Summary
Describimos aquí métodos para el tratamiento de neonatal de capsaicina inducir dermatitis atópica en las ratas y la exposición de formaldehído vaporizado para investigar los efectos de la inhalación de formaldehído en dermatitis atópica.
Abstract
Dermatitis atópica es recaída crónica eczema prurítico y prevalece en el mundo especialmente en los países desarrollados. Complejas interacciones entre factores genéticos y ambientales se saben que desempeñan un papel importante en la fisiopatología de la dermatitis atópica. Sin embargo, todavía no tenemos una imagen detallada de la patogenia de esta enfermedad. Por lo tanto, es de importancia para el desarrollo de modelos animales apropiados para dilucidar la evolución de la dermatitis atópica. Por otra parte, investigando el efecto de factores ambientales como agentes contaminadores del aire en dermatitis atópica amplía la comprensión de la enfermedad. Aquí, describimos un método para inducir la dermatitis atópica en ratas con tratamiento neonatal de capsaicina y un protocolo para la exposición de una concentración constante de formaldehído a las ratas para revelar efectos en el desarrollo de la dermatitis atópica infantil y adolescente períodos. Estos protocolos se han aplicado con éxito en varios experimentos y pueden ser utilizados para otras sustancias.
Introduction
Para interrogar a los efectos de la inhalación de formaldehído (FA) en la progresión de la dermatitis atópica (AD), estableció un protocolo para la inducción de AD y desarrolló una cámara de circulación convencional para la exposición crónica de FA.
AD es una enfermedad inflamatoria crónica de la piel atribuida a las complejas interacciones entre predisposición genética y factores ambientales desencadenantes1,2. Un modelo animal adecuado es necesaria para el estudio de AD en el estado preclínico. Esto es más importante cuando dilucidar la patogenia de la EA bajo la influencia de factores ambientales. Además, para investigar mejor los efectos de los disparadores ambientales en la progresión de la AD, es esencial separar los factores ambientales individuales y cuantificar el grado de exposición.
Hemos demostrado un modelo de rata novela de AD inducida por el tratamiento neonatal de capsaicina. Este anuncio modelo3 tiene algunas ventajas sobre otros modelos de AD como los modelos de AD inducidos por sensibilización epicutánea, los modelos de AD de ingeniería genética y los modelos de ratón espontáneo de AD4. En primer lugar, este modelo desarrolla AD-como síntomas en la edad de 3 semanas, que corresponde al niño AD y es anterior a otros modelos de ratón espontáneo de AD como el ratón NC/Nga. En algunos casos, a diferencia de los modelos de AD ingeniería genética, los síntomas de los modelos de AD desaparecen y recaen espontáneamente en un período de 20 semanas. Por otra parte, el proceso de inducción de síntomas de AD-como en el modelo es más fácil que el modelo de sensibilización epicutánea, que es más similar a la dermatitis alérgica de contacto en la perspectiva del proceso de inducción.
Hemos introducido el nuevo protocolo para la exposición de la FA a un modelo animal mediante el uso de una cámara de vidrio acrílico y un regulador de oxígeno médico convencional5 para estudiar los efectos de la inhalación de la FA en el desarrollo de la EA en el período infantil y adolescente. El regulador ha permitido exponer a los animales a una concentración constante de gas mediante el ajuste de las tasas de flujo y la concentración de la solución. Estudios previos han reportado varias formas de exposición del FA a modelos animales. Xu et al describen el método de exposición en que FA solución fue aplicada directamente a la piel6. Otro estudio reciente abordó el protocolo de la exposición de gas FA utilizando un generador de disolventes volátiles especializados, modelo 49127. Comparado con métodos de estudios previos, el nuevo método tiene más fácilmente y puede ser aplicado para otras soluciones además de FA.
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Protocol
todos los métodos aquí descritos han sido aprobados por el internacional cuidado Animal y el Comité uso (IACUC) de Corea Universidad Facultad de medicina. 6 semanas después del nacimiento, los experimentadores pueden inducir enthansasia y recoger diversas muestras como piel y suero de ratas.
1. inducción de AD por el tratamiento Neonatal de capsaicina
- para preparar 5 mg/mL solución de capsaicina, agregar 50 mg de capsaicina a 1 mL de Tween 80 y 1 mL de etanol al 100% en un tubo cónico de 15 mL.
- Añada 8 mL de solución salina normal en el tubo cónico. Agite el tubo vigorosamente hasta que no capas separadas son accesibles de forma
- inyectar la solución de capsaicina (10 μl/g) en el tejido subcutáneo, en la línea media y parte posterior del cuello de una rata Sprague-Dawley neonatal.
- Entrega la capsaicina entre 12 h a 48 h después del nacimiento (crítica).
Nota: Si la inyección se retrasa por más de unos días, dermatitis no se desarrollarán o se mantendrán solamente durante semanas. Si la inyección es demasiado pronto, señal de socorro respiratoria puede ocurrir debido a dolores. - Para evitar que las ratas neonatales de paro respiratorio debido a la inyección de capsaicina, empuje el pecho de los recién nacidos para estimular la respiración o mantener los recién nacidos en una cámara de oxígeno hasta que la respiración se vuelve normal. desde dolor capsaicin-inducida puede desalentar la respiración, añadir anestesia general posiblemente podría empeorar la dificultad respiratoria. Así, los experimentadores no deben usar anesthesics para aumentar la supervivencia de las ratas.
- Entrega la capsaicina entre 12 h a 48 h después del nacimiento (crítica).
2. Evaluación del prurito y Dermatitis en un modelo de rata de AD
- medición del prurito por conteo espontáneo comportamiento rasguño
- plástico preparar cámaras (20 cm x 30 cm x 20 cm) equipada con un espejo para permitir la cobertura completa para la visión y los agujeros para permitir que las ratas respirar.
- Set up y ajustar una cámara de vídeo digital correctamente para registrar el espejo y las vistas frontales de las ratas al mismo tiempo.
- Ratas del lugar en el plástico del compartimiento y cubrir el techo de la cámara con un objeto pesado para evitar apertura.
- Grabar los comportamientos espontáneos de ratas de 1 h, reproducir los clips de vídeo y contar el número de arañazos comportamientos.
- Evaluación de lesión de piel con un sistema de puntuación
- colocar la rata en la cámara de inducción.
- Gire el flujómetro de oxígeno a 2 L/min caudal y ajustar el vaporizador de isoflurano al 3% para la anestesia.
- Identificar la extensión y severidad de la dermatitis en las orejas y otras partes de una rata.
- Definir el tamaño de la unidad de la magnitud de las lesiones de piel como 0,25 cm 2 y la gravedad de las lesiones de piel por la siguiente tabla 1: índice de severidad, grado de puntuación dermatitis multiplicando la extensión y severidad (Ver puntuación de dermatitis en < fuerte clase = "xfig" > Figura 1B).
3. Exposición de FA gaseoso a animales
- preparación de la cámara de inhalación
- preparar una caja de vidrio acrílico (55 cm x 40 cm x 35 cm) que tiene dos salidas en lados opuestos.
- PRECAUCIÓN. Para la circulación de gas FA, colocar la salida superior de la entrada y hacer que el tamaño de la salida más grande que el de la entrada.
- PRECAUCIÓN. Para la medición de la concentración de gas interna, por otra parte de las salidas, Taladre tres pasos pequeños, que se pueden cerrar. Tubos de
- Conecte a ambas salidas. Coloque un tubo enchufe campana de circulación o fuera del edificio para la emisión de los gases y conectar el otro tubo de salida a un regulador de oxígeno médico.
- Colocar una jaula de ratas convencionales dentro de la caja de acrílico cristal.
- Poner las ratas en la jaula de una semana después del nacimiento para 5 semanas (2 h/día y 5 días a la semana).
- Sello de la caja de cristal acrílico tan ajustadamente como sea posible para evitar fugas de gas.
Nota: Para el sellado firmemente, la tapa de la cámara debe contener caucho. Aplica film transparente para envolver la cámara de sellado apretado.
- Generación de FA gaseoso mediante el uso de un regulador de oxígeno médico
- disolver 5 g de FA en 1 L de agua.
- Poner la solución de FA de 0,5% en la botella del humidificador del regulador de oxígeno medicinal de.
- Después de conectar el tubo de entrada al regulador, encienda el regulador y ajustar el flujo a 5 L/min.
- Ajustar la concentración de la solución y la velocidad de flujo para determinar la concentración de gas en la cámara de.
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Representative Results
La inflamación de AD-como la piel de la modelo de ratas tratadas con capsaicina anuncio en 7 semanas de edad se presenta en la figura 1A. Comportamientos rascarse robustos del modelo de rata tratadas con capsaicina AD se muestra en el Video 1. Tratamiento neonatal de capsaicina produce dermatitis y agravado rayar conductas en ratas de 3 semanas de edad, y AD-como los síntomas persistieron durante varias semanas (figura 1B, C). Aunque el grado fue menos severo, algunas ratas sufrieron de dermatitis recurrente en 16 semanas de edad después de la resolución de síntomas tempranos de AD-como (figura 1). Además, nivel de IgE, que es un marcador biológico para AD gravedad8, del suero fue elevado en el modelo de rata de AD tratados con capsaicina (Figura 1E). Las expresiones de mRNA de IL-4 y IL-13 aumentaron también en modelo de rata de AD tratados con capsaicina (Figura 1F, G).
Fotografías representativas demostraron que la FA inducida por la provocación de dermatitis en el modelo de rata tratadas con capsaicina AD en 5 semanas de edad (figura 2A). Exposición de 1,2 ppm FA agrava los comportamientos rascarse y dermatitis en modelo de rata tratadas con capsaicina AD durante más de dos semanas. Sin embargo, la exposición 0,8 ppm FA no exacerbar rasguñando comportamientos y dermatitis en modelo de rata de AD tratados con capsaicina (figura 2B, C). Además, exposición de 1,2 ppm FA había elevado el nivel del suero IgE en modelo de rata de AD tratados con capsaicina (Figura 2D).
Para la exposición de FA gaseoso, la cámara de ventilación se estableció como se describe en el Protocolo (Figura 3A). Antes de la exposición, la concentración de FA en la cámara se midió varias veces para garantía de concentración constante. Al cambiar la concentración de la solución de FA, se midió la concentración de FA gaseosa en la cámara. A medida que aumenta la concentración de la solución, la concentración del gas en la cámara aumentado lentamente y la concentración del gas en la cámara de la misma solución no varió significativamente en medidas repetidas (figura 3B).
Figura 1: tratamiento de capsaicina Neonatal inducida por recaída de AD-como la piel inflamación y prurito en las ratas. Fotografías representativas de inflamación de la piel en ratas tratadas con capsaicina (A). Características cronológicos del dermatitis (B) y rasguño comportamientos (C) de las ratas tratadas con capsaicina. Imagen representativa recaída de lesiones de piel de ratas de 16 semanas de edad tratados con capsaicina (D). (E) elevación significativa de los niveles de IgE séricos en animales tratados con capsaicina. (F) elevación significativa de la expresión del mRNA de la IL-4 en animales tratados con capsaicina. (G) elevación significativa de la expresión del mRNA de la IL-3 en animales tratados con capsaicina. Todos los resultados se expresaron como medios ± SEM y analizan usando la prueba t de Student. *p < 0.05, ** p < 0.005, ***p < 0.001. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: exposición FA agrava el prurito y Dermatitis en el modelo de rata tratados con capsaicina de AD. Fotografías representativas dela 5 semana de tratamiento con ppm 1,2 y 0,8 ppm FA (A) . Exposición de 1,2 ppm FA pero no exposición a 0.8 ppm FA, significativamente exacerbado prurito (B) y dermatitis (C) en el modelo de anuncio tratados con capsaicina. Nivel de IgE del suero aumentado en el modelo de rata tratadas con capsaicina AD tratados con exposición de 1,2 ppm FA (D). Los resultados se expresaron como medios ± SEM y analizados mediante un ANOVA unidireccional seguida de Tukey o prueba t de Student. *p < 0.05, ***p < 0.001 (ratas vs expuestas al aire fresco). 1.2 FA-AD: modelo de ratas tratadas con capsaicina anuncio expuesto a 1,2 ppm FA; 0,8 FA-AD: modelo de ratas tratadas con capsaicina anuncio expuesto a 0.8 ppm FA; y aire-AD: modelo de ratas tratadas con capsaicina anuncio expuesto al aire libre. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: tratamiento de la FA. Ilustración esquemática del regulador y la cámara de gas (A). La concentración de FA gaseosa en la cámara fue proporcional a la concentración de la solución de FA (B). Los resultados se expresaron como medios ± SEM. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
1 video: peleas de ratas tratados con comportamientos rasguño de capsaicina se registraron para la medición del prurito. Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)
| Región | Puntuación | Descripción |
| Salvo orejas | 0 | Normal |
| 1 | Piel tenue | |
| 2 | La alopecia o la llamarada | |
| 3 | Sangrado o costra | |
| Orejas de | 0 | Normal |
| 1 | Llamarada | |
| 2 | Sangrado o costra | |
| 3 | Pérdida del tejido |
Tabla 1: Índice de gravedad de.
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Discussion
El protocolo descrito aquí para la inducción de AD-como síntomas en ratas puede adaptado para el estudio de la fisiopatología de la AD y utilizado como una herramienta de detección para la prueba de la droga. El instrumento para la exposición del FA gaseoso a las ratas tratadas con capsaicina puede aplicarse para evaluar los efectos de la exposición a los varios gases en diversos modelos animales.
El modelo de anuncio tratados con capsaicina neonatal se basa en un procedimiento más sencillo que otros modelos atópicas como el DNCB tratamiento modelo9 y epicutánea sensibilización modelo4y es más asequible que el de ratón NC/Nga4. La manifestación de síntomas de AD-como en el modelo del anuncio es coherente. Por otra parte, en algunos casos, este protocolo presenta espontánea recurrente AD-como lesiones de piel en las ratas afectadas sin ningún tratamiento adicional3. Inyección de capsaicina sobredosis evocados celular neuronal muerte y neurocutáneos inflamación10 y causa dolor severo en las ratas. Algunos de ellos posiblemente sufrieron de un paro respiratorio debido al dolor. Es de importancia para evitar que la detención respiratoria. Así, después de la inyección de capsaicina, los cachorros deben ser colocados en una cámara de oxígeno y algunos cachorros pueden requerir compresión del pecho. Tratamiento neonatal de capsaicina no induce AD-como síntomas en ratones, y la causa se desconoce. Así, la intervención genética es difícilmente aplicable a este modelo de anuncio con una cepa knock-out, pero otros enfoques genéticos como siRNA plausible compensan esta carencia. Además, la manifestación constante de AD-como síntomas del modelo de la rata es beneficiosa para estudiar la patogénesis de la enfermedad AD, así como aplicar a una herramienta de detección de drogas.
El establecimiento de la cámara circulatorio para la exposición FA sólo requiere equipo de laboratorio convencional como una caja de acrílico y un regulador de oxígeno medicinal. Además, cambiando la solución en la botella del humidificador de oxígeno regulador, diversos tipos de gases se pueden aplicar en el experimento. Concentración del gas en la cámara se puede mantener fácilmente mediante el ajuste de la tasa de flujo del regulador y la concentración de la solución. Es fundamental para asegurar un sellado apretado en la instalación del sistema circulatorio para la exposición de FA a lo tratados con capsaicina AD modelo de la rata mediante una cámara de acrílico y un regulador de oxígeno medicinal. No sólo porque la concentración de gas en la cámara podría diferir cada vez debido a la fuga, pero también el gas que se escapa puede dañar a los experimentadores. Vaporización de algunos compuestos orgánicos volátiles (VOC) a menudo bloquea el tubo por la cristalización. Por lo tanto, es relevante evitar la obstrucción mediante la administración continua de tubo para uso a largo plazo cambiando regularmente los tubos. Este sistema de vaporización refleja más precisamente la progresión de la enfermedad en los pacientes que los métodos de aplicación tópica11. Este método reveló las características distintas de los efectos de la inhalación de la FA en un modelo de rata de anuncio en comparación con los estudios anteriores que exponen FA a ingenuos animales7,12.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por el bienestar público & programa de investigación de seguridad a través de la Fundación de investigación nacional de Corea (NRF) financiado por el Ministerio de educación, ciencia y tecnología (NRF-2014M3C8A5030612) y apoyado por el Chung Yang, Cha Young El sol, M.D. y Jang Hi Joo Yeu Sa Memorial fondo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medical Oxygen Regulator | Yuyao Jiahua Medical | manufacturer will not affect results | |
| Tube | manufacturer will not affect results | ||
| Acrylic Chamber | Taejin Acryl | manufacturer will not affect results | |
| Plastic Chamber | Taejin Acryl | manufacturer will not affect results | |
| Paraformaldehyde, powder | Sigma | 158127 | manufacturer will not affect results |
| Wrap filme | Uniwrap | manufacturer will not affect results | |
| Capsaicin | Sigma | M2028 | manufacturer will not affect results |
| Tween 80 | Sigma | P4780 | manufacturer will not affect results |
| Digital Video Camera | Sony | HDR-CX380y | manufacturer will not affect results |
| Isoflurane | JW pharmaceutical | manufacturer will not affect results |
References
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