Summary
Her beskriver vi metoder til neonatal capsaicin behandling til at fremkalde atopisk dermatitis i rotter og eksponering af forstøvet formaldehyd til at undersøge virkningerne af formaldehyd indånding på atopisk dermatitis.
Abstract
Atopisk dermatitis recidiverende kronisk kløende eksem og hersker rundt om i verden især i de udviklede lande. Komplekse samspil mellem genetiske og miljømæssige faktorer er kendt for at spille en vigtig rolle i Patofysiologi af atopisk dermatitis. Vi mangler dog stadig et detaljeret billede af patogenesen af denne sygdom. Det er således vigtigt at udvikle passende dyremodeller for belyse progression af atopisk dermatitis. Derudover udvider undersøger effekten af miljøfaktorer såsom luft forurenende stoffer på atopisk dermatitis forståelse af sygdommen. Her, beskriver vi en metode til at inducere atopisk dermatitis i rotter med neonatal capsaicin behandling og en protokol for eksponering af en konstant koncentration af formaldehyd til rotter kan afsløre virkninger på udviklingen af atopisk dermatitis i infantile og Ungdomspsykiatrisk perioder. Disse protokoller har været anvendt med succes til flere eksperimenter og kan bruges til andre stoffer.
Introduction
For at afhøre virkningerne af formaldehyd (FA) indånding på atopisk dermatitis (AD) progression, vi etableret en protokol til annonce induktion og udviklet en konventionel omsætning kammer for kronisk eksponering af FA.
Annonce er en kronisk inflammatorisk hudsygdom tilskrevet det komplekse samspil mellem genetiske disposition og miljømæssige udløser1,2. En ordentlig dyremodel er forpligtet til at studere annonce i prækliniske tilstand. Dette er det vigtigste, når belyse patogenesen af annonce under indflydelse af miljøfaktorer. For at bedre undersøge virkningerne af de miljømæssige udløser på AD progression, er det desuden vigtigt at adskille de enkelte miljøfaktorer og kvantificere graden af eksponering.
Vi har demonstreret en roman rotte model af annonce induceret af neonatal capsaicin behandling. Denne annonce model3 har nogle fortrin over andre AD modeller såsom AD modeller induceret af epicutaneous sensibilisering, genetisk manipuleret AD modeller og de spontane musemodeller af annonce4. Første, denne model udvikler annonce-lignende symptomer i en alder af 3 uger, som svarer til spædbarn AD og er tidligere end andre spontane musemodeller af annonce som NC/Nga musen. I nogle tilfælde, i modsætning til de genetisk manipuleret AD modeller, symptomerne for AD modeller stilne og tilbagefald spontant over en periode på 20 uger. Derudover er induktion processen med AD-lignende symptomer i modellen lettere end epicutaneous sensibilisering model, som mere ligner den allergisk kontakteksem i perspektiv af induktion processen.
Vi har indført den nye protokol for FA eksponering for en dyremodel ved hjælp af en akrylglas kammer og en konventionel medicinsk ilt regulator5 for at studere virkningerne af FA indånding på udviklingen af annonce i infantile og Ungdomspsykiatrisk perioder. Den regulerende myndighed har tilladt os at udsætte dyr for en konstant koncentration af gas ved at justere strømningshastigheder og opløsningens koncentration. Tidligere undersøgelser har rapporteret adskillige måder af eksponering af FA til dyremodeller. Xu et al. beskrev metoden eksponering i hvilken FA var løsningen direkte påføres huden6. En anden nylig undersøgelse rettet i protokollen af FA gas eksponering ved hjælp af en specialiseret flygtige opløsningsmidler generator, model 49127. I forhold til metoder til tidligere undersøgelser, den nye metode er lettere udstyret og kan anvendes for andre løsninger ud over FA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af de internationale Animal Care og brug udvalg (IACUC) af Korea University College af medicin. 6 uger efter fødslen, eksperimentatorer kan fremkalde enthansasia og indsamle forskellige prøver såsom hud og serum rotter.
1. induktion af annonce ved Neonatal Capsaicin behandling
- for at forberede 5 mg/mL capsaicin løsning, tilsættes 50 mg af capsaicin til 1 mL Tween 80 og 1 mL 100% ethanol i en 15 mL konisk tube.
- Tilføje 8 mL af normale saltvand til det koniske rør. Rystes glasset kraftigt indtil ingen adskilte lag er synlige
- injicere capsaicin løsning (10 µL/g) i det subkutane væv, på midterlinjen og bagsiden af halsen af en neonatal Sprague-Dawley rotte.
- Levere capsaicin mellem 12 h til 48 h efter fødslen (kritisk).
Bemærk: Hvis injektionen er forsinket med mere end et par dage, dermatitis vil ikke udvikle eller det vil stadig kun for få uger. Hvis injektion er for tidligt, åndedrætsbesvær kan opstå på grund af alvorlige smerter. - At undgå neonatal rotter fra respirationsstop som følge af capsaicin injektion, skub brystet af nyfødte at tilskynde vejrtrækning eller holde nyfødte i en ilt kammer, indtil åndedræt bliver normal. da capsaicin-induceret smerter kan afskrække vejrtrækning, tilføje narkose kunne eventuelt forværre åndedrætsbesvær. Således eksperimentatorer bør ikke bruge anesthesics til at øge overlevelsen af rotter.
- Levere capsaicin mellem 12 h til 48 h efter fødslen (kritisk).
2. Evaluering af kløe og Dermatitis i en rotte Model af AD
- måling af kløe ved at tælle spontan skrabe adfærd
- Forbered plast kamre (20 cm x 30 cm x 20 cm) udstyret med et spejl til at tillade fuld dækning til visning og huller til at gøre det muligt rotter at indånde.
- Sat op og justere et digital videokamera korrekt for at optage spejl visninger og forreste udsigt over rotter samtidig.
- Sted rotter i plast kammer og dække loftet i salen med en tung genstand at forhindrer åbning.
- Optage den spontane opførsel af rotter for 1 h, afspille videoklip og tælle antallet af skrabe funktionsmåder.
- Vurdering af hud læsion ved hjælp af et pointsystem
- placere rotten i induktion afdeling.
- Drej ilt flowmåler til 2 L/min. flow hastighed og justere isofluran vaporizer til 3% for anæstesi.
- Identificere omfanget og alvoren af dermatitis i ørerne og andre dele af en rotte.
- Definerer størrelsen på for omfanget af hudlæsioner som 0,25 cm 2 og sværhedsgraden af hudlæsioner af følgende tabel 1: sværhedsgraden indeks; graden af dermatitis score ved at gange omfanget og alvoren (Se dermatitis score i < stærk class = "xfig" > figur 1B).
3. Eksponering af gasformige FA til dyr
- forberedelse af indånding kammer
- forberede en akryl glas boks (55 cm x 40 cm x 35 cm), der har to udtag på modsatte sider.
- Forsigtighed. For omsætning af FA gas, placere outlet højere end fjorden og gøre størrelsen af forretningen større end i indløbet.
- Forsigtighed. Til måling af interne koncentrationen, på en anden side af afsætningsmuligheder, bore tre små passager, som kan være lukket.
- Tilslut rør til begge forretninger. Placer en outlet rør til omsætning hood eller uden for bygningen for emission af gas, og Tilslut anden outlet rør til en medicinsk ilt regulator.
- Placerer en konventionel rotte bur inde i boksen akrylglas.
- Sætte rotter i buret fra en uge efter fødslen for 5 uger (2 t/dag og 5 dage om ugen).
- Seal boksen akrylglas så stramt som muligt for at forhindre gasudslip.
Bemærk: Stram lukkeanordninger, kammer låget bør indeholde gummi. Anvende plastfolie til wrap kammer for stramme forsegling.
- Generation af gasformige FA ved hjælp af en medicinsk ilt regulator
- opløses 5 g af FA i 1 L vand.
- Sætte 0,5% FA løsning i luftfugter flaske af medicinsk ilt regulatoren.
- Efter tilslutning inlet tube til regulator, drej på regulatoren og indstille strømningshastighed til 5 L/min.
- Justere opløsningens koncentration og flow til at bestemme koncentrationen af gas i kammeret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Annonce-lignende hud betændelse af capsaicin-behandlede annonce rotte model 7 uger gamle er præsenteret i figur 1A. Robust skrabe opførsel af capsaicin-behandlede annonce rotte model er vist i Video 1. Neonatal capsaicin behandling fremkaldte dermatitis og forværret skrabe adfærd i rotter 3 uger gammel, og annonce-lignende symptomer varet i flere uger (figur 1B, C). Om graden var mindre alvorlige, lidt nogle rotter fra recidiverende dermatitis henne ved 16 ugens i alder efter opløsning af tidlige annonce-lignende symptomer (fig. 1 d). Derudover blev serum IgE niveau, som er en biologisk markør for annonce sværhedsgraden8, forhøjet i de capsaicin-behandlede annonce rotte model (figur 1E). MRNA udtryk af IL-4 og IL-13 også steget i capsaicin-behandlede annonce rotte model (figur 1F, G).
Repræsentative fotografier viste, at FA induceret forværring af dermatitis i capsaicin-behandlede annonce rotte model 5 uger gamle (figur 2A). Eksponering på 1,2 ppm FA forværret skrabe adfærd og dermatitis i capsaicin-behandlede annonce rotte model for mere end 2 uger. Dog forværre 0,8 ppm FA eksponering ikke skrabe adfærd og dermatitis i capsaicin-behandlede annonce rotte model (figur 2B, C). Derudover forhøjede 1,2 ppm FA eksponering serum IgE niveau i capsaicin-behandlede annonce rotte model (figur 2D).
For eksponering af gasformige FA, blev ventilation salen sat som beskrevet i protokol (figur 3A). Før eksponering, var koncentrationen af FA i salen gentagne gange målt til sikring af ensartet koncentration. Når du ændrer koncentrationen af FA løsning, blev koncentrationen af gasformige FA i salen målt. Da koncentrationen af løsningen øget, varierer koncentration af gas i salen langsomt øget og koncentrationen af gas i salen fra samme løsning ikke betydeligt i gentagne målinger (figur 3B).
Figur 1: Neonatal Capsaicin behandling induceret recidiverende annonce-lignende hud betændelse og kløe i rotter. Repræsentative fotografier af betændelse i huden i capsaicin-behandlede rotter (A). Kronologisk funktioner af dermatitis (B) og skrabe adfærd (C) af capsaicin-behandlede rotter. Repræsentativt billede af recidiverende hudlæsioner 16 uger gamle capsaicin-behandlede rotter (D). (E) væsentlig udvidelse af IgE serumniveauer i capsaicin-behandlede dyr. (F) væsentlig udvidelse af IL-4 mRNA udtryk i capsaicin-behandlede dyr. (G) væsentlig udvidelse af IL-3 mRNA udtryk i capsaicin-behandlede dyr. Alle resultater blev udtrykt som middel ± SEM og analyseret ved hjælp af Student's t-test. *p < 0,05, ** p < 0,005, ***p < 0,001. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: FA eksponering forværret kløe og Dermatitis i modellen Capsaicin-behandlede AD rotte. Repræsentative fotografier af de 5th uge af behandling med 1,2 ppm og 0,8 ppm Frederiksen (A). Eksponering på 1,2 ppm FA, men ikke 0,8 ppm FA eksponering, betydeligt forværret pruritus (B) og dermatitis (C) i capsaicin-behandlede annonce model. Serum IgE niveau øges i capsaicin-behandlede annonce rotte model behandlet med 1,2 ppm FA eksponering (D). Resultaterne blev udtrykt som betyder ± SEM og analyseret ved hjælp af en en-vejs ANOVA efterfulgt af Tukey's test eller Student's t-test. *p < 0,05, ***p < 0,001 (vs rotter udsat for frisk luft). 1.2 FA-annonce: Capsaicin-behandlede annonce rotte model udsat for 1,2 ppm FA; 0,8 FA-annonce: Capsaicin-behandlede annonce rotte model udsat for 0,8 ppm FA; og luft-annonce: capsaicin-behandlede annonce rotte model udsat for frisk luft. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: FA behandling. Skematisk illustration af den regulerende myndighed og gaskammer (A). Koncentrationen af gasformige FA i salen var proportional med koncentrationen af FA løsning (B). Resultaterne blev udtrykt som middel ± SEM. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Video 1: anfald af skrabe opførsel af Capsaicin-behandlede rotter var registreret for måling af Pruritus. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)
| Regionen | Score | Beskrivelse |
| Undtagen ører | 0 | Normal |
| 1 | Tjavsede pels | |
| 2 | Alopecia eller flare | |
| 3 | Blødning eller skurv | |
| Ører | 0 | Normal |
| 1 | Flare | |
| 2 | Blødning eller skurv | |
| 3 | Tab af væv |
Tabel 1: Sværhedsgraden indeks.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskrevet her for induktion af annonce-lignende symptomer hos rotter kan tilpasses for at studere AD Patofysiologi og brugt som en screeningsværktøj for narkotika-test. Instrument for gasformige FA eksponering for capsaicin-behandlede rotter kan anvendes til at vurdere virkningerne af eksponering for forskellige gasser på forskellige dyremodeller.
Neonatal capsaicin-behandlede annonce model bygger på en mere enkel procedure end andre atopisk modeller såsom DNCB behandling model9 og epicutaneous sensibilisering model4, og er mere overkommelig end NC/Nga musen4. Manifestation af annonce-lignende symptomer i annonce model er konsekvent. Desuden, i nogle tilfælde kan denne protokol fremkalder spontane recidiverende annonce-lignende hudlæsioner i de berørte rotter uden nogen yderligere behandling3. Overdosis capsaicin injektion fremkaldte neuronal celle død og neurocutaneous inflammation10 og forårsagede alvorlige smerter i rotter. Nogle af dem muligvis lidt fra respirationsstop på grund af smerter. Det er vigtigt at forhindre dem i at respirationsstop. Således, efter injektion capsaicin hvalpene skal placeres i en ilt kammer og nogle unger kan kræve brystet kompression. Neonatal capsaicin behandling fremkalde ikke annonce-lignende symptomer i mus, og årsagen til dette er stadig ukendt. Således genetiske indgreb gælder næppe for denne annonce model ved hjælp af en knock-out stamme, men andre genetiske metoder såsom siRNA troværdig måde kompensere for denne mangel. Desuden er konsekvent manifestation af annonce-lignende symptomer på modellens rotte gavnligt for at studere AD sygdom patogenese, samt anvende det til et stof screeningsværktøj.
Etablering af kredsløbssygdomme salen for FA eksponering kræver kun konventionelle laboratorieudstyr, herunder en akryl boks og en medicinsk ilt regulator. Desuden ved at ændre løsning i luftfugter flaske ilt regulator, kan forskellige typer af gasser anvendes i forsøget. Koncentrationen af gas i salen kan opretholdes nemt ved at justere strømningshastigheden af den regulerende myndighed og koncentrationen af løsningen. Det er afgørende at sikre en tæt forsegling i installationen af kredsløbssygdomme for FA eksponering for capsaicin-behandlede AD rotte modellen ved hjælp af en akryl kammer og en medicinsk ilt regulator. Ikke kun fordi koncentrationen af gas i salen kunne variere hver gang på grund af lækage, men også den utætte gas kan skade eksperimentatorer. Fordampning af nogle flygtige organiske forbindelser (VOC) ofte blokerer røret af krystallisering. Det er således relevant at undgå tilstopning gennem kontinuerlig tube management til lang tids brug af løbende udskiftning af rørene. Denne fordampningsvarme systemet afspejler mere præcist sygdomsprogression i patienter end topisk anvendelse metoder11. Denne metode afslørede forskellige funktioner af virkningerne af FA indånding på en rotte model af Annoncen i forhold til de tidligere undersøgelser, som udsat FA for naiv dyr7,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af den offentlige velfærd & sikkerhed forskningsprogram gennem National Research Foundation af Korea (NRF) finansieret af Ministeriet for uddannelse, videnskab og teknologi (NRF-2014M3C8A5030612), og støttet af The Chung Yang, Cha Young Sun, M.D. og Jang Hej Joo Yeu Sa Memorial fond.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medical Oxygen Regulator | Yuyao Jiahua Medical | manufacturer will not affect results | |
| Tube | manufacturer will not affect results | ||
| Acrylic Chamber | Taejin Acryl | manufacturer will not affect results | |
| Plastic Chamber | Taejin Acryl | manufacturer will not affect results | |
| Paraformaldehyde, powder | Sigma | 158127 | manufacturer will not affect results |
| Wrap filme | Uniwrap | manufacturer will not affect results | |
| Capsaicin | Sigma | M2028 | manufacturer will not affect results |
| Tween 80 | Sigma | P4780 | manufacturer will not affect results |
| Digital Video Camera | Sony | HDR-CX380y | manufacturer will not affect results |
| Isoflurane | JW pharmaceutical | manufacturer will not affect results |
References
- Geha, R. S. Allergy and hypersensitivity. Nature versus nurture in allergy and hypersensitivity. Curr Opin Immunol. 15 (6), 603-608 (2003).
- Novak, N., Bieber, T., Leung, D. Y. Immune mechanisms leading to atopic dermatitis. The J Allergy Clin Immunol. 112 (Suppl 6), S128-S139 (2003).
- Back, S. K., et al. Chronically relapsing pruritic dermatitis in the rats treated as neonate with capsaicin; a potential rat model of human atopic dermatitis. J Dermatol Sci. 67 (2), 111-119 (2012).
- Jin, H., He, R., Oyoshi, M., Geha, R. S.
- Han, R. T., et al. Formaldehyde-Induced Aggravation of Pruritus and Dermatitis Is Associated with the Elevated Expression of Th1 Cytokines in a Rat Model of Atopic Dermatitis. PLOS ONE. 11 (12), e0168466 (2016).
- Xu, B., Aoyama, K., Takeuchi, M., Matsushita, T., Takeuchi, T. Expression of cytokine mRNAs in mice cutaneously exposed to formaldehyde. Immunol Lett. 84 (1), 49-55 (2002).
- Kim, J. Y., Jeong, M. S., Park, K. Y., Seo, S. J. Aggravation of atopic dermatitis-like symptoms by consecutive low concentration of formaldehyde exposure in NC/Nga mice. Exp Dermatol. 22 (3), 219-221 (2013).
- Laske, N., Niggemann, B. Does the severity of atopic dermatitis correlate with serum IgE levels? Pediatr Allergy Immunol. 15 (1), 86-88 (2004).
- Fujii, Y., Takeuchi, H., Sakuma, S., Sengoku, T., Takakura, S. Characterization of a 2,4-dinitrochlorobenzene-induced chronic dermatitis model in rats. Skin Pharmacol Physiol. 22 (5), 240-247 (2009).
- Sugimoto, T., Xiao, C., Ichikawa, H. Neonatal primary neuronal death induced by capsaicin and axotomy involves an apoptotic mechanism. Brain Res. 807 (1-2), 147-154 (1998).
- Saito, A., et al. Characterization of skin inflammation induced by repeated exposure of toluene, xylene, and formaldehyde in mice. Environ Toxicol. 26 (3), 224-232 (2011).
- Jung, W. W., et al. Formaldehyde exposure induces airway inflammation by increasing eosinophil infiltrations through the regulation of reactive oxygen species production. Environ Toixcol Pharmacol. 24 (2), 174-182 (2007).
