Summary
新生児カプサイシン処置ラットとアトピー性皮膚炎に対するホルムアルデヒド吸入の影響を調査するため気化したホルムアルデヒドの露出でアトピー性皮膚炎を誘発する方法をご紹介します。
Abstract
アトピー性皮膚炎掻痒湿疹を慢性的な再発は、先進国を中心に世界中で勝ちます。遺伝・環境要因間の複雑な相互作用は、アトピー性皮膚炎の病態に重要な役割を再生する知られています。しかし、我々 はまだこの病気の病因の詳細な画像を欠いています。したがって、アトピー性皮膚炎の進行を解明するための適切な動物モデルの開発に重要なのです。また、アトピー性皮膚炎に及ぼす大気汚染物質などの環境要因を調査して病気の理解を広げます。ここでは、新生児カプサイシン処置ラットにおけるアトピー性皮膚炎とアトピー性皮膚炎小児と思春期の発達に及ぼす影響を明らかにするラットへの一定ホルムアルデヒド濃度の暴露のためのプロトコルを誘導する方法を述べる期間。これらのプロトコルはいくつかの実験に正常に適用されているし、他の物質に使用することができます。
Introduction
ホルムアルデヒド (FA) アトピー性皮膚炎 (AD) の進行の効果を調査するには、広告誘導プロトコルを設立し、FA の慢性露出のための従来の循環室を開発しました。
広告は、遺伝的素因と環境トリガー1,2間の複雑な相互作用に起因する慢性の炎症性皮膚疾患です。適切な動物モデルは臨床状態で広告を勉強する必要があります。これは、環境要因の影響の下で AD の病因を解明するとき最も重要です。また、広告進行に及ぼす環境的誘因をよく調べるためには、それは個々 の環境要因を分離し、暴露の程度を定量化することが欠かせません。
我々 は新生児カプサイシン処置による広告の新規ラットモデルを実証しました。この広告モデル3皮膚感作性, 遺伝子組み換え広告モデルおよび広告4の自発的なマウス ・ モデルによる広告モデルなど他の広告モデルにいくつかのメリットがあります。まず、このモデルは幼児広告に対応し、Nc/nga マウスなど広告の他の自発的なマウス モデルより前は 3 週間の時代に広告のような症状を開発しています。遺伝子組み換えの広告モデルとは異なり、いくつかのケースで広告モデルの症状は治まるし、自発的に 20 週間にわたって再発します。また、モデルの広告のような症状の誘導プロセスはより誘導プロセスの観点からアレルギー性の接触皮膚炎に似ている皮膚感作モデルより簡単です。
小児および思春期の期間に広告の開発の FA 吸入の効果を研究するアクリル ガラス室と従来の医療用酸素レギュレータ5を使用して FA 曝露動物モデルにおける新しいプロトコルを紹介しています。レギュレータを一定濃度ガス流量を調整することによって、溶液濃度に動物を公開できました。以前の研究は、動物モデルへの FA の暴露のいくつかの方法を報告しています。徐らは、どの FA ソリューション皮膚6へ適用した直接露光法を説明します。別の最近の研究は対処モデル 49127特殊揮発性溶剤の発電機を用いた FA ガス曝露プロトコルです。従来の方法と比較して、新しい方法がより簡単に装備されてし、FA に加えて他のソリューションの適用することができます。
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Protocol
ここで説明したすべてのメソッドが出生後 6 週間国際動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) の韓国大学大学の医学によって承認されている、実験者ができる enthansasia を誘導すると収集。皮膚、ラットの血清など様々 な試料
。1 新生児カプサイシン処置によって広告の誘導
- カプサイシン ソリューション 5 mg/mL を準備するには、トゥイーン 80、15 mL の円錐管の 100% エタノール 1 mL に 1 mL に 50 mg のカプサイシンを追加します。 。
- は、円錐管に生理食塩水入りの 8 mL を追加します。表示しているレイヤー分離がなくなったまで精力的にチューブを振る
- 正中線と新生児 Sprague-dawley ラットの首の裏側に、皮下組織にカプサイシン溶液 (10 μ L/g) を注入します。
- 配信 (重大) 生後後 48 時間 12 h 間カプサイシン
。 メモ: 注入がより数日遅れた場合皮膚炎は開発しません、それは数週間のためにのみ保持されます。注入が早すぎる場合、呼吸が激しい痛みのため発生する可能性が 。
カプサイシン投与による呼吸停止から新生児ラットを防ぐために - を押して呼吸を助長するまたは呼吸になるノーマル。 以来、カプサイシン誘発の痛みすることができますまで酸素室おいて、新生児に新生児の胸部呼吸の阻止、おそらく呼吸困難を悪化させる全身麻酔を追加します。実験者がラットの生存を増加する anesthesics を使用しないでくださいしたがって、.
- 配信 (重大) 生後後 48 時間 12 h 間カプサイシン
2。掻痒症と広告のモデルラットにおける皮膚炎の評価
- 準備プラスチックの 自発の掻破行動を数えることによってそう痒症の測定 室 (20 cm × 30 cm × 20 cm) 完全なカバレッジを許可するミラーを装備閲覧と呼吸するラットを許可するように穴にします 。
- 設定して正しくミラー ビューおよびラットのフロント ビューを同時に記録するデジタル ビデオ カメラを調整します 。
- 商工会議所や開口部を防ぐために重いオブジェクトの部屋の天井をカバー プラスチック場所ラット 。
- 1 h のラットの自発行動を記録、ビデオ クリップを再生および動作の傷の数をカウントします 。
- 得点システムを使用して皮膚病変の評価
- 誘導室でラットを配置します 。
- 2 L/分の酸素流量計をオンに流量し、麻酔の 3% にイソフルラン気化器を調整します 。
- 程度とラットの他の部分と耳の皮膚炎の重症度を識別します 。
- 0.25 cm 2 と次 の表 1 による皮膚病変の重症度として皮膚病変の範囲の単位を定義する: 重症度; 度程度と重症度を乗じて皮膚炎スコア (皮膚炎のスコアを参照してください <強いクラス ="xfig"> 図 1B).
3。ガス FA の動物への暴露
- 吸入室の準備
- アクリル ガラス ボックスを準備 (55 cm × 40 cm × 35 cm) 反対側に 2 つのアウトレットがある 。
- 注意。FA ガスの循環、入口より出口を配置し、入口よりも出口のサイズを大ききます 。
- 注意。、店舗別の側面の内部のガス濃度測定の閉じることができます 3 つの小さな通路をドリルします。 両方の店に
- 接続チューブ。循環フードまたはガスの放出のために建物の外排水チューブを置き、他のアウトレット チューブを医療用酸素レギュレータに接続します 。
- アクリル ガラス ボックス内に従来のラットのおりを配置します 。
- (2 時間/日、5 日/週) 5 週間出産後 1 週間からネズミをケージに入れています 。
- シール アクリル ガラス ボックス ガス漏れを防ぐために可能な限り緊密
。 注: タイトなシールの室蓋はゴムを含める必要があります。密封のために部屋をラップするラップを適用します 。
- 医療用酸素レギュレータを用いた気体 FA の世代
- FA の 5 g を 1 L の水に溶解する 。
- 医療用酸素レギュレータの加湿器ボトルに入れ、0.5 %fa ソリューションです 。
- レギュレータにインレット チューブを接続した後、レギュレータをオンにし 5 L/分の流量を設定
- 溶液濃度とチャンバー内のガスの濃度を決定するための流量を調整します 。
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Representative Results
7 週齢でカプサイシン処理広告ラット モデルの広告のような皮膚の炎症は、図 1 aに提示されます。広告ラットのカプサイシン処理モデルの堅牢な掻破行動をビデオ 1に示します。新生児カプサイシン処置が皮膚炎を誘発 3 週齢ラットの行動を傷を悪化し、広告のような症状が数週間 (図 1 bC) の永続化します。程度はそれほど深刻でしたが、16 週齢の初期の広告のような症状 (図 1) の解決の後で再発性の皮膚炎に苦しんでいくつかのラット。さらに、血清 ige、AD 重症度8の生物学的マーカーである (図 1E) 広告のラットのカプサイシン処理モデルに昇格。Il-4, IL 13 の mRNA 発現はまた広告のカプサイシン投与ラット モデル (図 1 f, G) で増加しました。
代表的な写真は、FA は 5 週齢 (図 2 a) カプサイシン処理広告ラットモデルにおける皮膚炎の悪化を誘発したことを示した。1.2 ppm FA の露出は、2 週間以上の掻破行動とカプサイシン処理広告ラットモデルにおける皮膚炎を悪化させた。ただし、0.8 ppm FA 曝露していないスクラッチの行動と広告のカプサイシン投与ラット モデル (図 2 b, C) に皮膚炎を悪化させます。また、1.2 ppm FA 曝露が血清 ige 広告のカプサイシン投与ラット モデル (図 2 D) 昇格。
ガス FA の露出、プロトコル(図 3 a) で説明したよう、換気チャンバー設定しました。露光の前に商工会議所で FA の濃度繰り返し保証の一貫した濃度を測定しました。FA の溶液の濃度を変更すると、チャンバー内の気体の FA の濃度を測定しました。溶液の濃度の増加と共に、徐々 に増加商工会議所におけるガスの濃度と同じソリューションから室内のガス濃度は大きく変動しなかった繰り返し測定 (図 3 b)。
図 1: 新生児カプサイシン処置による再発の広告のような皮膚の炎症と掻痒症ラットで。カプサイシン投与ラット (A) の皮膚炎症の代表的な写真。(B) 皮膚炎の掻破行動 (C) カプサイシン投与ラットの経時的機能。16 週齢カプサイシン投与ラット (D) の再発性の皮膚病変の代表的なイメージ。(E) カプサイシン投与動物の血清 IgE 値の有意な上昇。(F) カプサイシン投与動物における IL 4 mRNA 発現の有意な上昇。(G) カプサイシン投与動物における IL 3 mRNA 発現の有意な上昇。すべての結果は ± SEM を手段として表現された、スチューデントの t 検定を用いて分析します。*p < 0.05 * * p < 0.005、* * *p < 0.001。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: FA 露出掻痒症とカプサイシン投与広告モデルで皮膚炎が悪化します。1.2 ppm と 0.8 ppm FA (A) を使用して治療の 5 週目の代表的な写真。1.2 ppm、FA の露出がない 0.8 ppm FA 曝露、掻痒症 (B) と皮膚炎 (C) カプサイシン処理の広告モデルで大幅悪化します。カプサイシン投与広告ラットモデルにおける増加血清 IgE レベルは、1.2 ppm FA 曝露 (D) と扱われます。結果は、± SEM を意味し、一方通行 ANOVA 続くテューキー テストまたはスチューデントの t 検定を用いて表現されました。*p < 0.05 * * *p < 0.001 (対ラットは、新鮮な空気にさらされて)。1.2 1.2 ppm FA; FA-広告: 広告のカプサイシン投与ラットのモデル公開0.8 FA-広告: 広告のカプサイシン投与ラットのモデル公開 0.8 ppm FA;空気広告: 広告ラット モデルのカプサイシン扱われる新鮮な空気に公開します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: FA 処理します。レギュレータおよびガス室 (A) の模式図。チャンバー内の気体の FA の濃度だった FA ソリューション (B) の濃度に比例します。結果は ± SEM. の手段として表現されたこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
ビデオ 1: 傷行動のカプサイシン投与ラットの発作を記録した測定の掻痒。してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
| 地域 | スコア | 説明 |
| 耳を除く | 0 | 通常 |
| 1 | かすかな毛皮 | |
| 2 | 脱毛症やフレア | |
| 3 | 出血やかさぶた | |
| 耳 | 0 | 通常 |
| 1 | フレア | |
| 2 | 出血やかさぶた | |
| 3 | 組織の損失 |
表 1:重症度インデックス。
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Discussion
ラットの広告のような症状の誘発のためここで説明されたプロトコルは、AD の病態を研究するために適応し、薬物検査のスクリーニング ツールとして使用できます。ガス FA のカプサイシン投与ラットへの暴露の楽器は、多様な動物モデルに及ぼす各種ガスへの暴露の評価に適用できます。
新生児カプサイシン処理広告モデル、DNCB 治療モデル9と皮膚感作モデルなど4他のアトピーのモデルよりもより簡単なプロシージャに依存している、Nc/nga マウス4よりもより手頃な価格です。広告モデルの広告のような症状の発現は一貫性のあります。さらに、いくつかのケースでは、このプロトコルは、任意の追加治療3なし影響を受けたラットの自発的再発性広告のような皮膚病変を引き出します。過剰摂取カプサイシン投与誘発神経細胞死と来たす炎症10とラットで激しい痛みを引き起こした。それらのいくつかはおそらく痛みのための呼吸の阻止によって苦しんだ。それは呼吸の阻止からそれらを防ぐために重要です。したがって、カプサイシン投与後、子犬は、酸素室に配置されるべき、いくつかの子犬は、胸骨圧迫を必要があります。新生児カプサイシン処置マウスで広告のような症状を誘発しない、この問題の原因はまだ不明です。したがって、遺伝的介入はほとんどノックアウトひずみを用いた広告モデルに適用、siRNA など他の遺伝的アプローチがもっともらしくこの欠点を補うため。さらに、ラットのモデルの広告のような徴候の一貫性のある症状は、薬物スクリーニング ツールに適用すると同様、広告疾患病因を調査にとって有益です。
FA 露出の循環の商工会議所の設立には、アクリル ボックスと医療用酸素レギュレータなどを含む従来の実験装置のみ必要があります。さらに、酸素調整器の加湿器のボトルにソリューションを変更すると、多様な種類のガスが実験で適用できます。商工会議所のガスの濃度は、レギュレータの流量と溶液の濃度を調整することにより簡単に管理できます。アクリル室と医療用酸素レギュレータを使用して広告のラットのカプサイシン処理モデルに FA 露出の循環システムのインストールでタイトなシールを確認する重要です。だけでなく、商工会議所のガスの濃度が漏れ、たびを異なる可能性がありますが、ガス漏れは実験者に害を与えることまた。多くの場合いくつかの揮発性有機化合物 (VOC) の蒸発晶析法による管をブロックします。したがって、チューブを定期的に置き換えることによって長期使用のため連続チューブ管理による目詰まりを避けるために関連性の高いです。この気化装置より正確に病気の進行患者に局所施用方法11よりを反映しています。このメソッドでは、素朴な動物7,12に FA をさらされる前の調査と比較して広告のモデルラットに FA 吸入の効果の特徴を明らかにしました。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
本研究は、公共の福祉によって支えられた & 安全研究プログラムを通じて、国立研究財団の韓国 (NRF) 文部省、科学および技術 (NRF 2014M3C8A5030612)、によって資金を供給、鄭陽、チャチャ ヤングによってサポートされて太陽、MD やチャンこんにちはチュ ユー Sa 記念基金します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medical Oxygen Regulator | Yuyao Jiahua Medical | manufacturer will not affect results | |
| Tube | manufacturer will not affect results | ||
| Acrylic Chamber | Taejin Acryl | manufacturer will not affect results | |
| Plastic Chamber | Taejin Acryl | manufacturer will not affect results | |
| Paraformaldehyde, powder | Sigma | 158127 | manufacturer will not affect results |
| Wrap filme | Uniwrap | manufacturer will not affect results | |
| Capsaicin | Sigma | M2028 | manufacturer will not affect results |
| Tween 80 | Sigma | P4780 | manufacturer will not affect results |
| Digital Video Camera | Sony | HDR-CX380y | manufacturer will not affect results |
| Isoflurane | JW pharmaceutical | manufacturer will not affect results |
References
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