Immunology and Infection

ההשפעות של חשיפה של פורמלדהיד מודל עכברוש של אטופיק דרמטיטיס המושרה על ידי קפסאיצין Neonatal טיפול

Published: September 27, 2017 doi: 10.3791/55987

Rafael Taeho Han¹, Seung Keun Back², JaeHee Lee¹, Hye young Kim¹, Hee Jin Kim³, Heung Sik Na¹

¹Neuroscience Research Institute & Department of Physiology, College of Medicine, Korea University, ²Department of Pharmaceutics and Biotechnology, College of Medical Engineering, Konyang University, ³Division of Biological Science and Technology, Science and Technology College, Yonsei University Wonju Campus

Summary

נתאר כאן שיטות לטיפול קפסאיצין neonatal לזירוז אטופיק דרמטיטיס חולדות, חשיפה של פורמלדהיד מתאדה לחקור את ההשפעות של פורמלדהיד אינהלציה-אטופיק דרמטיטיס.

Abstract

אטופיק דרמטיטיס היא מתדרדרת באופן כרוני pruritic אקזמה, מנצחת ברחבי העולם, במיוחד במדינות המפותחות. אינטראקציה מורכבת בין גורמים גנטיים וסביבתיים ידועים לשחק תפקיד חשוב הפתופיזיולוגיה של אטופיק דרמטיטיס. עם זאת, אנו עדיין חוסר תמונה מפורטת בפתוגנזה של המחלה. לפיכך, יש חשיבות לפתח מודלים בעלי חיים המתאימים עבור שחקרתי את ההתקדמות של אטופיק דרמטיטיס. יתר על כן, חוקר את השפעת גורמים סביבתיים כגון מזהמי אוויר על אטופיק דרמטיטיס מרחיב את ההבנה של המחלה. כאן, אנו מתארים שיטה להשראת אטופיק דרמטיטיס בחולדות עם טיפול קפסאיצין neonatal, פרוטוקול חשיפה של ריכוז קבוע של פורמלדהיד חולדות לחשוף על ההתפתחות של אטופיק דרמטיטיס אינפנטילי, גיל ההתבגרות תקופות. פרוטוקולים אלה הוחלו בהצלחה על מספר ניסויים והוא יכול לשמש לחומרים אחרים.

Introduction

לחקור את ההשפעות של פורמלדהיד (FA) שאיפת על ההתקדמות אטופיק דרמטיטיס (AD), אנחנו הוקמה עבור המודעה אינדוקציה פרוטוקול ופיתח תא מחזור רגיל לחשיפה כרונית של הפא.

המודעה היא מחלת עור דלקתית כרונית לייחס את האינטראקציות מורכבים בין נטייה גנטית לבין גורמים סביבתיים¹^,². דגם בעל חיים ראוי נדרש ללמוד לספירה במדינה פרה. זה הכי חשוב כאשר שחקרתי בפתוגנזה של המודעה תחת ההשפעה של גורמים סביבתיים. יתר על כן, כדאי לחקור את ההשפעות של הגורמים הסביבתיים על ההתקדמות לספירה, זה חיוני כדי להפריד בין הגורמים הסביבתיים בודדים ולכמת את מידת החשיפה.

הראו מודל עכברוש הרומן של המודעה המושרה על ידי טיפול קפסאיצין neonatal. זה דגם AD³ יש כמה היתרונות על פני דגמים אחרים לספירה כמו הדגמים לספירה המושרה על ידי רגישות עולה epicutaneous, הדגמים לספירה מהונדס, הדגמים העכבר ספונטנית של המודעה⁴. ראשית, מודל זה מפתחת תסמינים דמויי לספירה בגיל 3 שבועות, אשר מקביל התינוק לספירה היא קודמת מאשר דגמים אחרים העכבר ספונטנית של AD כגון העכבר NC/נגה. במקרים מסוימים, בניגוד הדגמים לספירה מהונדס, הסימפטומים של הדגמים לספירה להתפוגג, נסיגה ספונטנית במשך 20 שבועות. יתר על כן, תהליך אינדוקציה של תסמינים דמויי לספירה במודל קל יותר מזה של המודל רגישות עולה epicutaneous, הדומה יותר ממגע אלרגית בפרספקטיבה של תהליך הגיוס.

יש לנו הציג פרוטוקול חדשניים עבור הפא חשיפה במודל חיה באמצעות תא זכוכית אקרילית, הרגולטור חמצן רפואי קונבנציונלי⁵ כדי לחקור את ההשפעות של שאיפת הפא על הפיתוח של המודעה בתקופות אינפנטילי, בגיל ההתבגרות. הרגולטורים אפשרה לנו לחשוף את החיות על ריכוז קבוע של הגז על ידי התאמת המחירים זרימה וריכוז פתרון. מחקרים קודמים דיווחו על מספר דרכים של חשיפה של פא חייתיים. Xu. ואח תיאר את שיטת החשיפה בפא איזה פתרון היה מוחל ישירות על העור⁶. מחקר שנערך אחר התייחס הפרוטוקול של חשיפה גז הפא באמצעות גנרטור ממסים נדיפים מיוחדים, מודל 4912⁷. לעומת שיטות של מחקרים קודמים, השיטה החדשה מצויד ביתר קלות, יכול להיות מיושם עבור פתרונות אחרים בנוסף הפא.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים הבינלאומי ועל שימוש הוועדה (IACUC) של קוריאה אוניברסיטת מכללת של רפואה. 6 שבועות לאחר הלידה, ניסויים יכול לגרום enthansasia ולאסוף מדגמים שונים כגון עור, סרום של חולדות.

1. אינדוקציה של המודעה על ידי טיפול קפסאיצין Neonatal

כדי להכין 5 מ"ג/מ"ל פתרון קפסאיצין, להוסיף 50 מ"ג של קפסאיצין 1 מ"ל של Tween 80 ו- 1 מ"ל של 100% אתנול צינור חרוטי 15 mL-
להוסיף 8 מ"ל של תמיסת הצינור חרוט. לנער את הצינור נמרצות עד אין שכבות נפרדות גלויים
להזריק הפתרון קפסאיצין (µL 10/g) לתוך הרקמה התת עורית, על קו האמצע, הצד האחורי של הצוואר של חולדה ספראג-Dawley neonatal.
1. לספק קפסאיצין בין h 12 עד 48 שעות לאחר הלידה (קריטי).
  הערה: אם הזריקה מתעכב יותר מכמה ימים, דרמטיטיס לא יתפתח או זה יישמר רק במשך כמה שבועות. אם הזריקה מוקדם מדי, מצוקה נשימתית יכול להתרחש עקב כאבים עזים.
2. למניעת חולדות neonatal של דום נשימה בעקבות הזריקה קפסאיצין, לדחוף את התיבה של neonates כדי לעודד נשימה, או לשמור את neonates על חדר חמצן עד הנשימה הופך רגיל. מאז קפסאיצין המושרה הכאב יכול להרתיע נשימה, הוספת הרדמה כללית עלולה להחמיר ואולי קושי נשימה. לפיכך, ניסויים לא צריך להשתמש anesthesics כדי להגדיל את ההישרדות של חולדות.

2. הערכה של Pruritus, דרמטיטיס במודל של עכברים של AD

מדידה של pruritus על ידי ספירת התנהגות של גירוד ספונטנית
1. פלסטיק הכן צ'יימברס (20 ס"מ על 30 ס"מ x 20 ס"מ) מצוידים עם מראה כדי לאפשר כיסוי מלא עבור צפייה וחורים כדי לאפשר את החולדות לנשום.
2. להגדיר למעלה ולהתאים מצלמת וידאו דיגיטלית כראוי כדי להקליט את מראה נוף ונוף קבלה של החולדות בו זמנית.
3. המקום חולדות בפלסטיק קאמרית ולכסות את תקרת החדר עם חפץ כבד על מנת למנוע פתיחת.
4. להקליט את התנהגויות ספונטנית של חולדות עבור 1 h להשמיע את סרטוני הווידאו, לספור את מספר התנהגויות מגרד.
הערכה של נגע עורי באמצעות שיטת הניקוד
1. למקם את החולדה בבית הבליעה אינדוקציה-
2. להפוך את זרימה חמצן כדי 2 ל'/min לזרום בקצב ולהתאים את מאדה איזופלוריין 3% עבור הרדמה.
3. לזהות את היקף וחומרת דרמטיטיס האוזניים וחלקים אחרים של עכברוש.
4. מגדירים את גודל יחידת עבור היקף נגעים בעור 0.25 ס מ ² ואת חומרת נגעים בעור על ידי הבאים טבלה 1: מדד לחומרת; מידת דרמטיטיס הציון על-ידי הכפלת במידה ואת חומרת (לראות את התוצאה דרמטיטיס ב < מחלקה חזקה = "xfig" > איור 1B).

3. חשיפה של פא גזי חיות

הכנת החדר שאיפה
1. להכין קופסת זכוכית אקרילית (55 ס"מ על 40 ס"מ x 35 ס מ) בעל שני שקעים משני צידי המתרס.
2. התראה. זרימת הגז פא, מקום גבוה יותר מאשר כניסת השקע ולבצע את הגודל של השקע גדול מזה של הים-
3. התראה. מדידות ריכוז הגז הפנימי, על צד אחר של האסלות, לקדוח שלושה קטעים קטנים, אשר ניתן לסגור.
4. חיבור צינורות לשקעי בשני. המקום של צינור עודפים מחזור המנוע או מחוץ לבניין על פליטת הגז, והתחבר הצינור לשקע אחרים הרגולטור חמצן רפואי.
5. מקום לכלוב חולדה המקובלת בתוך תיבת זכוכית אקרילית.
6. לשים חולדות בכלוב של שבוע לאחר הלידה למשך 5 שבועות (2 h/יום, 5 ימים בשבוע).
7. לאטום את תיבת זכוכית אקרילית חזק ככל האפשר כדי למנוע דליפת גז-
  הערה: עבור איטום צר, המכסה קאמרית להכיל גומי. החלת תיאחז הסרט לעטוף את התא עבור איטום חזק.
דור גז הפא על-ידי שימוש הרגולטור חמצן רפואי
1. יתמוסס 5 g של פא 1 ליטר של מים-
2. להכניס את הפתרון פא 0.5% הבקבוק מעשיר של הרגולטורים חמצן רפואי.
3. לאחר חיבור צינור כניסת כדי הרגולטורים, להפעיל את הרגולטור וקבע את קצב הזרימה כדי 5 L לדקה
4. להתאים את הריכוז פתרון ואת קצב הזרימה כדי לקבוע ריכוז הגז בתא.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הדלקת לספירה דמוי עור בדגם שטופלו קפסאיצין לספירה עכברוש רוב בגיל 7 שבועות מוצג איור 1A. התנהגויות של גירוד חזקה של המודל שטופלו קפסאיצין עכברוש לספירה מוצג 1 וידאו. קפסאיצין neonatal טיפול elicited דרמטיטיס ולהחמרה מגרד התנהגויות אצל חולדות בגיל 3 שבועות, תסמינים דמויי לספירה שהתמידו למשך מספר שבועות (איור 1B, ג). למרות התואר היה חמור פחות, תוכניות rat סבלה ושבה דרמטיטיס בגיל 16 שבועות של גיל לאחר הרזולוציה של סימפטומים מוקדמים כמו AD (איור 1D). יתר על כן, סרום רמת IgE, אשר מהווה סמן ביולוגי עבור המודעה חומרת⁸, שהועלה במודל שטופלו קפסאיצין לספירה עכברוש (איור 1E). הביטויים mRNA של IL-4 ו- IL-13 גדל גם במודל שטופלו קפסאיצין לספירה עכברוש (איור 1F, G).

הנציג תצלומים הראה כי הפא המושרה העצבים של דרמטיטיס במודל חולדה לספירה שטופלו קפסאיצין בגיל 5 שבועות של גיל (איור 2 א). חשיפה של 1.2 ppm פא מחמירות את התנהגויות של גירוד ואת דרמטיטיס במודל חולדה לספירה שטופלו קפסאיצין במשך יותר משבועיים. עם זאת, חשיפה 0.8 ppm הפא לא להחריף התנהגויות של גירוד, דרמטיטיס במודל שטופלו קפסאיצין לספירה עכברוש (איור 2B, ג). יתר על כן, החשיפה 1.2 ppm פא גבוהות הסרום רמת IgE במודל שטופלו קפסאיצין לספירה עכברוש (איור דו-ממדי).

חשיפה של פא גזי, תא אוורור הוקם כפי שמתואר על פרוטוקול (איור 3 א). לפני החשיפה, הריכוז של ה-FA בבית הבליעה נמדדה שוב ושוב עבור אבטחת ריכוז עקבית. בעת שינוי הריכוז של פתרון ה-FA, נמדד הריכוז של הפא גז בבית הבליעה. ככל הריכוז של הפתרון, ריכוז הגז בבית הבליעה עלה בהדרגה ואת ריכוז הגז בבית הבליעה של הפתרון אותו לא משתנה משמעותית במדידות חוזרות ונשנות (איור 3B).

איור 1: טיפול Neonatal קפסאיצין המושרה Pruritus בחולדות דלקות עור כמו AD מתדרדרת. צילומים נציג של דלקת העור בחולדה שטופלו קפסאיצין (A). תכונות הכרונולוגי של דרמטיטיס (B) והתנהגויות של גירוד (C) של חולדות שטופלו קפסאיצין. תמונה ייצוגית של ושבה נגעים בעור של 16 בת שבוע שטופלו קפסאיצין חולדות (D). (E) משמעותי העלאת רמות IgE בסרום שטופלו קפסאיצין בבעלי חיים. (F) העלאת משמעותית של IL-4 mRNA ביטוי בבעלי חיים שטופלו קפסאיצין. (G) העלאת משמעותית של IL-3 mRNA ביטוי בבעלי חיים שטופלו קפסאיצין. כל התוצאות באו לידי ביטוי כפי שאומר ± SEM, נותחה באמצעות מבחן t של הסטודנט. *p < 0.05, * * p < 0.005, * * *p < 0.001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 2: חשיפה פא מחמירות Pruritus, דרמטיטיס במודל חולדה לספירה שטופלו קפסאיצין. צילומים נציג של השבוע^ה 5 של טיפול באמצעות 1.2 ppm ו- ppm 0.8 פא (A). חשיפה של 1.2 ppm הפא, אבל לא 0.8 ppm פא חשיפה, להרעה משמעותית pruritus (B), דרמטיטיס (C) במודל AD שטופלו קפסאיצין. סרום רמת IgE מוגברת במודל חולדה לספירה שטופלו קפסאיצין מטופלים עם חשיפה 1.2 ppm פא (D). תוצאות שבאו לידי ביטוי כפי שאומר ± SEM נותחה באמצעות ANOVA בכיוון אחד ואחריו המבחן של Tukey או מבחן t של הסטודנט. *p < 0.05, * * *p < 0.001 (לעומת חולדות שנחשפו אוויר צח). 1.2 פא-מודעה: דוגמנית עכברים שטופלו קפסאיצין פרסומות נחשפים 1.2 ppm הפא; 0.8 פא-מודעה: דוגמנית עכברים שטופלו קפסאיצין פרסומות נחשפים 0.8 ppm הפא; אוויר- לפרסומת: שטופלו קפסאיצין דוגמנית פרסומות עכברוש חשוף לאוויר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

איור 3: הטיפול פא. איור סכמטי של הרגולטורים, תא הגזים (A). הריכוז של הפא גז בבית הבליעה היה פרופורציונלי לריכוז של פתרון ה-FA (B). תוצאות שבאו לידי ביטוי כפי שאומר ± ב- SEM אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Video
וידאו 1: התקפי של חולדות שטופלו מגרד התנהגויות של קפסאיצין הוקלטו מדידה של Pruritus. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)

אזור	הציון	תיאור
חוץ האוזניים	0	רגיל
	1	פרווה דליל
	2	התקרחות או פלייר
	3	דימום או מפר שביתה
האוזניים	0	רגיל
	1	פלייר
	2	דימום או מפר שביתה
	3	אובדן של רקמת

טבלה 1: מדד לחומרת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפרוטוקול המתואר כאן לשם אינדוקציה של תסמינים דמויי לספירה בחולדות יכול להיות מותאם לימוד פתופיזיולוגיה לספירה, משמש ככלי מיון בדיקת סמים. ניתן להחיל את נכשיר חשיפת פא גזי חולדות שטופלו קפסאיצין כדי להעריך את ההשפעות של חשיפה גזים שונים על מודלים מגוונים.

דגם AD neonatal שטופלו קפסאיצין מסתמך על הליך פשוט יותר מאשר דגמים אטופיק אחרים כגון DNCB טיפול דגם⁹ ו- epicutaneous רגישות עולה מודל⁴, במחיר נוח יותר מאשר העכבר NC/נגה⁴. הביטוי של תסמינים דמויי לספירה במודל AD הוא עקבי. יתר על כן, במקרים מסוימים, פרוטוקול זה מעורר ספונטנית ושבה לספירה דמוי נגעים בעור בחולדות המושפעת ללא כל טיפול נוסף³. מנת יתר של קפסאיצין הזרקת עורר דופאמינרגיים המוות, neurocutaneous דלקת¹⁰ וגרם כאבים עזים בחולדות. ואולי חלק מהם סבלה דום נשימה בשל הכאבים. זה חשוב כדי למנוע מהם דום נשימה. לפיכך, לאחר הזריקה קפסאיצין, הגורים צריך להיות ממוקם חדר חמצן, הגורים מסוימים עשויים לדרוש עיסוי לב. קפסאיצין neonatal טיפול לא לגרום תסמינים דמויי לספירה בעכברים, הסיבה לכך היא עדיין לא ידוע. לכן, התערבות גנטית ישימה בקושי על מודל זה המודעה באמצעות זן הנוק-אאוט, אלא גישות גנטיות אחרות כגון siRNA יכולים לפצות על זה חסרון. יתר על כן, ביטוי עקבי של תסמינים דמויי לספירה של המודל עכברוש הוא מועיל עבור הלומדים בפתוגנזה של המחלה לספירה, כמו גם החלתו על כלי סינון סמים.

הקמת תא הדם לחשיפה הפא רק דורש ציוד מעבדה קונבנציונלי כולל תיבת אקרילי של הרגולטור חמצן רפואי. יתר על כן, על-ידי שינוי הפתרון לבקבוק מעשיר של הרגולטורים חמצן, ניתן להחיל סוגים מגוונים של גזים לניסוי. ריכוז הגז בבית הבליעה יכול להישמר בקלות על-ידי התאמת קצב הזרימה של הרגולטורים וריכוז של הפתרון. זה חיוני כדי להבטיח אטימה חזק ההתקנה של מערכת הדם חשיפה פא שטופלו קפסאיצין לספירה עכברוש המודל באמצעות תא אקרילי הרגולטור חמצן רפואי. לא רק בגלל הריכוז של גז בבית הבליעה יכול שונים בכל פעם עקב לדליפת, אך גם גז דולף יכול להזיק של ניסויים. איוד כמה תרכובות אורגניות נדיפות (VOC) לעיתים קרובות חוסם את הצינור על ידי התגבשות. לכן הרלוונטיים למנוע סתימת דרך צינור רציף ניהול לשימוש ארוך טווח על-ידי החלפת באופן קבוע הצינורות. מערכת אידוי זו משקף בצורה מדויקת יותר את התקדמות המחלה בחולים מאשר שיטות יישום מקומי¹¹. שיטה זו חשף תכונות שונות של ההשפעות של שאיפת הפא על מודל עכברוש של AD לעומת מחקרים קודמים אשר נחשפים פא תמימה-חיות-⁷^,-¹².

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

מחקר זה נתמך על ידי רווחת הציבור & תוכנית מחקר בטיחות דרך לאומי מחקר קרן של קוריאה (ב- NRF) ממומן על ידי משרד החינוך, המדע והטכנולוגיה (ה-NRF-2014M3C8A5030612), ונתמך על-ידי יאנג צ'אנג, צ'ה הצעיר שמש, מ. ד, ג'אנג היי ג'ו Yeu Sa אנדרטת מממנים.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medical Oxygen Regulator	Yuyao Jiahua Medical		manufacturer will not affect results
Tube			manufacturer will not affect results
Acrylic Chamber	Taejin Acryl		manufacturer will not affect results
Plastic Chamber	Taejin Acryl		manufacturer will not affect results
Paraformaldehyde, powder	Sigma	158127	manufacturer will not affect results
Wrap filme	Uniwrap		manufacturer will not affect results
Capsaicin	Sigma	M2028	manufacturer will not affect results
Tween 80	Sigma	P4780	manufacturer will not affect results
Digital Video Camera	Sony	HDR-CX380y	manufacturer will not affect results
Isoflurane	JW pharmaceutical		manufacturer will not affect results