн. в буфере гибридизации / MABT (1 / 1 о / о /) при 65 ° C.

Часть 4: DIG инкубации антитела и цветной реакции

  1. Вымойте 2x20 млн. в MABT. Промыть 1 час в 2% BBR / MABT. Вымойте 5 часов в 2% BBR/20% HISS / MABT (блокирующего буфера). Инкубируйте в 1:2000 DIG антител разводят в блокирующем буфере, O / N при температуре 4 ° С на nutator.
  2. Вымойте 3x 10 млн каждый в MABT, и 3-кратным 1 час каждый в MABT.
  3. Вымойте 2x 20 млн. в NTMT. Добавить 200ul НБТ / BCIP подложки до 10 мл NTMT. Немедленно удалите из флакона NTMT и заменить 1-2 мл НБТ / BCIP буфера. Место в темноте. Монитор цветной реакции после 20 млн, а на 20 млн интервалами в дальнейшем.
  4. После цветной реакции (должен появиться синий), умойся в PBS в течение 10 мин, придавить на фиксацию блюдо заполнено PBS, и заменить решение с 4% PFA в PBS. Fix O / N при 4 ° C.
  5. Переезд в новый флакон сцинтилляции. Стирать в PBST (PBS с 1% Твин-20) 2х10 мин. Стирать в MABT 2x 10 мин.
  6. Инкубируйте в MABT 30 млн. на 63 ° C.

Часть 5: FITC инкубации антитела и цветной реакции

  1. Вымойте 2x 10 млн. в MABT, 1 час в 2% BBR / MABT, 5 часов в блокирующем буфере
  2. Инкубируйте в щелочной фосфатазы связью анти-FITC-антител (1:500) O / N при 4 ° C.
  3. Вымойте 3x 10 млн каждый в MABT, и 3-кратным 1 час каждый в MABT.
  4. Стирать в 2x 20 млн. в TBS рН 8,45 с 0,1% Твин-20 (TBST).
  5. Подготовка векторного Красной рабочего раствора (5 мл) в TBST с использованием реагентов 1,2 и 3 представлены в комплекте. Немедленно удалите из флакона TBST и заменить с буфером Векторный Red. Место в темноте. Монитор цветной реакции после 40 млн., а на 30 млн интервалами в дальнейшем.
  6. После цветной реакции (должны появиться красные), трансфер эмбрионов PBS.

Часть 6: фиксации и обработки

  1. Трансфер в фиксации блюдо с PBS, и исправить в 4% PFA в течение 20 мин при комнатной температуре или O / N при 4 ° C.
  2. Стирать в PBS, 2x 10 мин. Для обработки для фотографии, трансфер в 20% глицерина в PBS (это сделает эмбрионов полупрозрачные). Чтобы создать камеру, вырезать 2 полоски ленты ПВХ, наложить их на слайде. Сокращение площади в центре с помощью ножа. Снять квадратные использованием щипцов.
  3. Чтобы обработать воском для секционирования, трансфер обратно в PBS, мыть 2x 10 млн., обезвоживают в градуированных серии метанола (25%, 50%, 75% и 100% в ФСБ, 10 млн каждый).
  4. Замените пропанол, 3mn. Замените 1,2,3,4-тетрагидронафталина, 20 млн. следуют Histoclear (2x 1 час). Замените histoclear / воск 1 / 1 (об / об) 60 ° С в течение 1 часа. Замените воском процесспо гистологии.

Часть 7: Решения

Гибридизация буфер, хранят при температуре -20 ° С в Сокол, 50 мл: 25 мл формамида; 3,25 мл (20xSSC), 0,5 мл (0,5 М ЭДТА), 1 мл (10% Твин-20); 2,5 мл (1% SDS) ; 125 UL (20mg/ml тРНК);. 100 мкл (50 мг / мл гепарина) MABT, подготовить 100mM малеиновой кислоты, рН до 7,5 NaOH гранул. Добавить 150 мМ NaCl и 0,1% Твин-20.

NTMT (сделанные непосредственно перед использованием), 50 мл: 1 мл (5М NaCl), 2,5 мл (2 М Трис-HCl pH9.5); 1,25 мл (2M MgCl 2), 5 мл (10% Твин-20).

TBST: 0,1 М Трис-HCl, 0,15 М NaCl, рН 8,45, 0,1% Твин-20.

Часть 8: Поиск и устранение неисправностей

Проблема Вызывать Средство
Эмбриона, свернувшись калачиком Недостаточное дегидратации / регидратации Поддерживать 10 млн. промежутки времени в течение последовательных дегидратации / регидратации шаги
Существует нет сигнала датчика Зонд деградированных загрязнения РНКазы во флаконе Выполнить зонда на 1% агарозном геле Убедитесь, что весь флакон подвергается решение протеиназы К в шаге 2
Зонд этикетки полостей сердца нервной трубки Зонд в ловушке В шаге 2, чтобы убедиться, что все полости перфорированы использованием микродиссекции ножом или микрокапиллярных
Эмбрион распался следующие гибридизации (шаг 3) Протеиназы К шаг влево слишком долго Гибридизация слишком высокая температура Протеиназы К не следует оставлять более 1 миллиона (стадии 3 + и 4), 2 млн. (этап 5 до 7), 3 млн (стадия 8-10), 4 млн (стадии 11-13) Не гибридизации при Т о высших чем на 65 ° С

Часть 9: Представитель Результаты

Представитель эмбрионов приведены ниже: (А) Эмбрион (стадия HH7) помечена DIG-Сокс зонд (синий) и FITC-дельта-1 зонда (красный). (B) Эмбрион (стадия HH8) помечена DIG-Pax6 зонд (синий) и FITC-Тсс зонд (красный). Nf, нейронные раза, ANP, передней нервной пластинки, PSM, presomitic мезодермы, п, хорды, NT, нервной трубки). Зонд подарки от лаборатории д-ра. С. Табин, М. Гулдинг, Д. Энрике, Дж. Бриско.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

2-цветная целом монтировать на месте методом гибридизации используется для определения пространственных и временных закономерностей изменения экспрессии генов, с помощью одного или двух генов, представляющих интерес. Приложения включают в себя оценку генной экспрессии новых генов (например, 1,2, а также изменения в экспрессии генов следующим оскорбление (эмбриональных манипуляций 3, бусины 4 и электропорации РНК или ДНК-конструкции 5).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Маргарет М. Alkek Фонда РГНФ.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Eggs Animal Charles River Laboratories Premium Fertile
Stereomicroscope Microscope Leica Microsystems MZ9.5
Marsh Automatic Incubator Tool Lyon RX
Hybridization Incubator Tool Hybaid Micro-4
Adams Nutator orbital mixer Tool Fisher Scientific 14-062
Curved Forceps (1) Tool Electron Microscopy Sciences 72991-4C
Fine scissors Tool Fine Science Tools 14161-10
Spoon Tool Fine Science Tools 10370-18
Pasteur Capillary Pipette Electron Microscopy Sciences 70950-12
Microcapillary tube Sigma-Aldrich P1049-1PAK Pull using vertical micropipette puller; blunt end with fine forceps
Microdissecting knife Fine Science Tools 10056-12 Use to puncture cavities prior to in situ hybridization
Minuten pins 0.2mm diam Fine Science Tools 26002-20 Keep pins together using a magnetic stirrer;
Sylgard 184 Silicon Elastomer Curing Agent and Base Reagent Dow Corning 0001986475 Mix 1 part Curing Agent, 9 parts Base; set O/N at 37C
Diethylpyrocarbonate (depc) Reagent Acros Organics 10025025 Add 1ml depc to 1l PBS; shake; autoclave
16% PFA Reagent Electron Microscopy Sciences 15710
Tween-20 Reagent Sigma-Aldrich P1379-100ML
Proteinase K Sigma-Aldrich P2308-5MG Stock at 10 mg/ml in depc-H2O in 10ul aliquots. Store at -20C.
Formamide, deionized Reagent Ambion 9342
Yeast tRNA-25 mg Reagent Invitrogen 15401-011 Stock at 20 mg/ml in depc-H2O in 125ul aliquots. Store at -20C
Heparin Sodium salt Reagent Sigma-Aldrich H4784-250MG Stock at 50 mg/ml in depc-H2O in 100ul aliquots. Store at -20C.
SSC x20 pH5.5 Reagent Fisher Scientific PR-V4261
EDTA (0.5M) PR-V4231 Fisher Scientific
SDS Reagent Fisher Scientific BP166-100
Maleic acid Reagent Fluka 63189
B–hringer Blocking Reagent Reagent Roche Group 11096176001 Use at 2% in MABT. To make, heat with MABT for 20 mn at 60C. Can make a stock and store in 1-5 ml aliquots at 20C.
Heat inactivated sheep serum Reagent Jackson ImmunoResearch 013-000-121 Dissolve in 10 ml H2O; heat 550C, 30 mn. Aliquot at 1ml, -20C.
Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments Reagent Roche Group 11093274910
NBT/BCIP stock solution Reagent Roche Group 11681451001
Anti-Fluorescein-AP, Fab fragments Reagent Roche Group 11426338910
2M Tris BP1759-500 Fisher Scientific
Vector Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit Reagent Vector Laboratories SK-5100
1,2,3,4-tetrahydronaphthalene Reagent Sigma-Aldrich 429325-100ML Under hood

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Streit, A., Berliner, A. J., Papanayotou, C., Sirulnik, A., Stern, C. D. Initiation of neural induction by FGF signaling before gastrulation. Nature. 406, 74-78 (2000).
  2. Rodríguez Esteban, C., Capdevila, J., Economides, A. N., Pascual, J., Ortiz, A., Izpisúa Belmonte, J. C. The novel Cer-like protein Caronte mediates the establishment of embryonic left-right asymmetry. Nature. 401, 243-251 (1999).
  3. Psychoyos, D., Stern, C. D. Restoration of the organizer after radical ablation of Hensen's node and the anterior primitive streak in the chick embryo. Development. 122, 3263-3273 (1996).
  4. Kawakami, M., Nakanishi, N. The role of an endogenous PKA inhibitor, PKIalpha, in organizing left-right axis formation. Development. 128, 2509-2515 (2001).
  5. Basch, M. L., Bronner-Fraser, M., Garcia-Castro, M. I. Specification of the neural crest occurs during gastrulation and requires Pax7. Nature. 441, 218-222 (2006).

Comments

1 Comment

  1. comment from author (DP): Pax6 expressed in neural folds and developing neural tube (Results section)

    Reply
    Posted by: Anonymous
    October 28, 2008 - 10:34 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics