Summary
Descriviamo qui i metodi per il trattamento di capsaicina neonatale per indurre dermatite atopica nei ratti ed esposizione di formaldeide vaporizzato per studiare gli effetti di inalazione di formaldeide sulla dermatite atopica.
Abstract
La dermatite atopica è cronicamente recidivante eczema pruriginoso e prevale nel mondo soprattutto nei paesi sviluppati. Complesse interazioni tra fattori genetici ed ambientali sono noti per svolgere un ruolo importante nella fisiopatologia della dermatite atopica. Tuttavia, manca ancora un quadro dettagliato della patogenesi di questa malattia. Così, è di importanza sviluppare modelli animali appropriati per il delucidamento della progressione della dermatite atopica. Inoltre, studiando l'effetto di fattori ambientali quali inquinanti sulla dermatite atopica espande la comprensione della malattia. Qui, descriviamo un metodo per indurre dermatite atopica in ratti con trattamento neonatale capsaicina e un protocollo per l'esposizione di una costante concentrazione di formaldeide ai ratti per rivelare gli effetti sullo sviluppo della dermatite atopica infantile e adolescenziale periodi. Questi protocolli sono stati applicati con successo a diversi esperimenti e possono essere utilizzati per altre sostanze.
Introduction
Per interrogare gli effetti di inalazione di formaldeide (FA) sulla progressione di dermatite atopica (da), abbiamo stabilito un protocollo per l'induzione di annuncio e sviluppato una camera a circolazione convenzionali per esposizione cronica della FA.
Annuncio è una malattia infiammatoria cronica della cute attribuita alle complesse interazioni tra predisposizione genetica e fattori ambientali1,2. Un modello animale adeguato è richiesto di studiare AD nello stato preclinico. Questo è più importante quando delucidamento della patogenesi dell'annuncio sotto l'influenza di fattori ambientali. Inoltre, per meglio studiare gli effetti dei fattori scatenanti ambientali sulla progressione AD, è essenziale per separare i singoli fattori ambientali e quantificare il grado di esposizione.
Abbiamo dimostrato un modello di ratto romanzo dell'annuncio indotta dal trattamento neonatale capsaicina. Questo annuncio modello3 ha alcuni meriti su altri modelli di annuncio come i modelli AD indotti da epicutaneous sensibilizzazione, i modelli di annuncio geneticamente e i modelli di mouse spontanea di annuncio4. In primo luogo, questo modello si sviluppa AD-come i sintomi all'età di 3 settimane, che corrisponde al neonato AD ed è precedente rispetto ad altri modelli del mouse spontanea dell'annuncio come il mouse di NC/Nga. In alcuni casi, a differenza dei modelli di annuncio geneticamente, i sintomi dei modelli AD abbassano e ricadono spontaneamente su un periodo di 20 settimane. Inoltre, il processo di induzione AD-come dei sintomi nel modello è più facile di quello del modello di sensibilizzazione epicutaneous, che è più simile alla dermatite di contatto allergica nella prospettiva del processo di induzione.
Abbiamo introdotto il protocollo novello per esposizione FA a un modello animale utilizzando una camera di vetro acrilico e un regolatore di ossigeno medico convenzionale5 per studiare gli effetti di inalazione FA sullo sviluppo dell'annuncio nel periodo infantile e adolescenziale. Il regolatore ha permesso di esporre gli animali a una concentrazione costante di gas attraverso la regolazione delle portate e la concentrazione della soluzione. Gli studi precedenti hanno segnalato diversi modi di esposizione della FA ai modelli animali. Xu et al ha descritto il metodo di esposizione in cui FA soluzione è stato applicato direttamente alla pelle6. Un altro recente studio affrontato il protocollo dell'esposizione di gas FA utilizzando un generatore di solventi volatili specializzati, modello 49127. Rispetto ai metodi di studi precedenti, il nuovo metodo è attrezzato più facilmente e può essere applicato per altre soluzioni oltre a FA.
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Protocol
tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dalla International Animal Care e uso Committee (IACUC) della Korea University College di medicina. 6 settimane dopo la nascita, gli sperimentatori possono indurre enthansasia e raccogliere vari campioni quali la pelle ed il siero dei ratti.
1. induzione di annuncio di trattamento neonatale di capsaicina
- per preparare 5 mg/mL soluzione di capsaicina, aggiungere 50 mg di capsaicina a 1 mL di Tween 80 e 1 mL di etanolo al 100% in una provetta conica da 15 mL.
- Aggiungere 8 mL di soluzione fisiologica normale tubo conico. Agitare vigorosamente il tubo fino a quando non gli strati separati sono visibili
- iniettare la soluzione di capsaicina (10 µ l/g) nel tessuto sottocutaneo, sulla linea mediana e posteriore del collo di un ratto Sprague-Dawley neonatale.
- Consegnare la capsaicina compresa fra 12 48 h dopo la nascita (critico).
Nota: Se l'iniezione è in ritardo di più di un paio di giorni, non si svilupperà dermatite o verrà mantenute solo per poche settimane. Se l'iniezione è troppo presto, distress respiratorio può verificarsi a causa di dolore severo. - Per prevenire ratti neonatali da arresto respiratorio a causa dell'iniezione di capsaicina, spingere la cassa dei neonati per incoraggiare la respirazione o tenere i neonati in una camera di ossigeno fino a quando la respirazione diventa normale. quanto dolore capsaicina-indotto può scoraggiare la respirazione, l'aggiunta di anestesia generale, difficoltà di respirazione possibilmente potrebbe peggiorare. Così, gli sperimentatori non devono utilizzare anesthesics per aumentare la sopravvivenza dei ratti.
- Consegnare la capsaicina compresa fra 12 48 h dopo la nascita (critico).
2. Valutazione del prurito e dermatite in un modello del ratto dell'annuncio
- misura del prurito contando comportamento spontaneo graffio
- preparare plastica chambers (20 x 30 cm x 20 cm) dotato di uno specchio per consentire per una copertura completa per la visualizzazione e fori per permettere i ratti di respirare.
- Set up e regolare una videocamera digitale correttamente per registrare le visite di specchio e viste frontali dei ratti simultaneamente.
- Ratti posto nella plastica dell'alloggiamento e coprire il soffitto della camera con un oggetto pesante per impedire l'apertura di.
- Registrare i comportamenti spontanei dei ratti per 1 h, riprodurre i clip video e contare il numero di comportamenti di grattarsi.
- Valutazione della lesione cutanea usando un sistema di raschiatura
- porre il ratto nella camera induzione.
- Girare il flussometro ossigeno a 2 L/min portata e regolare il vaporizzatore di isoflurane al 3% per l'anestesia.
- Identificare la portata e la gravità della dermatite nelle orecchie e altre parti di un ratto.
- Definire la dimensione dell'unità per la misura delle lesioni cutanee come 0,25 cm 2 e la severità delle lesioni cutanee dalla seguente tabella 1: Indice di gravità; grado di Punteggio di dermatite moltiplicando la portata e la gravità (Vedi punteggio di dermatite in < forte classe = "xfig" > Figura 1B).
3. Esposizione del gassoso FA agli animali
- preparazione della camera per inalazione
- preparare una scatola di vetro acrilico (55 cm x 40 cm x 35 cm) che ha due punti vendita su lati opposti.
- Attenzione. Per la circolazione di gas FA, posizionare la presa superiore l'ingresso e rendere la dimensione della presa più grande di quello della bocca di.
- Attenzione. Per la misurazione della concentrazione di gas interno, su un altro lato delle uscite, trapano tre piccoli passaggi, che possono essere chiuso. Tubi di
- Connetti ad entrambe le prese. Posizionare un tubo di scarico cappa di circolazione o all'esterno dell'edificio per l'emissione del gas e collegare l'altro tubo di presa a un regolatore di ossigeno medicale.
- Posto una gabbia per ratti convenzionali dentro la scatola di vetro acrilico.
- Mettere ratti nella gabbia da una settimana dopo la nascita per 5 settimane (2 ore al giorno e 5 giorni/settimana).
- Sigillare la scatola di vetro acrilico più strettamente possibile per evitare perdite di gas.
Nota: Per a tenuta ermetica, il coperchio della camera dovrebbe contenere in gomma. Applicare la pellicola trasparente per avvolgere il vano per il sigillamento stretto.
- Generazione di gassoso FA utilizzando un regolatore di ossigeno medicale
- sciogliere 5 g di FA in 1 L di acqua.
- Mettere la soluzione FA 0,5% in bottiglia umidificatore del regolatore ossigeno medicale.
- Dopo aver collegato il tubo di ingresso del regolatore di accendere il regolatore e impostare la velocità di flusso a 5 L/min.
- Regolare la concentrazione della soluzione e la percentuale di flusso per determinare la concentrazione di gas nell'alloggiamento.
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Representative Results
L'infiammazione della pelle simil-annuncio di capsaicina-trattati AD modello del ratto a 7 settimane di età è presentato in Figura 1A. Nel Video 1appare robusti graffiare i comportamenti del modello del ratto di annuncio di capsaicina-trattati. Trattamento neonatale capsaicina ha suscitato la dermatite e aggravato graffiare i comportamenti nei ratti di 3 settimane di età, e annuncio-come i sintomi hanno persistito per diverse settimane (Figura 1B, C). Anche se il grado era meno severo, alcuni ratti soffriva di dermatite recidivante a 16 settimane di età dopo risoluzione precoce annuncio-come dei sintomi (Figura 1). Inoltre, il siero livello di IgE, che è un marcatore biologico per gravità AD8, è stato elevato in capsaicina-trattati AD modello del ratto (Figura 1E). Le espressioni di mRNA di IL-4 e IL-13 è aumentato anche nel modello del ratto AD capsaicina-trattati (Figura 1F, G).
Fotografie rappresentative ha mostrato che la FA ha indotto l'aggravamento della dermatite nel modello del ratto di annuncio di capsaicina-trattati a 5 settimane di età (Figura 2A). Esposizione di 1,2 ppm FA aggravato il graffio comportamenti e dermatite nel modello di ratto AD capsaicina-trattati per più di 2 settimane. Tuttavia, l'esposizione 0,8 ppm FA non esacerbare Scratch comportamenti e dermatite nel modello del ratto AD capsaicina-trattati (fig. 2B, C). Inoltre, l'esposizione 1,2 ppm FA elevato il siero IgE livello del modello di ratto AD capsaicina-trattati (Figura 2D).
Per l'esposizione del FA gassoso, la camera di ventilazione è stata istituita come descritto nel protocollo (Figura 3A). Prima dell'esposizione, la concentrazione di FA in aula è stata misurata ripetutamente per garanzia di concentrazione costante. Quando si cambia la concentrazione della soluzione di FA, è stata misurata la concentrazione del gas FA in aula. L'aumento della concentrazione della soluzione, la concentrazione del gas nella camera di aumentata lentamente e la concentrazione del gas nella camera dalla soluzione stessa non hanno variato significativamente in misurazioni ripetute (Figura 3B).
Figura 1: trattamento neonatale capsaicina ha indotto la ricaduta della pelle simile AD infiammazione e prurito in ratti. Fotografie rappresentative di infiammazione della pelle nel ratto capsaicina-trattati (A). Cronologici caratteristiche di dermatite (B) e graffi comportamenti (C) dei ratti capsaicina-trattati. Immagine rappresentativa della ricaduta lesioni cutanee dei ratti trattati con capsaicina 16 settimana-vecchio (D). (E) elevazione significativa dei livelli di IgE del siero in animali trattati con capsaicina. (F) elevazione significativa di espressione di mRNA per IL-4 in animali trattati con capsaicina. (G) elevazione significativa di espressione di mRNA per IL-3 in animali trattati con capsaicina. Tutti i risultati sono stati espressi come mezzi ± SEM e analizzati utilizzando il test t di Student. *p < 0.05, * * p < 0,005, * * *p < 0.001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: esposizione FA aggravato prurito e dermatite nel modello del ratto di capsaicina-trattati AD. Fotografie rappresentative della 5° settimana di trattamento utilizzando 1,2 e 0,8 ppm FA (A). Esposizione di 1,2 ppm FA, ma non l'esposizione di 0,8 ppm FA, esacerbata significativamente prurito (B) e (C) la dermatite nel modello AD capsaicina-trattati. Livello di IgE del siero è aumentato nel modello del ratto di annuncio di capsaicina-trattati trattati con esposizione 1,2 ppm FA (D). Risultati sono stati espressi come mezzo ± SEM e analizzati utilizzando un one-way ANOVA seguita da test di Tukey o test t di Student. *p < 0.05, * * *p < 0.001 (vs ratti esposti all'aria aperta). 1.2 FA-AD: modello del ratto di capsaicina-trattati AD esposti a 1,2 ppm FA; 0,8 FA-AD: modello del ratto di capsaicina-trattati AD esposti a 0,8 ppm FA; e aria-AD: modello di ratto AD capsaicina-trattati esposti all'aria aperta. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: trattamento FA. Illustrazione schematica del regolatore e la camera a gas (A). La concentrazione del gas FA in aula era proporzionata alla concentrazione della soluzione di FA (B). Risultati sono stati espressi come mezzi ± SEM. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Video 1: attacchi di ratti graffiare i comportamenti di capsaicina-trattati sono stati registrati per la misura di prurito. Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)
| Regione | Punteggio ottenuto | Descrizione |
| Tranne le orecchie | 0 | Normale |
| 1 | Wispy pelliccia | |
| 2 | Alopecia o flare | |
| 3 | Sanguinamento o Scab | |
| Orecchie | 0 | Normale |
| 1 | Flare | |
| 2 | Sanguinamento o Scab | |
| 3 | Perdita del tessuto |
Tabella 1: Severity Index.
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Discussion
Il protocollo descritto qui per l'induzione dell'annuncio-come i sintomi in ratti adattabile per studiare la patofisiologia di annuncio e utilizzato come uno strumento di screening per test di droga. Lo strumento per l'esposizione del gassoso FA ai ratti capsaicina-trattati può essere applicato per valutare gli effetti dell'esposizione ai vari gas su diversi modelli animali.
Il modello di annuncio capsaicina-trattati neonatale si basa su una procedura più semplice rispetto ad altri modelli atopiche quali il DNCB trattamento modello9 ed epicutaneous sensibilizzazione modello4ed è più conveniente rispetto a NC/Nga del mouse4. La manifestazione AD-come dei sintomi nel modello di annuncio è coerenza. Inoltre, in alcuni casi, questo protocollo suscita spontaneo recidivante annuncio-come le lesioni cutanee nei ratti commoventi senza alcun trattamento supplementare3. Sovradosaggio capsaicina iniezione evocato un neurone delle cellule morte e neurocutaneous infiammazione10 e causato dolore severo nei ratti. Alcuni di loro forse ha sofferto da arresto respiratorio a causa del dolore. È di importanza per impedire loro di arresto respiratorio. Così, dopo l'iniezione di capsaicina, i cuccioli devono essere collocati in una camera di ossigeno e alcuni cuccioli possono richiedere la compressione toracica. Trattamento di capsaicina neonatale non induce AD-come i sintomi nei topi, e la causa è ancora sconosciuta. Così, intervento genetico è difficilmente applicabile a questo modello di annuncio utilizzando un ceppo di knock-out, ma altri approcci genetici come siRNA plausibilmente compensare questa lacuna. Inoltre, la manifestazione coerenza AD-come dei sintomi del modello del ratto è utile per studiare la patogenesi della malattia AD, come pure l'applicazione di uno strumento di screening droga.
L'istituzione della camera circolatoria per l'esposizione FA richiede solo attrezzature di laboratorio convenzionali, tra cui una scatola acrilica e un regolatore di ossigeno medicale. Modificando la soluzione in bottiglia umidificatore del regolatore dell'ossigeno, diversi tipi di gas possono inoltre essere applicati nell'esperimento. Concentrazione di gas nell'alloggiamento può essere effettuato facilmente regolando la portata del regolatore e la concentrazione della soluzione. È fondamentale per garantire una tenuta nell'installazione del sistema circolatorio per esposizione FA per il modello del ratto AD capsaicina-trattati usando un alloggiamento acrilico e un regolatore di ossigeno medicale. Non solo perché la concentrazione di gas nell'alloggiamento potrebbe variare ogni volta dovuto la perdita, ma anche le eventuali perdite di gas possono danneggiare gli sperimentatori. Vaporizzazione di alcuni composti organici volatili (VOC) spesso blocca il tubo da cristallizzazione. Così, è rilevante per evitare ostruzioni attraverso gestione tubo continuo per uso a lungo termine sostituendo regolarmente i tubi. Questo sistema di vaporizzazione riflette più precisamente la progressione di malattia nei pazienti rispetto ai metodi di applicazione topica11. Questo metodo ha rivelato le caratteristiche distinte degli effetti di inalazione FA su un modello del ratto dell'annuncio rispetto agli studi precedenti che esposti FA al ingenuo animali7,12.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta dal pubblico benessere & programma di ricerca di sicurezza attraverso National Research Foundation di Corea (NRF) finanziato dal Ministero dell'istruzione, della scienza e della tecnologia (NRF-2014M3C8A5030612) e supportato da The Chung Yang, Cha Young Sole, M.D. e Jang Ciao Joo Yeu Sa Memorial Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medical Oxygen Regulator | Yuyao Jiahua Medical | manufacturer will not affect results | |
| Tube | manufacturer will not affect results | ||
| Acrylic Chamber | Taejin Acryl | manufacturer will not affect results | |
| Plastic Chamber | Taejin Acryl | manufacturer will not affect results | |
| Paraformaldehyde, powder | Sigma | 158127 | manufacturer will not affect results |
| Wrap filme | Uniwrap | manufacturer will not affect results | |
| Capsaicin | Sigma | M2028 | manufacturer will not affect results |
| Tween 80 | Sigma | P4780 | manufacturer will not affect results |
| Digital Video Camera | Sony | HDR-CX380y | manufacturer will not affect results |
| Isoflurane | JW pharmaceutical | manufacturer will not affect results |
References
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