Summary
Her beskriver vi metoder for neonatal capsaicin behandling å indusere atopisk dermatitt i rotter og eksponering av fordampede formaldehyd å undersøke virkningene av formaldehyd innånding på atopisk dermatitt.
Abstract
Atopisk dermatitt er kronisk relapsing pruritic eksem og råder over hele verden spesielt i utviklede land. Komplekse interaksjoner mellom genetiske og miljømessige faktorer er kjent for å spille en viktig rolle i Patofysiologien ved atopisk dermatitt. Men mangler vi fortsatt et detaljert bilde av patogenesen av denne sykdommen. Dermed er det viktig å utvikle riktige dyr modeller for Klargjørende progresjon av atopisk dermatitt. Videre utvider undersøker effekten av miljømessige faktorer som luftforurensende på atopisk dermatitt forståelse av sykdommen. Her beskriver vi en metode for å indusere atopisk dermatitt i rotter neonatal capsaicin behandling og en protokoll for eksponering for en konstant konsentrasjon av formaldehyd rotter å avsløre effekter på utvikling av atopisk dermatitt i infantile og ungdom perioder. Disse protokollene er vellykket brukt til flere eksperimenter og kan brukes for andre stoffer.
Introduction
For å avhøre effekten av formaldehyd (FA) innånding på atopisk dermatitt (AD) progresjon, vi etablert en protokoll for AD induksjon og utviklet en konvensjonell sirkulasjon kammer for kronisk eksponering av FA.
Annonsen er en kronisk inflammatorisk hudsykdom knyttet til komplekse interaksjoner mellom genetisk disposisjon og miljømessige utløsere1,2. En skikkelig dyremodell må studere annonse i preklinisk staten. Dette er de viktigste når Klargjørende patogenesen av AD påvirket av miljøfaktorer. Videre bedre undersøke effekten av miljømessige utløsere på AD progresjon, er det viktig å skille de enkelte miljøfaktorer og kvantifisere eksponeringsgraden.
Vi har vist en roman rotte modell av AD indusert av neonatal capsaicin behandling. Denne Annonsen modell3 har noen fortjeneste over andre AD modeller som AD modeller av epicutaneous allergi, genmodifiserte AD modeller og spontan musen modeller av AD4. Først utvikler denne modellen AD-lignende symptomer i en alder av 3 uker, som tilsvarer spedbarn AD og er tidligere enn andre spontan musen modeller av Annonsen som NC/Nga musen. I noen tilfeller, i motsetning til genmodifiserte AD modeller symptomene på AD modellene avta og tilbakefall spontant over en 20-ukers periode. Videre er induksjon prosessen med AD-lignende symptomer i modellen lettere enn den epicutaneous sensibilisering modellen, som er mer lik den allergisk kontakteksem i perspektiv av induksjon prosessen.
Vi har innført romanen protokollen for FA eksponering for en dyr modell med en akryl glass chamber og konvensjonell medisinsk oksygen regulator5 for å studere virkningene av FA innånding på utvikling av AD i infantile og unges perioder. Regulatoren har tillatt oss å avsløre dyr til en konstant konsentrasjon av gass ved å justere flyt priser og løsning konsentrasjonen. Tidligere studier har rapportert flere måter å eksponering for FA dyremodeller. Xu et al. beskrevet metoden eksponering i som FA løsning var direkte brukes til huden6. En fersk studie adressert protokollen FA gass eksponering ved hjelp av en spesialisert flyktige løsemidler generator, modell 49127. Sammenlignet med metoder for tidligere studier, den nye metoden er lettere utstyrt og kan brukes for andre løsninger i tillegg til FA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alle metodene som er beskrevet her er godkjent av International Animal Care og bruk Committee (IACUC) av Korea University College i medisin. 6 uker etter fødselen, forskere kan indusere enthansasia og samle forskjellige prøver som huden og serum rotter.
1. induksjon av Annonsen Neonatal Capsaicin behandling
- for å forberede 5 mg/mL capsaicin løsning, legge til 50 mg capsaicin 1 mL av Tween 80 og 1 mL av 100% etanol i et 15 mL konisk rør.
- Legge til 8 mL av normal saline konisk røret. Rist røret kraftig til ingen skilt lag er synlige
- injisere capsaicin løsningen (10 µL/g) i subkutant vev, på midtlinjen og baksiden av halsen av rotte neonatal Sprague-Dawley.
- Leverer capsaicin mellom 12t til 48 timer etter fødselen (kritisk).
Merk: Hvis injeksjon er forsinket med mer enn noen få dager, dermatitt vil ikke utvikle eller det vil vedvare bare noen uker. Hvis injeksjon er for tidlig, luftveissykdom kan skyldes store smerter. - å hindre neonatal rotter fra respirasjonsstans grunnet capsaicin injeksjon, presse brystet av nyfødte å oppmuntre puste eller holde nyfødte i en oksygen kammer til åndedrett blir normal. siden capsaicin-indusert smerte kan motvirke puste, legge til generell anestesi kunne muligens forverres åndedrag problemet. Dermed forskere bør ikke bruke anesthesics til å øke overlevelse av rotter.
- Leverer capsaicin mellom 12t til 48 timer etter fødselen (kritisk).
2. Evaluering av Pruritus og betennelse i en rotte modell av AD
- måling av pruritus ved å telle spontan skrape oppførsel
- klar plast kammer (20 cm x 30 cm x 20 cm) utstyrt med speil å tillate full dekning for visning og hull som tillater rotter å puste.
- Sette opp og justere et digitalt videokamera riktig å registrere speil visninger og foran syn av rotter samtidig.
- Sted rotter i plasten kammer og dekker taket av kammer med en tung gjenstand å forhindre åpning.
- Registrere det spontane opptreden av rotter 1t, spille av videoklipp og telle antall skrape oppførsel.
- Vurdering av hud leksjonen bruker poengberegningssystem
- Sett rotta i induksjon kammeret.
- Slå oksygen flowmeter til 2 L/min væskemengde og justere isoflurane vaporizer 3% for anestesi.
- Identifisere omfanget og alvorlighetsgraden av betennelse i ørene og andre deler av rotte.
- Definerer enhetsstørrelsen på for omfanget av hudlesjoner som 0,25 cm 2 og alvorlighetsgraden av hudlesjoner av følgende tabell 1: alvorlighetsgrad indeks; grad dermatitt score ved å multiplisere omfanget og alvorlighetsgraden (se dermatitt score i < sterk class = "xfig" > figur 1B).
3. Eksponering for gass FA dyr
- utarbeidelse av innånding kammeret
- forberede en akryl glass boksen (55 cm x 40 cm x 35 cm) som har to uttak på motsatte sider.
- Forsiktig. For sirkulasjon FA gass, sett utsalgsstedet høyere enn innløp og gjøre størrelsen på utsalgsstedet større enn mengden.
- Forsiktig. For måling av interne gass konsentrasjon, på en annen side av utsalgssteder, bore tre små passasjer, som kan lukkes.
- Koble rør til begge utgangene. Plasser en stikkontakt rør sirkulasjon hette eller utenfor bygningen for utslipp av gassen, og koble andre stikkontakt røret til en medisinsk oksygen regulator.
- Plasser konvensjonelle rotte bur inne boksen akrylglass.
- Sette rotter i buret fra en uke etter fødselen i 5 uker (2 døgnet og fem dager i uken).
- Forsegle akryl glass boksen så tett som mulig å hindre gasslekkasjer.
Merk: For tett forseglet, kammer lokket skal inneholde gummi. Bruk plastfolie å vikle kammeret for stramt tetting.
- Generasjon av gass FA ved hjelp av en medisinsk oksygen regulator
- oppløses 5 g av FA i 1 L vann.
- 0,5% FA løsningen innlegge luftfukter flaske medisinsk oksygen regulator.
- Etter tilkobling røret innløpet til regulator, slå på regulator og sett infusjonshastigheten til 5 L/min.
- Juster løsning konsentrasjonen og flyt å bestemme konsentrasjonen av gass i kammeret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
AD-aktig hudbetennelse av capsaicin-behandlet AD rotte modell 7 uker gamle vises i figur 1A. Robust skrape oppførsel av capsaicin-behandlet AD rotte modell vises i Video 1. Neonatal capsaicin behandling elicited dermatitt og forverret skrape oppførsel i rotter 3 ukens av alderen, og AD-lignende symptomer vedvarte i flere uker (figur 1B, C). Om graden var mindre alvorlig, fikk noe rotter relapsing dermatitt for 16 ukens av alderen etter oppløsningen av tidlig AD-lignende symptomer (figur 1 d). Videre ble serum IgE nivå, som er en biologisk AD alvorlighetsgrad8, hevet i capsaicin-behandlet AD rotte modell (figur 1E). MRNA uttrykkene IL-4 og IL-13 også økt i capsaicin-behandlet AD rotte modell (figur 1F, G).
Representant fotografier viste at FA indusert forverring av dermatitis i capsaicin-behandlet AD rotte modell for 5 ukens av alderen (figur 2A). Eksponering av 1,2 ppm FA forverret avlysning atferd og betennelse i capsaicin-behandlet AD rotte modell for mer enn 2 uker. Imidlertid forverre 0,8 ppm FA eksponering ikke skrape oppførsel og dermatitt i capsaicin-behandlet AD rotte modell (figur 2B, C). Videre opphøyet 1,2 ppm FA eksponering serum IgE nivå i capsaicin-behandlet AD rotte modell (figur 2D).
For eksponering av gass FA, ble ventilasjon kammeret satt opp som beskrevet i protokollen (figur 3A). Før eksponering, ble konsentrasjonen av FA i kammeret gjentatte ganger målt for kvalitetssikring konsekvent konsentrasjon. Når du endrer konsentrasjonen av FA løsning, ble konsentrasjonen av gass FA i kammeret målt. Som konsentrasjonen av løsningen økt, varierer konsentrasjonen av gassen i kammeret sakte økt og konsentrasjonen av gassen i kammeret fra samme løsningen ikke betydelig i gjentatte målinger (figur 3B).
Figur 1: Neonatal Capsaicin behandling indusert Relapsing AD-aktig hudbetennelse og kløe i rotter. Representant fotografier av hudbetennelse i capsaicin-behandlet rotte (A). Kronologisk funksjoner av dermatitt (B) og skrape atferd (C) av capsaicin-behandlet rotter. Representativt bilde av relapsing hudlesjoner 16 uke gamle capsaicin-behandlet rotter (D). (E) betydelig høyde av serum IgE i capsaicin-behandlede dyr. (F) betydelig heving av IL-4 mRNA uttrykk i capsaicin-behandlede dyr. (G) betydelig heving av IL-3 mRNA uttrykk i capsaicin-behandlede dyr. Alle resultatene ble uttrykt som betyr ± SEM og analysert ved hjelp av Student t-test. *p < 0,05, ** p < 0.005, ***p < 0,001. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: FA eksponering forverret Pruritus og eksem i Capsaicin-behandlet AD rotte modell. Representant fotografier av 5th uken av behandling med 1,2 ppm og 0,8 ppm FA (A). Eksponering av 1,2 ppm FA, men ikke 0,8 ppm FA eksponering, betydelig forverret pruritus (B) og dermatitt (C) i capsaicin-behandlet AD modellen. Serum IgE nivå økte i capsaicin-behandlet AD rotte modell behandlet med 1,2 ppm FA eksponering (D). Resultatene ble uttrykt som betyr ± SEM og analysert ved hjelp av en enveis ANOVA etterfulgt av Tukeys eller Student t-testen. *p < 0,05, ***p < 0,001 (vs rotter utsatt for frisk luft). 1.2 FA-annonse: Capsaicin-behandlet AD rotte modell utsatt for 1,2 ppm FA; 0,8 FA-annonse: Capsaicin-behandlet AD rotte modell utsatt for 0,8 ppm FA; og luft-AD: capsaicin-behandlet AD rotte modell utsatt for frisk luft. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: FA behandling. Skjematisk illustrasjon av regulator og gasskammeret (A). Konsentrasjonen av gass FA i kammeret var forhold til konsentrasjonen av FA løsning (B). Resultatene ble uttrykt som betyr ± SEM. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Video 1: utbrudd av skrape oppførsel av Capsaicin-behandlet rotter ble registrert for måling av Pruritus. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
| Regionen | Poengsum | Beskrivelse |
| Unntatt ører | 0 | Normal |
| 1 | Pistrete pels | |
| 2 | Alopecia eller fakkel | |
| 3 | Blødning eller skorpe | |
| Ører | 0 | Normal |
| 1 | Fakkel | |
| 2 | Blødning eller skorpe | |
| 3 | Tap av vev |
Tabell 1: Alvorlighetsgrad indeks.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen beskrevet her for induksjon av AD-lignende symptomer i rotter kan tilpasses for å studere AD patofysiologi og brukt som en screening verktøyet for dopingtest. Instrumentet for eksponering for gass FA capsaicin-behandlet rotter kan brukes for å evaluere effekten av eksponering for ulike gasser på ulike dyremodeller.
Neonatal capsaicin-behandlet AD modellen er avhengig av en mer enkel prosedyre enn andre atopisk modeller som DNCB behandling modell9 og epicutaneous sensibilisering modell4, og er rimeligere enn NC/Nga musen4. Manifestasjonen av AD-lignende symptomer i AD modellen er konsekvent. Videre i noen tilfeller utløser denne protokollen spontan relapsing AD hudlesjoner i berørte rotter uten noen ekstra behandling3. Overdose capsaicin utløste neuronal celle død og neurocutaneous betennelse10 og forårsaket store smerter i rotter. Noen av dem fikk muligens respirasjonsstans grunnet smerten. Det er viktig å hindre dem fra respirasjonsstans. Dermed etter capsaicin injeksjon, valpene skal plasseres i en oksygen kammer og noen unger kan kreve brystet komprimering. Neonatal capsaicin behandling få ikke AD-lignende symptomer i mus, og årsaken til dette er fortsatt ukjent. Dermed genetisk er neppe gjelder denne Annonsen modellen bruker en knock-out belastning, men andre genetisk tilnærminger som siRNA kompensere plausibly for dette brist. Videre er konsekvent manifestasjonen av AD-lignende symptomer av rotte modell gunstig for studerer AD sykdom patogenesen, i tillegg til å bruke det på en narkotika screening verktøyet.
Etableringen av sirkulasjons kammeret for FA eksponering krever bare vanlig laboratoriumutstyr inkludert en akryl boks og en medisinsk oksygen regulator. Videre, ved å endre løsningen i luftfukter flaske oksygen regulator, diverse typer gasser kan brukes i eksperimentet. Konsentrasjonen av gassen i kammeret kan vedlikeholdes enkelt ved å justere inntakets regulator og konsentrasjonen av løsningen. Det er viktig å sikre en tett forsegling i installasjonen av sirkulasjonssystemet for FA eksponering til capsaicin-behandlet AD rotte modellen med en akryl chamber og en medisinsk oksygen regulator. Ikke bare fordi konsentrasjonen av gass i kammeret kan variere hver gang på grunn av lekkasje, men også lekker gassen kan skade eksperimentelle. Fordamping av enkelte flyktige organiske forbindelser (VOC) ofte blokkerer røret ved krystallisasjon. Dermed er det relevant å unngå tilstopping gjennom kontinuerlig tube management for langsiktig bruk av regelmessig erstatter rørene. Dette fordamping systemet gjenspeiler mer presist sykdomsprogresjon i pasienter enn den aktuelle programmet metoder11. Denne metoden avdekket distinkte egenskaper av effektene av FA innånding på en rotte modell av Annonsen sammenlignet de tidligere studiene som utsatt FA naiv dyr7,12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Denne forskningen ble støttet av offentlig velferd & sikkerhet forskningsprogram gjennom National Research Foundation av Korea (NRF) finansiert av departementet for utdanning, vitenskap og teknologi (NRF-2014M3C8A5030612), og støttes av The Chung Yang, Cha Young Sun, MD og Jang Hei Joo Yeu Sa Memorial Fund.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Medical Oxygen Regulator | Yuyao Jiahua Medical | manufacturer will not affect results | |
| Tube | manufacturer will not affect results | ||
| Acrylic Chamber | Taejin Acryl | manufacturer will not affect results | |
| Plastic Chamber | Taejin Acryl | manufacturer will not affect results | |
| Paraformaldehyde, powder | Sigma | 158127 | manufacturer will not affect results |
| Wrap filme | Uniwrap | manufacturer will not affect results | |
| Capsaicin | Sigma | M2028 | manufacturer will not affect results |
| Tween 80 | Sigma | P4780 | manufacturer will not affect results |
| Digital Video Camera | Sony | HDR-CX380y | manufacturer will not affect results |
| Isoflurane | JW pharmaceutical | manufacturer will not affect results |
References
- Geha, R. S. Allergy and hypersensitivity. Nature versus nurture in allergy and hypersensitivity. Curr Opin Immunol. 15 (6), 603-608 (2003).
- Novak, N., Bieber, T., Leung, D. Y. Immune mechanisms leading to atopic dermatitis. The J Allergy Clin Immunol. 112 (Suppl 6), S128-S139 (2003).
- Back, S. K., et al. Chronically relapsing pruritic dermatitis in the rats treated as neonate with capsaicin; a potential rat model of human atopic dermatitis. J Dermatol Sci. 67 (2), 111-119 (2012).
- Jin, H., He, R., Oyoshi, M., Geha, R. S.
- Han, R. T., et al. Formaldehyde-Induced Aggravation of Pruritus and Dermatitis Is Associated with the Elevated Expression of Th1 Cytokines in a Rat Model of Atopic Dermatitis. PLOS ONE. 11 (12), e0168466 (2016).
- Xu, B., Aoyama, K., Takeuchi, M., Matsushita, T., Takeuchi, T. Expression of cytokine mRNAs in mice cutaneously exposed to formaldehyde. Immunol Lett. 84 (1), 49-55 (2002).
- Kim, J. Y., Jeong, M. S., Park, K. Y., Seo, S. J. Aggravation of atopic dermatitis-like symptoms by consecutive low concentration of formaldehyde exposure in NC/Nga mice. Exp Dermatol. 22 (3), 219-221 (2013).
- Laske, N., Niggemann, B. Does the severity of atopic dermatitis correlate with serum IgE levels? Pediatr Allergy Immunol. 15 (1), 86-88 (2004).
- Fujii, Y., Takeuchi, H., Sakuma, S., Sengoku, T., Takakura, S. Characterization of a 2,4-dinitrochlorobenzene-induced chronic dermatitis model in rats. Skin Pharmacol Physiol. 22 (5), 240-247 (2009).
- Sugimoto, T., Xiao, C., Ichikawa, H. Neonatal primary neuronal death induced by capsaicin and axotomy involves an apoptotic mechanism. Brain Res. 807 (1-2), 147-154 (1998).
- Saito, A., et al. Characterization of skin inflammation induced by repeated exposure of toluene, xylene, and formaldehyde in mice. Environ Toxicol. 26 (3), 224-232 (2011).
- Jung, W. W., et al. Formaldehyde exposure induces airway inflammation by increasing eosinophil infiltrations through the regulation of reactive oxygen species production. Environ Toixcol Pharmacol. 24 (2), 174-182 (2007).
