Summary
Descrevemos aqui métodos para tratamento neonatal capsaicina induzir a dermatite atópica em ratos e exposição de formaldeído vaporizado para investigar os efeitos da inalação do formol na dermatite atópica.
Abstract
Dermatite atópica é cronicamente Policondrite eczema pruriginosa e prevalece em todo o mundo, especialmente nos países desenvolvidos. Interações complexas entre fatores genéticos e ambientais são conhecidas por desempenhar um papel importante na fisiopatologia da dermatite atópica. No entanto, ainda falta um quadro detalhado da patogênese desta doença. Assim, é de importância para desenvolver modelos animais apropriados para elucidar a progressão da dermatite atópica. Além disso, investigar o efeito de fatores ambientais, tais como poluentes atmosféricos na dermatite atópica amplia a compreensão da doença. Aqui, descrevemos um método para indução de dermatite atópica em ratos com tratamento neonatal capsaicina e um protocolo para a exposição de uma constante concentração de formaldeído para ratos para revelar os efeitos sobre o desenvolvimento da dermatite atópica em infantil e adolescente períodos. Estes protocolos foram aplicados com sucesso a vários experimentos e podem ser usados para outras substâncias.
Introduction
Para interrogar os efeitos da inalação de formaldeído (FA) na progressão da dermatite atópica (AD), temos estabelecido um protocolo para indução de AD e desenvolveu uma câmara de circulação convencional para exposição crônica de FA.
AD é uma doença de pele inflamatória crônica atribuída para as interações complexas entre a predisposição genética e gatilhos ambientais1,2. Um modelo animal adequado é necessário estudar a AD no estado pré-clínicos. Isso é mais importante quando a elucidação da patogenia da AD sob a influência de fatores ambientais. Além disso, para melhor investigar os efeitos dos gatilhos ambientais sobre a progressão de AD, é essencial para separar os fatores ambientais individuais e quantificar o grau de exposição.
Demonstrámos um modelo do rato de romance de AD induzida pelo tratamento neonatal capsaicina. Este modelo de AD3 tem alguns méritos sobre outros modelos de AD, como os modelos AD induzidos pela sensibilização epidérmica, os modelos AD geneticamente modificadas e os modelos de rato espontânea de AD4. Em primeiro lugar, este modelo desenvolve sintomas de AD na idade de 3 semanas, que corresponde ao Infante AD e é mais cedo do que outros modelos de rato espontânea de AD, tais como o rato NC/Nga. Em alguns casos, ao contrário dos modelos AD geneticamente modificadas, os sintomas dos modelos AD subside em recaída espontaneamente durante um período de 20 semanas. Além disso, o processo de indução de sintomas de AD no modelo é mais fácil do que o modelo de sensibilização epidérmica, que é mais parecido com a dermatite de contato alérgica, na perspectiva do processo de indução.
Nós introduzimos o romance protocolo para exposição de FA a um modelo animal por meio de uma câmara de vidro acrílico e um regulador de oxigênio médico convencional5 para estudar os efeitos da inalação de FA no desenvolvimento da AD em períodos infantis e adolescentes. O regulador nos permitiu expor os animais para uma concentração constante de gás, ajustando as taxas de fluxo e a concentração da solução. Estudos anteriores relataram várias maneiras de exposição de FA de modelos animais. Xu et al descreveram o método de exposição no qual FA solução foi diretamente aplicada a pele6. Outro estudo recente dirigida o protocolo de exposição de gás FA usando um gerador de solventes voláteis especializados, modelo 49127. Em comparação com métodos de estudos anteriores, o novo método está equipado mais facilmente e pode ser aplicado para outras soluções além de FA.
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Protocol
todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo cuidado do Animal Internacional e Comité de uso (IACUC) de Coreia Universidade faculdade de medicina. 6 semanas após o nascimento, experimentadores podem induzir enthansasia e recolher vários exemplos como a pele e soro de ratos.
1. indução da AD por tratamento Neonatal de capsaicina
- para preparar a 5 mg/mL solução de capsaicina, adicionar 50 mg de capsaicina a 1 mL de Tween 80 e 1 mL de etanol 100% em um tubo cônico de 15 mL.
- Adicionar 8 mL de solução salina ao tubo cónico. Agite o tubo vigorosamente até sem camadas separadas são visíveis
- injecte a solução de capsaicina (10 µ l/g) no tecido subcutâneo, na linha média e posterior do pescoço de um rato Sprague-Dawley neonatal.
- Entregar a capsaicina entre 12 h a 48 h após o nascimento (crítica).
Nota: Se a injeção é adiada por mais de alguns dias, dermatite não irá desenvolver ou serão mantidas apenas por algumas semanas. Se a injeção é muito cedo, dificuldade respiratória pode ocorrer devido à dor severa. - Para evitar ratos neonatais de parada respiratória devido a injeção de capsaicina, empurrar o peito dos neonatos para estimular a respiração ou manter os recém-nascidos em uma câmara de oxigênio, até que a respiração se torna normal... desde que a dor induzida por capsaicina pode desencorajar a respiração, adicionar anestesia geral possivelmente poderia agravar a dificuldade para respirar. Assim, os experimentadores devem não usar anestésico para aumentar a sobrevida de ratos.
- Entregar a capsaicina entre 12 h a 48 h após o nascimento (crítica).
2. Avaliação de prurido e dermatite em um modelo do rato de AD
- medição do prurido contando espontâneo arranhando comportamento
- preparar plástico câmaras (20 x 30 cm x 20 cm) equipado com um espelho, para permitir a cobertura total para visualização e furos para permitir que os ratos respirar.
- Conjunto para cima e ajustar a câmera de vídeo digital corretamente para gravar o espelho vistas e vistas frontais dos ratos simultaneamente.
- Lugar ratos no plástico de câmara e cobrir o teto da câmara com um objeto pesado para impedir abertura.
- Gravar os comportamentos espontâneos de ratos por 1h, reproduza os clipes de vídeo e contar o número de comportamentos de risco.
- Avaliação da lesão de pele usando um sistema de Pontuação
- colocar o rato na câmara de indução.
- Ativar o medidor de fluxo de oxigênio de 2 L/min vazão e ajustar o vaporizador de isoflurano para 3% para anestesia.
- Identificar a extensão e gravidade da Dermatite das orelhas e outras partes de um rato.
- Define o tamanho da unidade para a extensão das lesões de pele como 0,25 cm 2 e a gravidade das lesões de pele pela seguinte tabela 1: índice de gravidade; grau de Pontuação de dermatite, multiplicando-se a extensão e gravidade (ver Pontuação de dermatite em < classe forte = "xfig" > figura 1B).
3. Exposição de FA gasoso para animais
- preparação da câmara de inalação
- preparar uma caixa de vidro acrílico (55 cm x 40 cm x 35 cm) que tem duas saídas em lados opostos.
- Cuidado. Para circulação do gás FA, coloque a tomada mais elevada do que a entrada e fazer o tamanho da saída do maior que o de entrada de.
- Cuidado. Para a medição da concentração de gás interno, do outro lado das saídas, perfurar três pequenas passagens, que podem ser fechadas.
- Connect tubos para ambas as saídas. Colocar um tubo de saída para capa de circulação ou fora do prédio para a emissão do gás e conectar o outro tubo de saída de um regulador de oxigênio médico.
- Colocar uma gaiola do rato convencional dentro da caixa de vidro acrílico.
- Colocar ratos na gaiola de uma semana após o nascimento por 5 semanas (2 h/dia e 5 dias/semana).
- Fechar a caixa de vidro acrílico tão firmemente quanto possível para evitar o vazamento de gás.
Nota: Para a vedação, a tampa da câmara deve conter de borracha. Aplicar a película aderente para embrulhar a câmara para vedação.
- Geração de FA gasosa usando um regulador de oxigênio médico
- dissolver 5 g de FA em 1 L de água.
- Colocar a solução de FA de 0,5% na garrafa do umidificador de regulador de oxigênio médico.
- Depois de ligar o tubo de entrada para o regulador, gire o regulador e definir a taxa de fluxo de 5 L/min.
- Ajustar a concentração da solução e a taxa de fluxo para determinar a concentração do gás na câmara.
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Representative Results
A inflamação da pele AD-como o modelo de rato AD tratados com capsaicina em 7 semanas de idade é apresentada na figura 1A. Comportamentos arranhando robustos do modelo de ratos tratados com capsaicina AD é mostrado no vídeo 1. Tratamento neonatal capsaicina suscitou dermatite e agravada coçando comportamentos em ratos 3 semanas de idade, e AD-como os sintomas persistiram durante várias semanas (figura 1B, C). Embora o grau foi menos severo, alguns ratos sofriam de dermatite recidivante em 16 semanas de idade, após a resolução do AD, como os sintomas iniciais (Figura 1). Além disso, o soro IgE nível, que é um marcador biológico para AD gravidade8, foi elevado no modelo tratados com capsaicina AD rato (Figura 1E). As expressões de mRNA de IL-4 e IL-13 também aumentaram o modelo de rato de AD tratados com capsaicina (Figura 1F, G).
Fotografias de representante mostraram que FA induzidos o agravamento da dermatite no modelo de ratos tratados com capsaicina AD em 5 semanas de idade (Figura 2A). Exposição de 1,2 ppm FA agravou os comportamentos de coçar e dermatite em modelo de rato AD tratados com capsaicina por mais de 2 semanas. No entanto, exposição de 0,8 ppm FA não exacerbar arranhando comportamentos e dermatite no tratados com capsaicina AD rato modelo (Figura 2B, C). Além disso, exposição de 1,2 ppm FA elevou o nível de IgE no tratados com capsaicina AD rato modelo (Figura 2D) de soro.
A exposição do FA gasoso, a câmara de ventilação foi criada conforme descrito no protocolo (Figura 3A). Antes da exposição, a concentração de FA na câmara repetidamente foi medida para a garantia de concentração consistente. Ao alterar a concentração da solução de FA, foi medida a concentração de FA gasoso na câmara. Aumento da concentração da solução, a concentração do gás na câmara lentamente aumentada e a concentração do gás na câmara a partir da mesma solução não variou significativamente em repetidas medições (Figura 3B).
Figura 1: tratamento Neonatal capsaicina induziu recidivante AD-como pele inflamação e prurido em ratos. Fotografias representativas de inflamação da pele em ratos tratados com capsaicina (A). Características cronológicos de dermatite (B) e comportamentos de risco (C) dos ratos tratados com capsaicina. Imagem representativa de lesões de pele recidivante de 16 semanas de idade tratados com capsaicina ratos (D). (E) elevação significativa dos níveis séricos de IgE nos animais tratados com capsaicina. (F) significativa elevação da expressão de RNAm de IL-4 em animais tratados com capsaicina. (G) significativa elevação da expressão de RNAm de IL-3 em animais tratados com capsaicina. Todos os resultados foram expressos como média ± SEM e analisaram utilizando o teste t de Student. *p < 0,05, * * p < 0.005, * * *p < 0.001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: FA exposição agravada prurido e dermatite no modelo de ratos tratados com capsaicina de AD. Fotografias representativas da semana 5th do tratamento usando 1,2 ppm e 0,8 ppm FA (A). Exposição de 1,2 ppm FA, mas não exposição de 0,8 ppm FA, agravado significativamente prurido (B) e dermatite (C) no modelo AD tratados com capsaicina. Nível de IgE sérico aumentado no modelo de ratos tratados com capsaicina AD tratados com exposição 1,2 ppm FA (D). Os resultados foram expressos como significa SEM ± e analisados usando uma One-Way ANOVA seguida pelo teste de Tukey ou teste t de Student. *p < 0,05, * * *p < 0.001 (vs ratos expostos ao ar fresco). 1.2. o FA-AD: modelo de ratos tratados com capsaicina AD exposto a 1,2 ppm FA; 0.8 FA-AD: modelo de ratos tratados com capsaicina AD expostos a 0,8 ppm FA; e ar-AD: modelo de rato AD tratados com capsaicina exposta ao ar fresco. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: tratamento FA. Ilustração esquemática do regulador e a câmara de gás (A). A concentração de FA gasoso na câmara foi proporcional à concentração da solução de FA (B). Os resultados foram expressos como média ± SEM. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Video 1: ataques de ratos tratados riscar comportamentos de capsaicina foram gravadas para medição de prurido. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para fazer o download.)
| Região | Pontuação | Descrição |
| Exceto as orelhas | 0 | Normal |
| 1 | Pele fina | |
| 2 | Alopecia ou flare | |
| 3 | Sangramento ou fura-greve | |
| Orelhas | 0 | Normal |
| 1 | FLARE | |
| 2 | Sangramento ou fura-greve | |
| 3 | Perda do tecido |
Tabela 1: Índice de severidade.
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Discussion
O protocolo descrito aqui para a indução de sintomas de AD em ratos pode ser adaptado para estudar a fisiopatologia do AD e usado como uma ferramenta de triagem para teste de drogas. O instrumento para a exposição de FA gasoso de ratos tratados com capsaicina pode ser aplicado para avaliar os efeitos da exposição a diversos gases em diversos modelos animais.
O modelo de AD tratados com capsaicina neonatal depende de um procedimento mais simples do que outros modelos atópicas como o DNCB tratamento modelo9 e epidérmica sensibilização modelo4e é mais acessível do que o NC/Nga rato4. A manifestação de sintomas de AD no modelo AD é consistente. Além disso, em alguns casos, este protocolo provoca lesões na pele de AD-como Policondrite espontânea nos ratos afetados sem qualquer tratamento adicional3. Injeção de capsaicina sobredosagem evocou célula neuronal morte e neurocutâneas inflamação10 e causou dor severa nos ratos. Alguns deles possivelmente sofriam de parada respiratória devido à dor. É de importância para impedi-los de parada respiratória. Assim, após a injeção de capsaicina, os filhotes devem ser colocados em uma câmara de oxigênio e alguns filhotes podem exigir a compressão do peito. Tratamento neonatal capsaicina não induz a sintomas de AD em ratos, e o motivo para isso ainda é desconhecido. Assim, a intervenção genética é dificilmente aplicável a este modelo de AD usando uma estirpe de mata-mata, mas outras abordagens genéticas como siRNA plausivelmente compensar esta lacuna. Além disso, a manifestação consistente de AD-como sintomas do modelo rato é benéfica para estudar a patogênese de doenças AD, bem como aplicá-la a uma ferramenta de rastreio de drogas.
O estabelecimento da câmara circulatório para exposição FA requer apenas equipamentos convencionais de laboratório, incluindo uma caixa de acrílico e um regulador de oxigênio médico. Além disso, alterando-se a solução na garrafa do umidificador de regulador de oxigênio, diversos tipos de gases podem ser aplicados no experimento. Concentração do gás na câmara pode ser mantida facilmente ajustando a taxa de fluxo do regulador e a concentração da solução. É fundamental para garantir uma selagem apertada na instalação do sistema circulatório para a exposição de FA para o tratados com capsaicina AD rato modelo usando uma câmara de acrílico e um regulador de oxigênio médico. Não só porque a concentração do gás na câmara pode diferir cada vez devido a fugas, mas também o gás está vazando pode prejudicar os experimentadores. Vaporização de alguns compostos orgânicos voláteis (COV) muitas vezes bloqueia o tubo pela cristalização. Assim, é relevante para evitar entupimentos por meio do gerenciamento de tubo contínuo para uso a longo prazo, regularmente, substituindo os tubos. Este sistema de vaporização reflete mais precisamente a progressão da doença em pacientes do que os métodos de aplicação tópica11. Este método revelou características distintas dos efeitos da inalação de FA em um modelo do rato do anúncio em comparação com os estudos anteriores que exposto FA a ingênua animais7,12.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada pelo bem-estar público & programa de pesquisa de segurança através da nacional Research Foundation de Coreia (NRF) financiado pelo Ministério da educação, ciência e tecnologia (NRF-2014M3C8A5030612) e apoiado por The Chung Yang, Cha Young Sol, M.D. e Jang Oi Joo Yeu Sa Memorial fundo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medical Oxygen Regulator | Yuyao Jiahua Medical | manufacturer will not affect results | |
| Tube | manufacturer will not affect results | ||
| Acrylic Chamber | Taejin Acryl | manufacturer will not affect results | |
| Plastic Chamber | Taejin Acryl | manufacturer will not affect results | |
| Paraformaldehyde, powder | Sigma | 158127 | manufacturer will not affect results |
| Wrap filme | Uniwrap | manufacturer will not affect results | |
| Capsaicin | Sigma | M2028 | manufacturer will not affect results |
| Tween 80 | Sigma | P4780 | manufacturer will not affect results |
| Digital Video Camera | Sony | HDR-CX380y | manufacturer will not affect results |
| Isoflurane | JW pharmaceutical | manufacturer will not affect results |
References
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