Summary
Здесь мы описываем методы для лечения новорожденных капсаицин побудить атопический дерматит у крыс и воздействия испаряется формальдегида для расследования последствий вдыхания формальдегида на атопический дерматит.
Abstract
Атопический дерматит хронически рецидива зудящие экзема и преобладает в мире, особенно в развитых странах. Знаны, что сложных взаимодействий между генетические и экологические факторы играют важную роль в патофизиологии атопический дерматит. Однако мы все еще не имеют детальную картину Патогенез этого заболевания. Таким образом она имеет важное значение для разработки соответствующих животных моделей для выяснения прогрессирование атопический дерматит. Кроме того влияние экологических факторов, таких как загрязнителей воздуха на атопический дерматит расширяет понимание болезни. Здесь мы описываем метод для стимулирования атопический дерматит у крыс с новорожденным капсаицин лечения и протокол для экспозиции постоянной концентрации формальдегида для крыс выявить влияние на развитие атопического дерматита детской и подростковой периоды. Эти протоколы были успешно применены к несколько экспериментов и может быть использован для других веществ.
Introduction
Допросить последствия вдыхания формальдегида (ФА) на прогрессирование атопический дерматит (AD), мы установили протокол для AD индукции и разработали камеру обычного обращения для хронического воздействия FA.
Объявление-хронические воспалительные заболевания кожи приписывается сложных взаимодействий между генетической предрасположенности и экологических триггеры1,2. Модель надлежащего животных требуется для изучения объявление в доклинических государства. Это особенно важно, когда изучение патогенеза AD под влиянием факторов окружающей среды. Кроме того чтобы лучше изучить воздействие экологических триггеры на объявление прогрессии, важно для разделения отдельных экологических факторов и количественно оценить степень воздействия.
Мы продемонстрировали Роман крысы модель AD, вызванных лечения новорожденных капсаицин. Это объявление модель3 имеет некоторые преимущества над другими AD модели, например модели AD, индуцированных epicutaneous сенсибилизации, генетически объявлений модели и модели спонтанного мыши AD4. Во-первых эта модель развивается AD-подобные симптомы в возрасте 3 недели, который соответствует младенца объявление и раньше, чем другие модели спонтанного мыши объявление как NC/Nga мыши. В некоторых случаях, в отличие от модели генетически AD симптомы моделей AD спадать и рецидив спонтанно в течение 20-недельного. Кроме того процесс индукции AD-подобные симптомы в модели проще, чем у модели epicutaneous сенсибилизации, который больше похож на аллергический контактный дерматит в перспективе процесса индукции.
Мы ввели Роман протокол облучения FA в животной модели, используя камеру акрилового стекла и регулятор обычного медицинского кислорода5 для изучения последствий вдыхания FA на развитие AD в детской и подростковой периоды. Регулятор позволяет нам подвергать животных к постоянной концентрации газа, регулируя скорости потока и концентрации раствора. Предыдущие исследования сообщили несколько способов воздействия фа животных моделей. Xu et al. описал метод экспозиции, в которой FA решение непосредственно применяется для кожи6. Еще одно недавнее исследование рассмотрен протокол FA газа воздействия с помощью специализированных летучими растворителями генератора, модель 49127. По сравнению с методами предыдущих исследований, новый метод оснащен более легко и может применяться для других решений, в дополнение к Англии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
все методы, описанные здесь были одобрены международной животное уход и использование Комитет (IACUC) из Кореи университета колледжа из медицины. через 6 недель после рождения, экспериментаторов можно вызвать enthansasia и собирать различные образцы, такие, как кожи и сыворотке крови крыс.
1. индукция AD новорожденных лечение капсаицин
- для приготовления 5 мг/мл раствора капсаицин, добавить 50 мг капсаицина 1 мл 80 анимации и 1 мл 100% этанола в 15 мл Конические трубки.
- Добавить 8 мл физиологическим Конические трубки. Встряхнуть трубку до тех пор, пока не отдельные слои видны
- внедрить решение капсаицин (10 мкл/g) в подкожной клетчатке, на средней и задней части шеи новорожденных крыс Sprague-Dawley.
- Доставить капсаицин между 12 h до 48 ч после рождения (критический).
Примечание: Если инъекции задерживается более чем на несколько дней, дерматит не будет развиваться, или она будет сохраняться только в течение нескольких недель. Если инъекции слишком рано, респираторный дистресс может произойти из-за сильной боли. - Для предотвращения новорожденных крыс из дыхания с инжекцией капсаицин, нажимаем грудь новорожденных поощрять дыхания или держать новорожденных в кислородной камере до тех пор, пока дыхание становится нормальной. Поскольку капсаицин индуцированной боль может препятствовать дыханию, добавление общей анестезии возможно может усугубить трудности дыхания. Таким образом, экспериментаторов не следует использовать anesthesics увеличить выживание крыс.
- Доставить капсаицин между 12 h до 48 ч после рождения (критический).
2. Оценка зуд и дерматит в мышиной модели AD
- измерение зуда, подсчитывая спонтанное царапин поведение
- подготовить пластиковые камеры (20 x 30 см x 20 см) оснащены зеркалом для полного охвата для просмотра и отверстия, чтобы позволить крысы вздохнуть.
- Установите вверх и настроить цифровой видеокамеры должным образом, чтобы одновременно записывать зеркал и передних представления крыс.
- Место крыс в пластиковые камеры и охватывают потолок камеры с тяжелым предметом, чтобы предотвратить открытие.
- Записи спонтанного поведения крыс за 1 ч, воспроизводить видеоклипы и подсчитать количество царапин поведение.
- Оценки поражения кожи, с использованием системы скоринга
- место крыса в зале индукции.
- Включить расходомер кислорода до 2 Л/мин скорость потока и отрегулировать изофлюрановая испарителя до 3% для анестезии.
- Определить масштабы и тяжесть дерматит в уши и другие части крыса.
- Определяют размер подразделение для степень поражения кожи как 0,25 см 2 и тяжести поражения кожи на следующие таблицы 1: Индекс тяжести; степень дерматит Оценка путем умножения и степени тяжести (см. дерматит Оценка в < сильный класс = «xfig» > Рисунок 1B).
3. Воздействие газообразных FA животных
- Подготовка камеры ингаляции
- подготовить окно акриловое стекло (55 cm х 40 cm х 35 см), имеет два выхода на противоположных сторонах.
- ОСТОРОЖНОСТЬЮ. Для распространения FA газа, место выше, чем входе выходе и сделать больше, чем на входе размер розетки.
- ОСТОРОЖНОСТЬЮ. Для измерения концентрации внутреннего газа, на другой стороне точек, просверлить три небольших отрывков, которые могут быть закрыты.
- Подключить трубы с обеих точек. Поместите отводной трубки для циркуляции капот или снаружи здания для выбросов газа и подключите другой отводной трубки к регулятору медицинского кислорода.
- Место обычного крыса клетке внутри коробки из акрилового стекла.
- Поместить крыс в клетке от одной недели после рождения на 5 недель (2 часа в день и 5 дней в неделю).
- Уплотнение поле акрилового стекла так плотно, как можно предотвратить утечку газа.
Примечание: Для жесткой уплотнение, крышку камеры должен содержать резиновые. Применить пленку камеры для уплотнения плотно обернуть.
- Поколение газообразных ОС с помощью регулятора медицинского кислорода
- растворить в 1 Л воды 5 g ОС.
- Поместить FA 0,5% раствор в бутылке увлажнитель регулятора медицинского кислорода.
- После подключения в трубку к регулятору, включите регулятор и установите скорость потока до 5 Л/мин
- Настроить концентрации раствора и скорость потока для определения концентрации газа в камере.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Воспаление кожи AD-как лечить капсаицин AD крыса модели в возрасте 7 недель представлена на рисунке 1A. Надежные царапин поведение модели крыса AD капсаицин лечение показано в видео 1. Лечение новорожденных капсаицин вызвало дерматит и усугубляет царапин поведение крыс 3-недельного возраста, и AD-подобные симптомы сохраняются в течение нескольких недель (рис. 1B, C). Хотя степень была менее серьезными, некоторые крысы пострадали от рецидивирующего дерматит на 16 недель возраста после резолюции ранних AD-подобные симптомы (рис. 1 d). Кроме того сыворотке крови уровень IgE, который является биологический маркер для AD тяжести8, возведен в модели капсаицин лечение крыса AD (Рисунок 1E). В модели крыса капсаицин лечение AD (Рисунок 1F, G) также увеличились мРНК проявление Ил-4 и IL-13.
Представитель фотографии показали, что FA индуцированной обострение дерматита в модели капсаицин лечение крыса AD на 5 недель возраста (рисунок 2A). Экспозиции 1.2 ppm FA усугубляет царапин поведение и дерматит в капсаицин лечение AD мышиной модели для более чем 2 недели. Однако 0,8 промилле FA экспозиции не усугубить царапин поведение и дерматит крысы капсаицин лечение AD модели (рис. 2B, C). Кроме того 1.2 ppm FA воздействия повышенных сыворотки уровень IgE модели крыса капсаицин лечение AD (Рисунок 2D).
Для экспозиции газообразных FA вентиляционные камеры была создана, как описано в протокол (рис. 3A). До воздействия концентрация FA в камере неоднократно был измерен для обеспечения последовательного концентрации. При изменении концентрации раствора FA, измерялась концентрация газообразных FA в камере. С увеличением концентрации раствора, концентрация газа в камере медленно увеличилось и концентрация газа в камере от того же решения не менялся значительно в повторных измерений (рис. 3B).
Рисунок 1: лечение новорожденных капсаицин индуцированной рецидивирующего воспаления AD-как кожи и зуда в крыс. Представитель фотографии воспаление кожи в капсаицин лечение крыса (A). Хронологическом особенности дерматит (B) и царапин поведение (C) капсаицин лечение крыс. Представитель изображение рецидивирующего поражениях кожи 16 недельных капсаицин лечение крыс (D). (E) значительное повышение IgE в сыворотке в капсаицин лечение животных. (F) значительное повышение экспрессии мРНК Ил-4 в капсаицин лечение животных. (G) значительное повышение экспрессии мРНК Ил-3 в капсаицин лечение животных. Все результаты были высказаны как средства ± SEM и анализируются с помощью t критерия Стьюдента. *p < 0,05, ** p < 0,005, ***p < 0,001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: FA воздействие усугубляется зуда и дерматит в модели капсаицин лечение AD крыса. Представитель фотографии 5й недели лечения с использованием 1.2 ppm и 0,8 ppm FA (A). Экспозиции 1.2 ppm Англии, но не 0.8 ppm FA воздействия, значительно усиливают зуд (B) и дерматит (C) в модели AD капсаицин лечение. Уровень IgE сыворотки, увеличилась в модели крыса AD капсаицин лечение лечение с 1.2 ppm FA экспозиции (D). Результаты были высказаны как средства ± SEM и анализируются с помощью односторонней ANOVA, следуют Тьюки тест или t тест Стьюдента. *p < 0,05, ***p < 0,001 (против крыс воздействию на свежий воздух). 1.2 FA-AD: капсаицин лечение AD крысы модель подвергается 1.2 ppm FA; 0,8 FA-AD: капсаицин лечение AD крысы модель подвергается 0.8 ppm FA; и воздух-AD: капсаицин лечение AD крысы модель воздействию на свежий воздух. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: лечение ОС. Схематическая иллюстрация регулятора и газовой камере (A). Концентрация газообразных FA в камере был пропорционален концентрации раствора (Б) Англии. Результаты были высказаны как средства ± SEM. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Видео 1: приступы царапин поведение капсаицин-лечение крыс были записаны для измерения почесухи. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
| Регион | Оценка | Описание |
| За исключением уши | 0 | Нормальный |
| 1 | Туманный меха | |
| 2 | Алопеция или вспышки | |
| 3 | Кровотечение или парши | |
| Уши | 0 | Нормальный |
| 1 | Вспышки | |
| 2 | Кровотечение или парши | |
| 3 | Потеря ткани |
Таблица 1: Индекс тяжести.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол, описанные здесь для индукции AD-подобные симптомы у крыс могут быть адаптированы для изучения патофизиологии AD и используется как инструмент скрининга для тест на наркотики. Инструмент для воздействия газообразных FA капсаицин лечение крыс может применяться для оценки последствий воздействия различных газов на разнообразных животных моделях.
Новорожденных лечение капсаицин объявления модель опирается на более простой процедурой, чем других атопических модели, такие как DNCB лечения модель9 и epicutaneous сенсибилизации модель4и является более доступным, чем мыши NC/Nga4. Проявление AD-подобные симптомы в объявление модели является последовательной. Кроме того в некоторых случаях этот протокол вызывает спонтанное рецидивирующего поражениях кожи AD-как в пострадавших крыс без каких-либо дополнительных лечения3. Инъекции капсаицина передозировки вызывали нейрональных клеток смерть и neurocutaneous воспаление10 и вызвало сильную боль в крыс. Некоторые из них, возможно, страдал от дыхания из-за боли. Это имеет важное значение для предотвращения их от дыхания. Таким образом после инъекции капсаицина, щенки должны быть помещены в камеру с кислородом и некоторых щенков может потребоваться сжатие грудной клетки. Лечение новорожденных капсаицин не побудить AD-подобные симптомы у мышей, и причина для этого до сих пор неизвестна. Таким образом генетическое вмешательство вряд ли применим к этой модели AD с помощью нокаут-штамм, но другие генетические подходы например siRNA правдоподобно компенсировать этот недостаток. Кроме того последовательное проявление AD-подобные симптомы крысы модель полезна для изучения патогенеза болезни AD, а также применяя его к скрининга наркотиков.
Создание палаты кровообращения FA воздействия требует только обычных лабораторное оборудование, включая акриловые окна и регулятором медицинского кислорода. Кроме того изменив решение в бутылке увлажнитель кислорода регулятора, могут применяться различные виды газов в эксперименте. Концентрация газа в камере можно легко поддерживать, регулируя скорость потока регулятора и концентрации раствора. Это имеет решающее значение для обеспечения жесткие уплотнения в установке системы кровообращения FA воздействия на капсаицин лечение AD крысы модель с использованием акриловых камеры и регулятором медицинского кислорода. Не только потому, что концентрация газа в камере могут отличаться каждый раз из-за утечки, но также утечка газа может нанести вред экспериментаторов. Испарения некоторых летучих органических соединений (Лос) часто блокирует трубки кристаллизации. Таким образом уместно избежать засорения путем управления непрерывной трубки для длительного использования, регулярно заменяя трубы. Эта система испарения отражает более точно прогрессирования заболевания у пациентов, чем методы актуальные приложения11. Этот метод показал особенностей последствий вдыхания FA на мышиной модели AD, по сравнению с предыдущими исследованиями, которые подвержены наивно животных7,12фа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано общественного благосостояния & программы исследований безопасности через Национальный фонд исследований Кореи (NRF) финансируется министерством образования, науки и технологии (СР 2014M3C8A5030612) и поддерживается Чун Ян, Cha Young Солнце, M.D. и Чан Привет Joo йеу Sa Мемориальный фонд.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medical Oxygen Regulator | Yuyao Jiahua Medical | manufacturer will not affect results | |
| Tube | manufacturer will not affect results | ||
| Acrylic Chamber | Taejin Acryl | manufacturer will not affect results | |
| Plastic Chamber | Taejin Acryl | manufacturer will not affect results | |
| Paraformaldehyde, powder | Sigma | 158127 | manufacturer will not affect results |
| Wrap filme | Uniwrap | manufacturer will not affect results | |
| Capsaicin | Sigma | M2028 | manufacturer will not affect results |
| Tween 80 | Sigma | P4780 | manufacturer will not affect results |
| Digital Video Camera | Sony | HDR-CX380y | manufacturer will not affect results |
| Isoflurane | JW pharmaceutical | manufacturer will not affect results |
References
- Geha, R. S. Allergy and hypersensitivity. Nature versus nurture in allergy and hypersensitivity. Curr Opin Immunol. 15 (6), 603-608 (2003).
- Novak, N., Bieber, T., Leung, D. Y. Immune mechanisms leading to atopic dermatitis. The J Allergy Clin Immunol. 112 (Suppl 6), S128-S139 (2003).
- Back, S. K., et al. Chronically relapsing pruritic dermatitis in the rats treated as neonate with capsaicin; a potential rat model of human atopic dermatitis. J Dermatol Sci. 67 (2), 111-119 (2012).
- Jin, H., He, R., Oyoshi, M., Geha, R. S.
- Han, R. T., et al. Formaldehyde-Induced Aggravation of Pruritus and Dermatitis Is Associated with the Elevated Expression of Th1 Cytokines in a Rat Model of Atopic Dermatitis. PLOS ONE. 11 (12), e0168466 (2016).
- Xu, B., Aoyama, K., Takeuchi, M., Matsushita, T., Takeuchi, T. Expression of cytokine mRNAs in mice cutaneously exposed to formaldehyde. Immunol Lett. 84 (1), 49-55 (2002).
- Kim, J. Y., Jeong, M. S., Park, K. Y., Seo, S. J. Aggravation of atopic dermatitis-like symptoms by consecutive low concentration of formaldehyde exposure in NC/Nga mice. Exp Dermatol. 22 (3), 219-221 (2013).
- Laske, N., Niggemann, B. Does the severity of atopic dermatitis correlate with serum IgE levels? Pediatr Allergy Immunol. 15 (1), 86-88 (2004).
- Fujii, Y., Takeuchi, H., Sakuma, S., Sengoku, T., Takakura, S. Characterization of a 2,4-dinitrochlorobenzene-induced chronic dermatitis model in rats. Skin Pharmacol Physiol. 22 (5), 240-247 (2009).
- Sugimoto, T., Xiao, C., Ichikawa, H. Neonatal primary neuronal death induced by capsaicin and axotomy involves an apoptotic mechanism. Brain Res. 807 (1-2), 147-154 (1998).
- Saito, A., et al. Characterization of skin inflammation induced by repeated exposure of toluene, xylene, and formaldehyde in mice. Environ Toxicol. 26 (3), 224-232 (2011).
- Jung, W. W., et al. Formaldehyde exposure induces airway inflammation by increasing eosinophil infiltrations through the regulation of reactive oxygen species production. Environ Toixcol Pharmacol. 24 (2), 174-182 (2007).
