Summary
Wir beschreiben hier Methoden für neonatale Capsaicin Behandlung atopischen Dermatitis bei Ratten und Exposition von verdampftem Formaldehyd zu untersuchen, die Wirkungen von Formaldehyd Inhalation auf atopische Dermatitis zu induzieren.
Abstract
Atopischer Dermatitis ist chronisch rezidivierend juckende Ekzeme und auf der ganzen Welt, vor allem in den Industrieländern herrscht. Komplexe Wechselwirkungen zwischen genetischen und umweltbedingten Faktoren sind dafür bekannt, eine wichtige Rolle in der Pathophysiologie der atopischen Dermatitis. Allerdings fehlt uns noch ein detailliertes Bild über die Pathogenese dieser Krankheit. Daher ist es wichtig, geeignete Tiermodelle für die Aufklärung des Fortschreitens der Neurodermitis zu entwickeln. Darüber hinaus erweitert die Untersuchung der Wirkung von Umweltfaktoren wie Luftschadstoffe auf atopische Dermatitis Verständnis der Krankheit. Hier beschreiben wir eine Methode zur Induktion von atopischer Dermatitis bei Ratten mit Neugeborenen Capsaicin Behandlung und ein Protokoll für eine konstante Konzentration von Formaldehyd ausgesetzt Ratten, die Auswirkungen auf die Entwicklung von Neurodermitis im kindlichen und Jugendlichen enthüllen Perioden. Diese Protokolle erfolgreich angewandt worden, um verschiedene Experimente und können für andere Substanzen verwendet werden.
Introduction
Um die Wirkungen von Formaldehyd (FA) Inhalation auf atopische Dermatitis (AD) Fortschreiten zu befragen, wir ein Protokoll für AD Induktion gegründet und entwickelt eine herkömmliche Zirkulation Kammer für chronische Exposition der FA.
AD ist eine chronische entzündliche Hautkrankheit zurückzuführen auf die komplexen Wechselwirkungen zwischen genetischen Prädisposition und umweltbedingte Auslöser1,2. Eine ordnungsgemäße Tiermodell ist erforderlich, um AD in der präklinischen Staat zu studieren. Dies ist am wichtigsten bei die Pathogenese von AD unter dem Einfluss von Umweltfaktoren Aufklärung. Darüber, um die Auswirkungen der umweltbedingte Auslöser auf den AD-Verlauf besser zu untersuchen, ist es wichtig zu trennen die einzelnen Umweltfaktoren und den Grad der Exposition zu quantifizieren.
Wir haben eine neuartige Rattenmodell Ad induziert durch Neugeborenen Capsaicin Behandlung gezeigt. Dieses AD-Modell3 hat einige Vorteile über anderen AD-Modelle wie die AD-Modelle durch Epicutan Sensibilisierung, die gentechnisch AD-Modelle und die spontane Mausmodellen AD4induziert. Erstens entwickelt dieses Modell AD-ähnliche Symptome im Alter von 3 Wochen, Kleinkind AD entspricht und ist früher als andere spontane Mausmodelle der AD wie der NC/Nga-Maus. In einigen Fällen, im Gegensatz zu den gentechnisch AD-Modellen die Symptome der AD Modelle nachlassen und Rückfall spontan über einen Zeitraum von 20 Wochen. Darüber hinaus ist der Einführungsprozess von AD-ähnliche Symptome im Modell leichter als das des Modells Epicutan Sensibilisierung, die allergische Kontaktdermatitis im Hinblick auf die Induktion-Prozess mehr ähnelt.
Wir haben das neue Protokoll für FA Exposition gegenüber einem Tiermodell mithilfe einer Acryl-Glas-Kammer und eine konventionelle medizinische Sauerstoff Regler5 Studie zu den Auswirkungen der FA Inhalation auf die Entwicklung von AD in kindlichen und Jugendlichen Zeiten eingeführt. Der Regler ermöglichte uns, die Tiere auf eine konstante Konzentration des Gases durch eine Anpassung der Volumenströme und die Lösungskonzentration verfügbar zu machen. Frühere Studien haben mehrere Möglichkeiten der Exposition der FA an Tiermodellen berichtet. Xu Et Al. beschrieben die Belichtungsmethode in welcher, die FA Lösung direkt auf die Haut6angewandt wurde. Eine weitere aktuelle Studie behandelt das Protokoll der FA Gas Exposition mit einem spezialisierten flüchtige Lösungsmittel-Generator Modell 49127. Im Vergleich zu früheren Studien, die neue Methode ist einfacher ausgestattet und kann für andere Lösungen neben FA angewendet werden.
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Protocol
alle hier beschriebene Methoden wurden von der International Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der Korea University College of Medizin. 6 Wochen nach der Geburt genehmigt, Experimentatoren können Enthansasia zu induzieren und sammeln verschiedene Proben wie die Haut und das Serum von Ratten.
1. Induktion von AD von Neugeborenen Capsaicin Behandlung
- um 5 mg/mL Capsaicin Lösung vorzubereiten, 50 mg Capsaicin hinzufügen 1 mL Tween 80 und 1 mL 100 % Ethanol in einem 15 mL konische Röhrchen.
- 8 mL normale Kochsalzlösung hinzufügen das konische Rohr. Das Rohr kräftig schütteln, bis keine getrennten Ebenen sichtbar sind
- injizieren die Capsaicin-Lösung (10 µL/g) in das subkutane Gewebe an der Mittellinie und Hinterseite des Halses eine neonatale Sprague-Dawley Ratten.
- Liefern das Capsaicin zwischen 12 h bis 48 h nach der Geburt (kritische).
Hinweis: Wenn die Injektion um mehr als ein paar Tage verzögert, Dermatitis wird nicht entwickeln oder es wird nur für einige Wochen anhalten. Wenn die Injektion zu früh ist, Atemnot aufgrund starker Schmerzen auftreten kann. - Neugeborene Ratten von Atemstillstand aufgrund der Capsaicin-Injektion zu verhindern drücken die Brust des Neugeborenen zu fördern atmen oder halten die Neugeborenen in einer Sauerstoff-Kammer, bis die Atmung Normal. wird da Capsaicin-induzierte Schmerzen können Atmung zu entmutigen, Hinzufügen von Vollnarkose könnte möglicherweise Atembeschwerden verschlimmern. So sollten Experimentatoren nicht Medizinliteratur zum Überleben der Ratten zu erhöhen verwenden.
- Liefern das Capsaicin zwischen 12 h bis 48 h nach der Geburt (kritische).
2. Bewertung von Pruritus und Dermatitis in einem Rattenmodell der AD
- Messung der Juckreiz durch spontane Kratzer Verhalten zählen
- Prepare Kunststoff Kammern (20 x 30 cm x 20 cm) ausgestattet mit einem Spiegel, um volle Deckung zu ermöglichen für die Anzeige und Löcher um die Ratten zu atmen zu ermöglichen.
- Set up und stellen Sie eine digitale Videokamera richtig, um den Spiegel und vorderen Ansichten der Ratten gleichzeitig aufnehmen.
- Ort Ratten in der Kunststoff-Kammer und decken die Decke der Kammer mit einem schweren Gegenstand zu öffnen zu verhindern.
- Die spontane Verhalten der Ratten für 1 h aufzeichnen, Abspielen der video-Clips und die Anzahl der Verhaltensweisen kratzen.
- Beurteilung der Hautveränderung ein scoring-System mit
- legen Sie die Ratte in der Induktion Kammer.
- Schalten Sie die Sauerstoff-Flowmeter bis 2 L/min Durchfluss und anpassen den Verdampfer Isoflurane auf 3 % für die Anästhesie.
- Das Ausmaß und die schwere Dermatitis in den Ohren und anderen Teilen einer Ratte zu identifizieren.
- Definieren die Größe der Einheit für den Umfang der Hautläsionen als 0,25 cm 2 und dem Schweregrad der Hautveränderungen durch folgende Tabelle 1: Severity Index, Grad der Dermatitis Punktzahl multipliziert das Ausmaß und die schwere (siehe Dermatitis Score in < starke Klasse = "Xfig" > Figur 1 b).
3. Exposition von gasförmigen FA Tiere
- Vorbereitung der Inhalation Kammer
- bereiten eine Acrylglas-Box (55 cm x 40 cm x 35 cm), die hat zwei Ausgänge auf gegenüberliegenden Seiten.
- Vorsicht. Für den Umlauf der FA Gas höher als den Einlass Auslass und die Größe der Austrittsöffnung größer ist als die des Einlasses.
- Vorsicht. Für die Messung der internen Gaskonzentration, auf der anderen Seite der Verkaufsstellen, Bohren Sie drei kleine Gänge, die geschlossen werden können.
- Rohre verbinden beide Outlets. Legen Sie ein Auslassrohr Zirkulation Haube oder außerhalb des Gebäudes für die Emission des Gases, und verbinden Sie die anderen Auslaufrohr mit einer medizinischen Sauerstoff-Regler.
- Legen Sie eine konventionelle Rattenkäfig in der Acrylglas-Box.
- Legen Ratten in den Käfig von einer Woche nach der Geburt für 5 Wochen (2 h/Tag und 5 Tage/Woche).
- Dichtung die Acrylglas-Box so eng wie möglich um Gasaustritt zu vermeiden.
Hinweis: Für enge Abdichtung sollte der Deckel Kautschuk enthalten. Klarsichtfolie wickeln die Kammer für enge Abdichtung anzuwenden.
- Generation von gasförmigen FA mithilfe eines medizinischen Sauerstoff-Reglers
- FA 5 g in 1 L Wasser auflösen.
- Setzen Sie die 0,5 % FA Lösung im Befeuchterflasche der medizinischen Sauerstoff-Regler.
- Nach dem Anschluss der Schlauch am Regler einschalten des Reglers und den Durchfluss bis 5 L/min.
- Stellen Sie die Lösungskonzentration und der Durchflussmenge die Konzentration des Gases in der Kammer bestimmt.
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Representative Results
Die AD-wie Hautentzündung der Capsaicin-behandelten AD Rattenmodell 7 Wochen alt ist in Figur 1Apräsentiert. Robuste kratzende Verhaltensweisen von Capsaicin behandelt AD Rattenmodell ist in Video 1dargestellt. Neonatale Capsaicin Behandlung Dermatitis ausgelöst und verschlimmert kratzen Verhaltensweisen bei Ratten 3 Wochen alt, und AD-ähnliche Symptome blieb für mehrere Wochen (Abbildung 1 b, C). Obwohl der Grad weniger schwerwiegend war, litt einige Ratten rezidivierende Dermatitis bei 16 Wochen alt nach Auflösung der frühen AD-ähnliche Symptome (Abbildung 1). Darüber hinaus wurde Serum IgE Ebene, ein biologischer Marker für AD schwere8, Capsaicin behandelt AD Ratte Modell (Abbildung 1E) erhoben. Die mRNA-Ausdrücke von IL-4 und IL-13 stieg auch in das Capsaicin behandelt AD Rattenmodell (Abb. 1F, G).
Repräsentative Fotos zeigten, dass FA die Verschlimmerung von Dermatitis im Capsaicin behandelt AD Rattenmodell 5 Wochen alt (Abbildung 2A) induziert. Exposition von 1,2 ppm FA verschärft kratzen Verhaltensweisen und Dermatitis in Capsaicin behandelt AD Rattenmodell für mehr als 2 Wochen. Jedoch verschärfen nicht 0,8 ppm FA Exposition kratzen Verhaltensweisen und Dermatitis im Capsaicin behandelt AD Rattenmodell (Abb. 2 b, C). Darüber hinaus erhöhte 1,2 ppm FA Exposition das Serum IgE Ebene im Capsaicin behandelt AD Rattenmodell (Abb. 2D).
Für die Ausstellung des gasförmigen FA wurde die Belüftungskammer eingerichtet, wie im Protokoll (Abbildung 3A) beschrieben. Vor der Belichtung wurde die Konzentration der FA in der Kammer wiederholt zur Sicherstellung der konsequente Konzentration gemessen. Wenn Sie die Konzentration der FA Lösung zu ändern, wurde die Konzentration der gasförmigen FA in der Kammer gemessen. Mit zunehmender Konzentration der Lösung die Konzentration des Gases in der Kammer langsam gesteigert und die Konzentration des Gases in der Kammer von der gleichen Lösung nicht bei wiederholten Messungen (Abb. 3 b) sehr unterschiedlich sein.
Abbildung 1: neonatale Capsaicin Behandlung induziert, rezidivierende AD-wie Hautentzündung und Juckreiz bei Ratten. Repräsentative Fotografien von Entzündungen der Haut bei Capsaicin behandelten Ratten (A). Chronologische Funktionen von Dermatitis (B) und kratzend Verhaltensweisen (C) der Capsaicin-behandelten Ratten. Repräsentatives Bild der rezidivierende Hautveränderungen von 16 Wochen alten Capsaicin behandelten Ratten (D). (E) signifikante Erhöhung des Serum-IgE-Spiegel bei Capsaicin-behandelten Tieren. (F) signifikante Erhöhung von IL-4 mRNA Expression in Capsaicin-behandelten Tieren. (G) signifikante Erhöhung der IL-3 mRNA Expression in Capsaicin-behandelten Tieren. Alle Ergebnisse zum Ausdruck gebracht wurden, als ± SEM bedeutet und mit dem Student t-Test analysiert. *p < 0,05, ** p < 0,005, ***p < 0,001. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: FA Exposition verschlimmert, Pruritus und Dermatitis in Capsaicin behandelt AD Rattenmodell. Repräsentative Fotografien der 5th Woche der Behandlung mit 1,2 ppm und 0,8 ppm FA (A). Exposition von 1,2 ppm FA aber nicht 0,8 ppm FA Exposition deutlich verschärft, Pruritus (B) und Dermatitis (C) in das Capsaicin behandelt-AD-Modell. IgE-Serumspiegel erhöht in der Capsaicin-behandelten AD Rattenmodell mit 1,2 ppm FA Exposition (D) behandelt. Ergebnisse wurden als Mittel ± SEM und über eine einfache ANOVA, gefolgt von Tukey Test oder der Student t-Test analysiert. *p < 0,05, ***p < 0,001 (Vs Ratten ausgesetzt an die frische Luft). 1.2 FA-AD: Capsaicin behandelt AD Rattenmodell 1,2 ppm FA ausgesetzt; 0,8 FA-AD: Capsaicin behandelt AD Rattenmodell ausgesetzt bis 0,8 ppm FA; und Luft-AD: Capsaicin behandelt AD Rattenmodell ausgesetzt, an die frische Luft. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Behandlung der FA. Schematische Darstellung des Reglers und der Gaskammer (A). Die Konzentration von gasförmigen FA in der Kammer war proportional zur Konzentration des FA Lösung (B). Ergebnisse wurden als Mittel ± SEM Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
Video 1: Anfälle von kratzen Verhaltensweisen der Capsaicin-behandelten Ratten wurden für die Messung des Pruritus. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)
| Region | Partitur | Beschreibung |
| Außer Ohren | 0 | Normal |
| 1 | Wispy Fell | |
| 2 | Alopezie oder flare | |
| 3 | Blutungen oder Schorf | |
| Ohren | 0 | Normal |
| 1 | Fackel | |
| 2 | Blutungen oder Schorf | |
| 3 | Verlust des Gewebes |
Tabelle 1: Severity Index.
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Discussion
Das Protokoll für die Induktion von AD-ähnliche Symptome bei Ratten hier beschrieben kann angepasst für das Studium AD Pathophysiologie und als Screening-Instrument für Drogen-Test verwendet werden. Das Instrument für die Exposition des gasförmigen FA Capsaicin behandelten Ratten kann angewendet werden, um die Auswirkungen der Exposition gegenüber verschiedenen Gase auf verschiedenen Tiermodellen zu bewerten.
Die neonatale Capsaicin behandelt-AD-Modell stützt sich auf eine einfachere Verfahren als andere atopische Modelle wie das DNCB Behandlung Modell9 und Epicutan Sensibilisierung Modell4und ist günstiger als die NC/Nga Maus4. Die Manifestation des AD-ähnliche Symptome in der AD-Modell entspricht. Darüber hinaus in einigen Fällen löst dieses Protokolls spontane schubförmig AD-ähnliche Hautveränderungen bei den betroffenen Ratten ohne jede weitere Behandlung3. Überdosis Capsaicin Injektion neuronale Zelle Tod und neurokutanen Entzündung10 hervorgerufen und verursacht starken Schmerzen in den Ratten. Einige von ihnen möglicherweise Atemstillstand aufgrund der Schmerzen litt. Es ist wichtig, zu verhindern, Atemstillstand. So nach der Capsaicin-Injektion, die Welpen sollten in einer Sauerstoff-Kammer platziert werden und einige Welpen erfordern Brust Kompression. Neonatale Capsaicin Behandlung nicht dazu veranlassen, AD-ähnliche Symptome bei Mäusen, und die Ursache dafür ist noch unbekannt. So, genetischen Eingriffen gilt kaum für dieses AD-Modell mit einem Knock-out-Stamm, sondern andere gentechnische Ansätze wie SiRNA plausibel für dieses Manko auszugleichen. Darüber hinaus ist die konsistente Manifestation des AD-ähnliche Symptome des Modells Ratte vorteilhaft für AD Krankheit Pathogenese zu studieren, sowie ein Drogen-Screening-Tool zuweisen.
Die Einrichtung der Kreislauf Kammer für FA Belichtung erfordert nur konventionelle Laborgeräte einschließlich einer Acryl-Box und eine medizinische Sauerstoff-Regler. Darüber hinaus können durch die Veränderung der Lösung im Befeuchterflasche Sauerstoff-Regler, diverse Arten von Gasen im Experiment angewendet werden. Konzentration des Gases in der Kammer sind leicht pflegbar durch Anpassung der Durchfluss des Reglers und der Konzentration der Lösung. Es ist wichtig, um sicherzustellen, eine enge Abdichtung bei der Montage von Herz-Kreislauf-System für FA Kontakt mit Capsaicin behandelt AD Rattenmodell mit einer Acryl-Kammer und eine medizinische Sauerstoff-Regler. Nicht nur, weil die Konzentration des Gases in der Kammer könnte jedes Mal durch die Leckage unterscheiden, aber auch das undichte Gas die Experimentatoren schädigen kann. Verdampfung von einigen flüchtigen organischen Verbindungen (VOC) oft blockiert das Rohr durch Kristallisation. Daher ist es relevant zu vermeiden, durch kontinuierliche Rohr-Management für den langfristigen Einsatz regelmäßig ersetzt die Rohre verstopfen. Diese Verdampfung spiegelt genauer des Fortschreitens der Krankheit bei Patienten als topische Anwendung Methoden11. Diese Methode zeigte deutliche Merkmale der Auswirkungen der FA Inhalation auf einem Rattenmodell der Anzeige im Vergleich zu den vorangegangenen Studien die FA naiv Tiere7,12ausgesetzt.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde unterstützt durch das öffentliche wohl & Sicherheit Forschungsprogramm durch National Research Foundation of Korea (NRF) gefördert durch das Ministerium für Bildung, Wissenschaft und Technologie (NRF-2014M3C8A5030612) und unterstützt durch die Chung Yang, Cha Young Sonne, M.D. und Jang Hallo Joo Yeu Sa Memorial Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medical Oxygen Regulator | Yuyao Jiahua Medical | manufacturer will not affect results | |
| Tube | manufacturer will not affect results | ||
| Acrylic Chamber | Taejin Acryl | manufacturer will not affect results | |
| Plastic Chamber | Taejin Acryl | manufacturer will not affect results | |
| Paraformaldehyde, powder | Sigma | 158127 | manufacturer will not affect results |
| Wrap filme | Uniwrap | manufacturer will not affect results | |
| Capsaicin | Sigma | M2028 | manufacturer will not affect results |
| Tween 80 | Sigma | P4780 | manufacturer will not affect results |
| Digital Video Camera | Sony | HDR-CX380y | manufacturer will not affect results |
| Isoflurane | JW pharmaceutical | manufacturer will not affect results |
References
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