Summary
Här beskriver vi metoder för neonatal capsaicin behandling att inducera atopisk dermatit hos råttor och exponering av förångade formaldehyd att undersöka effekterna av formaldehyd inandning på atopisk dermatit.
Abstract
Atopisk dermatit skovvis kroniskt kliande eksem och råder runt världen, särskilt i utvecklade länder. Komplext samspel mellan genetiska faktorer och miljöfaktorer är kända för att spela en viktig roll i patofysiologin av atopisk dermatit. Dock saknar vi fortfarande en detaljerad bild av patogenesen vid denna sjukdom. Därför är det av vikt att utveckla lämpliga djurmodeller för att belysa utvecklingen av atopisk dermatit. Dessutom expanderar undersöker effekten av miljöfaktorer såsom luftföroreningar på atopisk dermatit förståelse av sjukdomen. Här, beskriver vi en metod för att inducera atopisk dermatit hos råttor med neonatal capsaicin behandling och ett protokoll för exponering av en konstant koncentration av formaldehyd till råttor att avslöja effekter på utvecklingen av atopisk dermatit hos barn och ungdomar perioder. Dessa protokoll har tillämpats framgångsrikt på flera experiment och kan användas för andra ämnen.
Introduction
För att förhöra effekterna av formaldehyd (FA) inandning på atopisk dermatit (AD) progression, vi etablerade ett protokoll för AD induktion och utvecklade en konventionell omsättning kammare för kronisk exponering av FA.
AD är en kronisk inflammatorisk hudsjukdom som tillskrivs de komplexa interaktioner mellan genetisk predisposition och miljömässiga triggers1,2. Att studera AD i prekliniska tillstånd krävs en lämplig djurmodell. Detta är viktigast när belysa patogenesen av AD under påverkan av miljöfaktorer. Dessutom, för att bättre undersöka effekterna av de miljömässiga triggers på AD progression, det är viktigt att separera de enskilda miljöfaktorer och kvantifiera graden av exponering.
Vi har visat en ny råtta modell av AD som induceras av neonatal capsaicin behandling. Denna annons modell3 har några meriter över andra AD modeller såsom AD modellerna framkallas genom epikutan sensibilisering, de genetiskt manipulerade AD modellerna och de spontana musmodeller av AD4. Först, denna modell framkallar AD-liknande symtom vid en ålder av 3 veckor, vilket motsvarar spädbarn AD och är tidigare än andra spontana musmodeller av AD såsom NC/Nga musen. I vissa fall, till skillnad från de genetiskt manipulerade AD modellerna, symptomen av AD modeller avta och återfall spontant under en 20-veckorsperiod. Induktion processen för AD-liknande symtom i modellen är dessutom lättare än den epikutan sensibilisering modellen, som är mer lik den allergisk kontaktdermatit i perspektivet av induktion processen.
Vi har infört det nya protokollet för FA exponering för en djurmodell med hjälp av en akrylglas-kammare och en konventionell medicinsk syrgas regulatorn5 för att studera effekterna av FA inandning på utvecklingen av AD i infantil och ungdomar perioder. Regulatorn har tillåtit oss att exponera djuren till en konstant koncentration av gas genom att justera flödesvärden och koncentrationen i lösning. Tidigare studier har rapporterat flera sätt för FA exponering för djurmodeller. Xu et al. beskrivs metoden exponering i vilka FA lösningen applicerades direkt till hud6. En annan färsk studie upp protokollet av FA gas exponering med hjälp av en specialiserad flyktiga lösningsmedel generator, modell 49127. Jämfört med metoder av tidigare studier, den nya metoden är mer enkelt utrustad och kan tillämpas för andra lösningar förutom FA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alla metoderna som beskrivs här har godkänts av de internationella djur vård och användning kommittén (IACUC) i Korea University College av medicin. 6 veckor efter födseln, praktiker kan inducera enthansasia och samla olika prover, såsom huden och serum hos råttor.
1. induktion av AD av Neonatal Capsaicin behandling
- för att förbereda 5 mg/mL capsaicin lösning, tillsätt 50 mg kapsaicin 1 ml Tween 80 och 1 mL 100% etanol i en 15 mL koniska rör.
- Tillsätt 8 mL fysiologisk koksaltlösning till konisk röret. Skaka tuben kraftigt tills ingen åtskilda lager är synliga
- capsaicin lösningen (10 µL/g) injiceras i subkutan vävnad, på mittlinjen och baksidan av halsen på en neonatal Sprague-Dawley-råttor.
- Leverera capsaicin mellan 12 h-48 h efter födseln (kritisk).
Obs: Om injektionen är försenat mer än några dagar, dermatit kommer inte utveckla eller det kommer att finnas kvar bara några veckor. Om injektionen är för tidigt, andnöd kan uppstå på grund av svår smärta. - Att förhindra neonatala råttor från andningsstillestånd på grund av capsaicin injektion, tryck på bröstkorgen nyfödda vill uppmuntra andning eller behålla nyfödda i en syre kammare tills andningen blir normal. eftersom capsaicin-inducerad smärta kan avskräcka andning, lägga narkos kan eventuellt förvärra andningssvårigheter. Således, praktiker bör inte använda anesthesics för att öka överlevnaden hos råttor.
- Leverera capsaicin mellan 12 h-48 h efter födseln (kritisk).
2. Utvärdering av klåda och eksem i en råtta modell av AD
- mätning av klåda genom att räkna spontana avlysningen beteende
- Förbered plast chambers (20 x 30 cm x 20 cm) utrustad med en spegel för att möjliggöra full täckning för visning och hål så att råttorna att andas.
- Ställa upp och justera en digital videokamera ordentligt för att registrera spegel utsikt och direkt utsikt över råttorna samtidigt.
- Plats råttor i plast kammare och täcka taket på kammaren med ett tungt föremål att förhindra öppnas.
- Spela in spontana beteenden av råttor för 1 h, spela upp videoklipp och räkna antalet repor beteenden.
- Bedömning av hudförändring som använder ett poängsystem
- Placera råtta i induktion kammaren.
- Slå syre flödesmätarens-2 L/min flow rate och justera den isofluran spridare till 3% för anestesi.
- Identifiera omfattning och svårighetsgrad av eksem i öronen och andra delar av en råtta.
- Definiera enhet storleken för omfattningen av hudlesioner som 0,25 cm 2 och svårighetsgraden av hudskador av följande tabell 1: svårighetsgrad index; grad av dermatit poäng multipliceras omfattning och svårighetsgrad (se dermatit Poäng i < stark klass = ”xfig” > figur 1B).
3. Exponering för gasformiga FA för djur
- beredning av inandning kammaren
- förbereda en akryl glas låda (55 cm x 40 cm x 35 cm) som har två uttag på motsatta sidor.
- Försiktighet. För cirkulation av FA gas, placera utloppet högre än inloppet och se storleken på uttaget större än inloppet.
- Försiktighet. För mätning av inre gaskoncentration, på en annan sida av uttagen, borra tre små passager, som kan stängas.
- Anslut rör till både butiker. Placera en outlet röret omsättning Hood eller utanför byggnaden för utsläpp av gas och Anslut andra utlopp röret till en medicinsk syrgasregulator.
- Placera en konventionell råtta buren inuti rutan akrylglas.
- Sätta råttor i buren från en vecka efter födelsen för 5 veckor (2 h/dag och 5 dagar i veckan).
- Tätning rutan akrylglas så tätt som möjligt för att förhindra gasläckage.
Obs: För tight tätning, kammare locket bör innehålla gummi. Tillämpa plastfilm att Linda kammaren för snäva tätning.
- Generation av gasformiga FA med hjälp av en medicinsk syrgasregulator
- Lös 5 g FA till 1 L vatten.
- Sätta 0,5% FA lösningen i luftfuktare flaskan av den medicinska syrgasregulator.
- Efter anslutning inlopp röret till regulatorn, slå på regulatorn och Ställ av flöde till 5 L/min.
- Justera lösning koncentrationen och flödet att bestämma koncentrationen av gas i kammaren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
AD-gillar flår inflammation av capsaicin-behandlade AD råtta modell vid 7 veckors ålder presenteras i figur 1A. Robust avlysningen beteenden av capsaicin-behandlade AD råtta modell visas i Video 1. Neonatal capsaicin behandling framkallade dermatit och förvärrat repa beteenden hos råttor 3 veckors ålder, och AD-liknande symtom kvarstod under flera veckor (figur 1B, C). Om graden var mindre allvarliga, lidit några råttor från skovvis dermatit vid 16 veckors ålder efter upplösning av tidiga AD-liknande symtom (figur 1 d). Dessutom upphöjdes serum IgE nivå, som är en biologisk markör för AD svårighetsgrad8, i capsaicin-behandlade AD råtta modellen (figur 1E). De mRNA-uttryck av IL-4 och IL-13 ökade också i capsaicin-behandlade AD råtta modellen (figur 1F, G).
Representativa fotografier visade att FA inducerad aggravationen av dermatit i capsaicin-behandlade AD råtta modellen vid 5 veckors ålder (figur 2A). Exponering av 1,2 ppm FA förvärrat de skrapa beteenden och dermatit hos capsaicin-behandlade AD råtta modell för mer än 2 veckor. Dock förvärra 0,8 ppm FA exponering inte avlysningen beteenden och dermatit i capsaicin-behandlade AD råtta modellen (figur 2B, C). Dessutom förhöjda 1,2 ppm FA exponering serum IgE nivå i capsaicin-behandlade AD råtta modellen (figur 2D).
För exponering av gasformiga FA inrättades ventilation kammaren som beskrivs i protokollet (figur 3A). Före exponering mättes koncentrationen av FA i kammaren upprepade gånger för kvalitetssäkring av konsekvent koncentration. När du ändrar koncentrationen av FA lösning, mättes koncentrationen av gasformiga FA i kammaren. Koncentrationen av lösningen ökade, koncentrationen av gas i kammaren långsamt ökas och koncentrationen av gas i kammaren från samma lösning inte variera betydligt i upprepade mätningar (figur 3B).
Figur 1: Neonatal Capsaicin behandling inducerad skovvis AD-gillar flår Inflammation och klåda i råttor. Representativa fotografier av hudinflammation hos capsaicin-behandlade råtta (A). Kronologisk dragen av dermatit (B) och avlysningen beteenden (C) av capsaicin-behandlade råttor. Representativ bild av skovvis hudskador av 16 veckor gamla capsaicin-behandlade råttor (D). (E) betydande förhöjda serum IgE-nivåer i capsaicin-behandlade djur. (F) betydande höjning av IL-4 mRNA uttryck i capsaicin-behandlade djur. (G) betydande höjning av IL-3 mRNA uttryck i capsaicin-behandlade djur. Alla resultat var uttryckt innebär ± SEM och analyseras med Students t-test. *p < 0,05, ** p < 0,005, ***p < 0,001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: FA exponering förvärrat klåda och eksem i Capsaicin-behandlade AD råtta modellen. Representativa fotografier i 5: e veckan av behandling med 1,2 ppm och 0,8 ppm FA (A). Exponering av 1,2 ppm FA, men inte 0,8 ppm FA exponering, avsevärt förvärras pruritus (B) och dermatit (C) i capsaicin-behandlade AD modellen. Serum IgE nivån ökade i capsaicin-behandlade AD råtta modellen behandlas med 1,2 ppm FA exponering (D). Resultaten uttrycktes som betyder ± SEM och analyseras med en envägs ANOVA följt av Tukey's test eller Students t-test. *p < 0,05, ***p < 0,001 (vs råttor utsätts för frisk luft). 1.2 FA-AD: Capsaicin-behandlade AD råtta modell utsätts för 1,2 ppm FA; 0,8 FA-AD: Capsaicin-behandlade AD råtta modell utsätts för 0,8 ppm FA; och luft-AD: capsaicin-behandlade AD råtta modell utsätts för frisk luft. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: FA behandling. Schematisk illustration av tillsynsmyndigheten och gaskammaren (A). Koncentrationen av gasformiga FA i kammaren var proportionerlig mot koncentrationen av FA lösning (B). Resultaten uttrycktes som betyder ± SEM. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Video 1: anfall av repa beteenden av Capsaicin-behandlade råttor registrerades för mätning av Pruritus. Vänligen klicka här för att se denna video. (Högerklicka för att ladda ner.)
| Region | Poäng | Beskrivning |
| Utom öron | 0 | Normal |
| 1 | Stripig päls | |
| 2 | Alopeci eller flare | |
| 3 | Blödning eller didn | |
| Öronen | 0 | Normal |
| 1 | Flare | |
| 2 | Blödning eller didn | |
| 3 | Förlust av vävnad |
Tabell 1: Severity Index.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet beskrivs här för induktion av AD-liknande symtom hos råttor kan anpassas för att studera AD patofysiologi och används som en screeningmetod för drogtest. Instrumentet för gasformiga FA exponering för kapsaicin-behandlade råttor kan användas för att utvärdera effekterna av exponering för olika gaser på olika djurmodeller.
Neonatal capsaicin-behandlade AD modellen bygger på ett enklare förfarande än andra atopisk modeller såsom DNCB behandling modell9 och epikutan sensibilisering modell4, och är mer prisvärd än den NC/Nga mus4. Manifestationen av AD-liknande symtom i AD modellen är konsekvent. Dessutom i vissa fall framkallar detta protokoll spontana skovvis AD-liknande hudförändringar i drabbade råttor utan någon ytterligare behandling3. Överdosering capsaicin injektion framkallat neuronala cell död och neurocutaneous inflammation10 och orsakade svår smärta i råttor. Några av dem möjligen drabbades av andningsstillestånd på grund av smärtan. Det är viktigt att hindra dem från andningsstillestånd. Således efter injektionen capsaicin valparna bör placeras i en syre kammare och vissa valpar kan kräva bröstet komprimering. Neonatal capsaicin behandling inducerar inte AD-liknande symtom hos möss, och orsaken till detta är fortfarande okänd. Således, genetisk intervention är knappast tillämplig på denna annons modell med en knock-out stam, men andra genetiska metoder såsom siRNA kompensera plausibly denna brist. Konsekvent manifestationen av AD-liknande symtom av råtta modell är dessutom fördelaktigt för studerar AD sjukdomspatogenes, samt tillämpa det på ett drug screeningverktyg.
Inrättandet av cirkulatorisk kammaren för FA exponering kräver endast konventionella laboratorieutrustning inklusive en akryl box och en medicinsk oxygen regulator. Dessutom genom att ändra lösningen i luftfuktare flaska syrgas regulatorn, kan olika typer av gaser användas i försöket. Koncentrationen av gas i kammaren kan enkelt underhållas genom att justera flödet klassar av regulatorn och koncentrationen av lösningen. Det är viktigt att säkerställa en tät tätning i installationen av cirkulationssystemet för FA exponering för kapsaicin-behandlade AD råtta modellen med en akryl kammare och en medicinsk oxygen regulator. Inte bara eftersom koncentrationen av gas i kammaren kunde skilja sig varje gång på grund av läckage, men också den läckande gas kan skada praktiker. Förångning av vissa flyktiga organiska föreningar (VOC) ofta blockerar röret av kristallisation. Det är således relevant att undvika igensättning genom kontinuerlig tube förvaltning för långvarig användning genom att regelbundet byta rören. Detta förångning system återspeglar mer exakt sjukdomsutvecklingen hos patienter än topikal applicering metoder11. Denna metod visade distinkta funktioner av effekterna av FA inandning på en råtta modell av AD jämfört med de tidigare studier som utsatta FA till naiva djur7,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av den offentliga välfärden & säkerhet forskningsprogrammet genom den nationella Research Foundation i Korea (NRF) finansieras av ministeriet för utbildning, vetenskap och teknik (NRF-2014M3C8A5030612), och stöds av The Chung Yang, Cha Young Solen, M.D. och Jang Hej Joo Yeu Sa Memorial fond.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medical Oxygen Regulator | Yuyao Jiahua Medical | manufacturer will not affect results | |
| Tube | manufacturer will not affect results | ||
| Acrylic Chamber | Taejin Acryl | manufacturer will not affect results | |
| Plastic Chamber | Taejin Acryl | manufacturer will not affect results | |
| Paraformaldehyde, powder | Sigma | 158127 | manufacturer will not affect results |
| Wrap filme | Uniwrap | manufacturer will not affect results | |
| Capsaicin | Sigma | M2028 | manufacturer will not affect results |
| Tween 80 | Sigma | P4780 | manufacturer will not affect results |
| Digital Video Camera | Sony | HDR-CX380y | manufacturer will not affect results |
| Isoflurane | JW pharmaceutical | manufacturer will not affect results |
References
- Geha, R. S. Allergy and hypersensitivity. Nature versus nurture in allergy and hypersensitivity. Curr Opin Immunol. 15 (6), 603-608 (2003).
- Novak, N., Bieber, T., Leung, D. Y. Immune mechanisms leading to atopic dermatitis. The J Allergy Clin Immunol. 112 (Suppl 6), S128-S139 (2003).
- Back, S. K., et al. Chronically relapsing pruritic dermatitis in the rats treated as neonate with capsaicin; a potential rat model of human atopic dermatitis. J Dermatol Sci. 67 (2), 111-119 (2012).
- Jin, H., He, R., Oyoshi, M., Geha, R. S.
- Han, R. T., et al. Formaldehyde-Induced Aggravation of Pruritus and Dermatitis Is Associated with the Elevated Expression of Th1 Cytokines in a Rat Model of Atopic Dermatitis. PLOS ONE. 11 (12), e0168466 (2016).
- Xu, B., Aoyama, K., Takeuchi, M., Matsushita, T., Takeuchi, T. Expression of cytokine mRNAs in mice cutaneously exposed to formaldehyde. Immunol Lett. 84 (1), 49-55 (2002).
- Kim, J. Y., Jeong, M. S., Park, K. Y., Seo, S. J. Aggravation of atopic dermatitis-like symptoms by consecutive low concentration of formaldehyde exposure in NC/Nga mice. Exp Dermatol. 22 (3), 219-221 (2013).
- Laske, N., Niggemann, B. Does the severity of atopic dermatitis correlate with serum IgE levels? Pediatr Allergy Immunol. 15 (1), 86-88 (2004).
- Fujii, Y., Takeuchi, H., Sakuma, S., Sengoku, T., Takakura, S. Characterization of a 2,4-dinitrochlorobenzene-induced chronic dermatitis model in rats. Skin Pharmacol Physiol. 22 (5), 240-247 (2009).
- Sugimoto, T., Xiao, C., Ichikawa, H. Neonatal primary neuronal death induced by capsaicin and axotomy involves an apoptotic mechanism. Brain Res. 807 (1-2), 147-154 (1998).
- Saito, A., et al. Characterization of skin inflammation induced by repeated exposure of toluene, xylene, and formaldehyde in mice. Environ Toxicol. 26 (3), 224-232 (2011).
- Jung, W. W., et al. Formaldehyde exposure induces airway inflammation by increasing eosinophil infiltrations through the regulation of reactive oxygen species production. Environ Toixcol Pharmacol. 24 (2), 174-182 (2007).
