Summary
We beschrijven hier methoden voor de behandeling van neonatale capsaïcine ertoe atopische dermatitis bij ratten en blootstelling van gevaporiseerde formaldehyde te onderzoeken van de effecten van formaldehyde inhalatie op atopische dermatitis.
Abstract
Atopische dermatitis is chronisch relapsing pruritic eczeem en heerst over de hele wereld vooral in ontwikkelde landen. Complexe interacties tussen genetische en omgevingsfactoren is bekend dat een belangrijke rol spelen in de pathofysiologie van atopische dermatitis. Echter wij nog steeds een gebrek aan een gedetailleerd beeld van de pathogenese van de ziekte. Het is dus van belang voor het ontwikkelen van passende dierlijke modellen voor het ophelderen van de progressie van atopische dermatitis. Bovendien breidt het onderzoeken van het effect van milieufactoren zoals luchtverontreiniging op atopische dermatitis begrip van de ziekte. Hier beschrijven we een methode voor het inducerende atopische dermatitis bij ratten met neonatale capsaïcine behandeling en een protocol voor Gasbedwelming met behulp van een constante concentratie van formaldehyde ratten te onthullen van de effecten op de ontwikkeling van atopische dermatitis in infantiele en adolescent perioden. Deze protocollen zijn met succes toegepast op verschillende experimenten en kunnen worden gebruikt voor andere stoffen.
Introduction
Om de effecten van formaldehyde (FA) inademing op atopische dermatitis (AD) progressie te ondervragen, we een protocol voor AD inductie opgericht en ontwikkeld van een conventionele omloop kamer voor chronische blootstelling voor FA.
AD is een chronische inflammatoire huidziekte toegeschreven aan de complexe interacties tussen genetische aanleg en milieu triggers1,2. Een goede diermodel is vereist voor het bestuderen van AD in de preklinische staat. Dit is het belangrijkste bij het ophelderen van de pathogenese van AD onder invloed van de omgevingsfactoren. Bovendien, om te beter onderzoeken de effecten van het milieu triggers op de progressie van de advertentie, het is essentieel te scheiden van de individuele milieufactoren en kwantificeren van de mate van blootstelling.
We hebben een nieuwe rat model van AD geïnduceerd door neonatale capsaïcine behandeling aangetoond. Deze advertentie model3 heeft sommige verdiensten ten opzichte van andere AD-modellen zoals de modellen van de AD geïnduceerd door overgevoeligheid van de epicutaneous, de genetisch gemanipuleerde AD-modellen en de spontane Muismodellen van AD4. Eerst, ontwikkelt dit model AD-achtige symptomen op de leeftijd van 3 weken, die correspondeert met baby AD en ouder is dan andere spontane Muismodellen van advertentie zoals de NC/Nga muis. In sommige gevallen, in tegenstelling tot de genetisch gemanipuleerde AD modellen, de symptomen van de AD-modellen verdwijnen en terugvalpreventie spontaan over een periode van 20 weken. Bovendien, het proces van de inductie van AD-achtige symptomen in het model is eenvoudiger dan die van het epicutaneous sensibilisatie model, dat meer vergelijkbaar met de allergische contactdermatitis in het perspectief van de inductie-proces is.
Met behulp van een acryl glas-kamer en een conventionele medische zuurstof regelgever5 aan het bestuderen van de effecten van FA inhalatie betreffendedeontwikkeling van AD in infantiele en adolescent periodes hebben we het nieuwe protocol voor FA blootstelling aan een dierlijk model geïntroduceerd. De regelgever heeft konden we bloot van de dieren een constante concentratie van het gas door het aanpassen van het debiet en de concentratie van de oplossing. Eerdere studies hebben verschillende manieren van blootstelling van FA aan diermodellen gemeld. Xu et al. beschreven de methode van de blootstelling in welke FA oplossing voor het rechtstreeks op de huid6is toegepast. Een andere recente studie gericht het protocol van FA gas blootstelling met behulp van een gespecialiseerde vluchtige oplosmiddelen generator, model 49127. Vergeleken met de methoden van eerdere studies, de nieuwe methode gemakkelijker is uitgerust en kan worden toegepast voor andere oplossingen naast FA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alle methoden die hier worden beschreven zijn goedgekeurd door de internationale Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van Korea University College van geneeskunde. van 6 weken na de geboorte, experimenteurs kunnen induceren enthansasia en verzamelen verschillende monsters zoals de huid en serum van ratten.
1. inductie van advertentie door neonatale capsaïcine behandeling
- toevoegen om te bereiden 5 mg/mL capsaïcine oplossing, 50 mg capsaïcine tot 1 mL Tween 80 en 100% ethanol in een conische tube van 15 mL 1 mL.
- Voeg 8 mL normale zout aan de conische buis. Goed schudden de buis zolang geen gescheiden lagen niet zichtbaar zijn
- injecteren de capsaïcine oplossing (10 µL/g) in het onderhuids weefsel, op de middellijn en de achterkant van de nek van een neonatale Sprague-Dawley ratten.
- Leveren de capsaïcine tussen 12 h tot 48 h na de geboorte (kritische).
Opmerking: Als de injectie is vertraagd door meer dan een paar dagen, dermatitis zal niet de ontwikkeling of het alleen voor een paar weken zal aanhouden. Als de injectie is nog te vroeg, respiratoire nood kan optreden als gevolg van ernstige pijn. - Ter voorkoming van neonatale ratten van respiratoire arrestatie vanwege de capsaïcine injectie, druk op de borst van pasgeborenen te moedigen ademhaling of de pasgeborenen in een zuurstof-kamer houden totdat de ademhaling normaal. wordt aangezien capsaïcine-geïnduceerde pijn kan ontmoedigen van ademhaling, toevoegen van narcose de ademhaling moeite eventueel zou kunnen verslechteren. Dus, onderzoekers anesthesics niet moeten gebruiken om het voortbestaan van ratten.
- Leveren de capsaïcine tussen 12 h tot 48 h na de geboorte (kritische).
2. Evaluatie van Pruritus en Dermatitis in een Rat Model van AD
- meting van pruritus door het tellen van spontane krassen gedrag
- voorbereiden kunststof kamers (20 x 30 cm x 20 cm) voorzien van een spiegel te staan voor een volledige dekking voor het bekijken en gaten om de ratten te ademen.
- Instellen op en pas een digitale videocamera om goed vast te leggen van de spiegel en front weergaven van de ratten gelijktijdig.
- Plaats ratten in de plastic kamer en dekking van het plafond van de kamer met een zwaar voorwerp om te voorkomen dat openen.
- Het spontane gedrag van ratten voor 1 h opnemen, afspelen van de video clips en Tel het aantal krassen gedrag.
- Beoordeling van huidlaesie met behulp van een scoresysteem
- plaats van de rat in de zaal inductie.
- Zet de zuurstof debietmeter aan 2 L/min stroom tarief en aanpassen van de vaporizer Isofluraan tot 3% voor anesthesie.
- Vaststellen van de omvang en de ernst van dermatitis in de oren en andere delen van een rat.
- Definieer de grootte van de eenheid voor de omvang van de letsels van de huid als 0,25 cm 2 en de ernst van de letsels van de huid door volgende tabel 1: Ernst index; graad van dermatitis score door te vermenigvuldigen met de omvang en de ernst (Zie dermatitis score in < sterke class = "xfig" > figuur 1B).
3. Gasbedwelming met behulp van gasvormige FA dieren
- voorbereiding van de inhalatie-kamer
- bereiden een acryl glazen doos (55 cm x 40 cm x 35 cm) die twee verkooppunten heeft aan weerszijde.
- Let op. Voor verkeer van FA gas, plaatst u het stopcontact hoger is dan de inlaat en maken de grootte van het stopcontact groter dan dat van de inlaat.
- Let op. Voor de meting van de concentratie van de interne gasmarkt, aan een andere kant van de verkooppunten, boor drie kleine passages, die kunnen worden afgesloten.
- Verbinding buizen aan beide outlets. Plaats een uitlaat buis omloop Hood of buiten het gebouw voor de emissie van het gas en de andere uitlaat buis verbinden met een medische zuurstof regelgever.
- Plaats van de kooi van een conventionele rat binnen het vak acrylglas.
- Ratten in de kooi zetten van de ene week na de geboorte voor 5 weken (2U/dag en 5 dagen per week).
- Verzegel de doos acrylglas zo strak mogelijk om te voorkomen dat gas lekkage.
Opmerking: Voor strak afdichting, het deksel van de kamer moet bevatten rubber. Toepassing cling film om wrap de zaal voor strakke verzegeling.
- Generatie voor gasvormige FA met behulp van een regelgever medische zuurstof
- los 5 g voor FA in 1 L water.
- Zet de FA-oplossing van 0,5% in de luchtbevochtiger fles van de medische zuurstof regulator.
- Na het aansluiten van de inlaat buis aan de regulerende instantie, zet de regelgever en selecteer het debiet tot 5 L/min.
- Aanpassen van de concentratie van de oplossing en de stroomsnelheid te bepalen van de concentratie van gas in de zaal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De AD-achtige huidontsteking van de capsaïcine behandeld AD rat model op 7 weken van leeftijd wordt gepresenteerd in figuur 1A. Robuuste krassen gedrag van het model AD-rat capsaïcine behandeld wordt weergegeven in de Video 1. Neonatale capsaïcine behandeling ontlokte dermatitis en verergerd krabben gedrag bij ratten 3 weken oud, en AD-achtige symptomen duurt al enkele weken (figuur 1B, C). Hoewel de mate minder ernstig was, lijden sommige ratten recidiverende dermatitis bij 16 weken oud na resolutie van vroege AD-achtige symptomen (Figuur 1 d). Bovendien, serum IgE niveau, dat een biologische marker voor AD Ernst8 is, werd verheven in de capsaïcine behandeld AD rat model (figuur 1E). De mRNA uitingen van IL-4 en IL-13 ook gestegen in de capsaïcine behandeld AD rat model (figuur 1F, G).
Representatieve foto's toonde aan dat FA de verergering van dermatitis in het model AD-rat capsaïcine behandeld op 5 weken oud (figuur 2A geïnduceerde). Blootstelling van 1.2 ppm FA verergerd het krassen gedrag en dermatitis in capsaïcine behandeld AD rat model voor meer dan 2 weken. Echter, 0,8 ppm FA blootstelling niet verergeren krassen gedrag en dermatitis in de capsaïcine behandeld AD rat model (figuur 2B, C). Bovendien, verhoogde 1.2 ppm FA blootstelling het serum IgE niveau in de capsaïcine behandeld AD rat model (figuur 2D).
Voor blootstelling voor gasvormige FA, werd de ventilatie-zaal opgericht zoals beschreven in het Protocol (figuur 3A). Vóór de blootstelling, werd de concentratie van FA in de zaal herhaaldelijk gemeten voor waarborging van consistente concentratie. Bij het wijzigen van de concentratie van FA oplossing, werd de concentratie van gasvormige FA in de zaal gemeten. Als de concentratie van de oplossing is toegenomen, deed de concentratie van het gas in de zaal langzaam verhoogd en de concentratie van het gas in de zaal van dezelfde oplossing niet aanzienlijk verschillen in herhaalde metingen (figuur 3B).
Figuur 1: neonatale capsaïcine behandeling geïnduceerde recidiverende AD-achtige huidontsteking en jeuk bij ratten. Representatieve foto's van huidontsteking bij de rat van capsaïcine behandeld (A). Chronologische kenmerken van dermatitis (B) en krassen gedragingen (C) van de ratten capsaïcine behandeld. Representatieve afbeelding van recidiverende letsels van de huid van 16 weken oude capsaïcine behandelde ratten (D). (E) aanzienlijke hoogte van serum IgE niveaus in capsaïcine behandelde dieren. (F) aanzienlijke hoogte van IL-4 mRNA uitdrukking in capsaïcine behandelde dieren. (G) aanzienlijke hoogte van IL-3 mRNA uitdrukking in capsaïcine behandelde dieren. Alle resultaten werden uitgedrukt als middel van ± SEM en geanalyseerd met behulp van de Student t-test. *p < 0,05, ** p < 0,005, ***p < 0,001. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: FA blootstelling verergerd Pruritus en Dermatitis in het Model capsaïcine behandeld AD Rat. Representatieve foto's van de 5th -week van de behandeling met behulp van 1.2 ppm en 0,8 ppm FA (A). Blootstelling van 1.2 ppm FA, maar niet 0,8 ppm FA blootstelling, aanzienlijk verergerd pruritus (B) en dermatitis (C) in het model AD capsaïcine behandeld. Serum IgE niveau verhoogd in het model AD-rat capsaïcine behandeld met 1.2 ppm FA blootstelling (D) behandeld. Resultaten werden uitgedrukt als middel van ± SEM en geanalyseerd met behulp van een one-way ANOVA gevolgd door Tukey de test of de Student t-test. *p < 0,05, ***p < 0,001 (vs ratten blootgesteld aan verse lucht). 1.2 FA-AD: capsaïcine behandeld AD rat model blootgesteld aan 1.2 ppm FA; 0.8 FA-AD: capsaïcine behandeld AD rat model blootgesteld aan 0,8 ppm FA; en lucht-AD: capsaïcine behandeld AD rat model blootgesteld aan verse lucht. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: FA behandeling. Schematische illustratie van de regelgever en de gaskamer (A). De concentratie van gasvormige FA in de kamer was in verhouding staan tot de concentratie van FA oplossing (B). Resultaten werden uitgedrukt als middel van ± SEM. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Video 1: aanvallen van krassen gedrag van capsaïcine behandelde ratten werden opgenomen voor meting van Pruritus. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
| Regio | Score | Beschrijving |
| Behalve oren | 0 | Normaal |
| 1 | Onregelmatige bont | |
| 2 | Alopecia of flare | |
| 3 | Bloeden of schurft | |
| Oren | 0 | Normaal |
| 1 | Flare | |
| 2 | Bloeden of schurft | |
| 3 | Verlies van het weefsel |
Tabel 1: Ernst Index.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het protocol hier beschreven voor de inductie van AD-achtige symptomen bij ratten kan worden aangepast voor het bestuderen van AD pathofysiologie en gebruikt als een instrument voor screening voor drugtest. Het instrument voor de blootstelling van gasvormige FA aan capsaïcine behandelde ratten kan worden toegepast om de effecten van blootstelling aan verschillende gassen op verschillende diermodellen.
De neonatale capsaïcine behandeld advertentie model is gebaseerd op een meer eenvoudige procedure dan andere atopische modellen zoals de DNCB behandeling model9 en epicutaneous sensibilisatie model4, en is goedkoper dan de NC/Nga muis4. De manifestatie van AD-achtige symptomen in de advertentie model strookt. Bovendien, in sommige gevallen lokt dit protocol spontane recidiverende letsels van de AD-achtige huid in de getroffen ratten zonder een extra behandeling3. Overdosis capsaïcine injectie opgeroepen neuronale cel dood en neurocutaneous ontsteking10 en veroorzaakt hevige pijn in de rats. Sommigen van hen lijden eventueel Ademhalings arrestatie als gevolg van de pijn. Het is van belang om hen te verhinderen respiratoire arrestatie. Dus, na de injectie van capsaïcine, de pups moeten worden geplaatst in een kamer van zuurstof en sommige pups kunnen vereisen compressie van de borst. Neonatale capsaïcine behandeling er niet toe brengt AD-achtige symptomen in muizen, en de oorzaak hiervoor is nog steeds onbekend. Dus genetische interventie geldt nauwelijks voor deze advertentie model met behulp van een knock-out-stam, maar andere genetische benaderingen zoals siRNA aannemelijk compenseren van deze tekortkoming. Bovendien, de consistente manifestatie van AD-achtige symptomen van de rat-model is heilzaam voor AD ziekte pathogenese te bestuderen, evenals de toe te passen op een drug screening tool.
De oprichting van de bloedsomloop kamer voor FA blootstelling vereist alleen conventionele laboratoriumapparatuur, met inbegrip van een acryl box en een medische zuurstof regulator. Bovendien, door het veranderen van de oplossing in de luchtbevochtiger fles van de regulator van de zuurstof, verschillende soorten gassen kunnen worden toegepast in de experiment. Concentratie van het gas in de zaal kan gemakkelijk worden gehandhaafd door het aanpassen van het debiet van de regelgever en de concentratie van de oplossing. Het is van cruciaal belang om ervoor te zorgen een strak afdichting in de installatie van de bloedsomloop voor FA blootstelling aan de capsaïcine behandeld AD rat model met behulp van een acryl kamer en een medische zuurstof regulator. Niet alleen omdat de concentratie van gas in de plenaire vergadering telkens als gevolg van de lekkage kan verschillen, maar ook de lekkende gas schade aan de onderzoekers toebrengen kan. Verdamping van sommige vluchtige organische stoffen (VOS) vaak geblokkeerd de buis door kristallisatie. Het is dus relevant om te voorkomen dat verstopping door middel van continue buis beheer voor langdurig gebruik door het regelmatig vervangen van de buizen. Dit systeem van verdamping weerspiegelt nauwkeuriger de progressie van de ziekte bij patiënten dan de actuele toepassing methoden11. Deze methode bleek verschillende kenmerken van de effecten van FA inhalatie van een rat model van AD ten opzichte van de vorige studies die FA blootgesteld aan naïeve dieren7,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd gesteund door het openbare welzijn & onderzoek veiligheidsprogramma via de nationale onderzoek Stichting van Korea (NRF) gefinancierd door het ministerie van onderwijs, wetenschap en technologie (NRF-2014M3C8A5030612), en ondersteund door de Chung Yang, Cha Young Zon, M.D. en Jang Hallo Joo Yeu Sa Memorial Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medical Oxygen Regulator | Yuyao Jiahua Medical | manufacturer will not affect results | |
| Tube | manufacturer will not affect results | ||
| Acrylic Chamber | Taejin Acryl | manufacturer will not affect results | |
| Plastic Chamber | Taejin Acryl | manufacturer will not affect results | |
| Paraformaldehyde, powder | Sigma | 158127 | manufacturer will not affect results |
| Wrap filme | Uniwrap | manufacturer will not affect results | |
| Capsaicin | Sigma | M2028 | manufacturer will not affect results |
| Tween 80 | Sigma | P4780 | manufacturer will not affect results |
| Digital Video Camera | Sony | HDR-CX380y | manufacturer will not affect results |
| Isoflurane | JW pharmaceutical | manufacturer will not affect results |
References
- Geha, R. S. Allergy and hypersensitivity. Nature versus nurture in allergy and hypersensitivity. Curr Opin Immunol. 15 (6), 603-608 (2003).
- Novak, N., Bieber, T., Leung, D. Y. Immune mechanisms leading to atopic dermatitis. The J Allergy Clin Immunol. 112 (Suppl 6), S128-S139 (2003).
- Back, S. K., et al. Chronically relapsing pruritic dermatitis in the rats treated as neonate with capsaicin; a potential rat model of human atopic dermatitis. J Dermatol Sci. 67 (2), 111-119 (2012).
- Jin, H., He, R., Oyoshi, M., Geha, R. S.
- Han, R. T., et al. Formaldehyde-Induced Aggravation of Pruritus and Dermatitis Is Associated with the Elevated Expression of Th1 Cytokines in a Rat Model of Atopic Dermatitis. PLOS ONE. 11 (12), e0168466 (2016).
- Xu, B., Aoyama, K., Takeuchi, M., Matsushita, T., Takeuchi, T. Expression of cytokine mRNAs in mice cutaneously exposed to formaldehyde. Immunol Lett. 84 (1), 49-55 (2002).
- Kim, J. Y., Jeong, M. S., Park, K. Y., Seo, S. J. Aggravation of atopic dermatitis-like symptoms by consecutive low concentration of formaldehyde exposure in NC/Nga mice. Exp Dermatol. 22 (3), 219-221 (2013).
- Laske, N., Niggemann, B. Does the severity of atopic dermatitis correlate with serum IgE levels? Pediatr Allergy Immunol. 15 (1), 86-88 (2004).
- Fujii, Y., Takeuchi, H., Sakuma, S., Sengoku, T., Takakura, S. Characterization of a 2,4-dinitrochlorobenzene-induced chronic dermatitis model in rats. Skin Pharmacol Physiol. 22 (5), 240-247 (2009).
- Sugimoto, T., Xiao, C., Ichikawa, H. Neonatal primary neuronal death induced by capsaicin and axotomy involves an apoptotic mechanism. Brain Res. 807 (1-2), 147-154 (1998).
- Saito, A., et al. Characterization of skin inflammation induced by repeated exposure of toluene, xylene, and formaldehyde in mice. Environ Toxicol. 26 (3), 224-232 (2011).
- Jung, W. W., et al. Formaldehyde exposure induces airway inflammation by increasing eosinophil infiltrations through the regulation of reactive oxygen species production. Environ Toixcol Pharmacol. 24 (2), 174-182 (2007).
