Summary
本文介绍了一种用于快速人颞骨切片的技术，该技术利用带有双金刚石锯片的微锯生成薄片，用于快速脱钙和分析颞骨免疫组织化学。
Abstract
人颞骨切片的组织病理学分析是研究内耳和中耳病理学的基本技术。颞骨切片通过死后颞骨采集、固定、脱钙、包埋和染色制备。由于颞骨的密度，脱钙是一个耗时且资源密集型的过程;完整的组织准备平均可能需要9-10个月。这减缓了耳病理学研究，阻碍了时间敏感的研究，例如与COVID-19大流行相关的研究。本文描述了一种快速制备和脱钙颞骨切片以加速组织处理的技术。
使用标准技术在死后收获颞骨，并固定在10%福尔马林中。使用带有双金刚石锯片的精密微锯将每个部分切割成三个厚的部分。然后将厚颞骨切片在脱钙溶液中脱钙7-10天，然后嵌入石蜡中，使用冷冻组切片成薄（10μm）切片，并安装在未充电的载玻片上。然后将组织样本脱蜡并重新水合以进行抗体染色（ACE2，TMPRSS2，呋喃蛋白）并成像。该技术将从收获到组织分析的时间从9-10个月缩短到10-14天。高速颞骨切片可能会提高耳病理学研究的速度，减少组织制备所需的资源，同时还可以促进时间敏感的研究，例如与COVID-19相关的研究。
Introduction
人类颞骨研究为研究内耳和中耳的病理学和病理生理学提供了宝贵的资源。在19世纪之前，人们对耳科疾病1，2，3知之甚少。为了更好地了解耳科疾病和“从庸医手中抢救出耳外科手术”，约瑟夫·汤因比（1815-1866）开发了研究人类颞骨组织学切片的方法3。在19世纪余下的时间里，维也纳的亚当·波利策（Adam Politzer，1835-1920）和欧洲各地的其他人进一步推动了这项工作，他使用颞骨切片来描述影响耳朵的许多常见疾病的组织病理学2，3，4。
美国第一个人类颞骨实验室于1927年在约翰霍普金斯医院开业，Stacy Guild（1890-1966）在那里开发了颞骨切片方法5，6。Guild开发的方法包括9-10个月的过程，包括死后收获，固定，硝酸脱钙，乙醇脱水，细胞样蛋白包埋，切片，染色和安装。哈罗德·舒克内希特（1917-1996）后来对这种技术进行了修改7;然而，这一过程的基本组成部分基本上没有改变。
维持颞骨实验室所需的大量资源对颞骨研究提出了挑战，并可能导致其在过去30年中受欢迎程度的下降4，8。颞骨实验室资源的很大一部分必须用于9-10个月的颞骨制备过程。准备过程中最耗时的步骤之一是颞骨的脱钙，颞骨是人体中最密集的骨头。脱钙通常在硝酸或乙二胺四乙酸（EDTA）中进行，需要数周至数月，同时需要频繁更换溶液7，9。此外，对人耳进行时间敏感的研究，例如与COVID-19大流行相关的研究，可能会受到这种缓慢的准备过程的阻碍。本文介绍了一种高速颞骨切片技术，该技术使用金刚石显微镜锯生成厚切片，从而可以在颞骨收获后10-14天内进行快速脱钙和组织分析。
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Protocol
该协议是在IRB（IRB00250002）批准下开发的，并符合使用人体组织和感染材料的机构政策。每个颞骨捐献者在死亡前都提供了书面同意，或者是在死后从捐献者家属那里获得的同意。有关本协议中使用的所有材料、设备和软件的详细信息，请参阅材料 表 。
1. 颞骨采集
- 在使用本方案之前，获得当地机构审查委员会（IRB）委员会的批准，审查使用人类和传染性材料的机构政策，并获得组织捐赠的同意。
- 在处理来自COVID-19阳性颞骨捐献者的组织之前，请穿上适当的个人防护装备（PPE）。确保PPE由N-95呼吸器和面罩（或正压空气净化系统），防护服和两副手套组成。在开始本方案之前，请先回顾正确穿脱PPE的技术10.
- 在供体死亡后12-24小时内收获颞骨组织。如果尸体没有冷藏，请确保在死亡后8小时内收获。
- 尸检时采用四切口、阻断法截骨7采集颞骨。
- 开颅手术后，切除大脑并将颅神经急剧分开到内耳道。
- 做第一个骨切口，骨骼与颞骨的鳞状部分平行并仅内侧。
- 在颞骨内侧边界进行与第一个骨切口平行的第二个骨切口。
- 然后，使第三个切口位于前方3-4厘米处，平行于岩脊。
- 使第四个切口大致平行于第三个切口，距岩脊后2厘米。
注意：确保所有切口都延伸到颅底。 - 然后，使用尖锐的解剖去除颞骨，以释放沿标本下边缘的软组织附着物。如果要在颞骨采集后进行防腐处理，请绑住颈动脉的残端。
- 尸检时采用四切口、阻断法截骨7采集颞骨。
2. 组织固定、脱钙和切片
- 立即将组织置于200-300mL的10%缓冲福尔马林（甲醛）中，以使组织完全浸没。将组织在室温下在甲醛中放置至少72小时，每天更换溶液。将组织存放在气密容器中，并在通风橱下进行溶液更换，同时穿戴适当的PPE以防止病毒传播。
注意：在72小时固定期之后，标本不再需要被认为是传染性的。 - 使用带有双金刚石锯片的精密显微镜锯将每个标本切割成三个“厚”部分，以便更快地进行组织脱钙。将双金刚石锯片设置在5毫米的距离，使颞骨的中心部分厚5毫米。确保两端的组织切片有3-5毫米厚。
- 将厚切片置于室温下200-300 mL的23%w / w甲酸脱钙溶液中7-10天，直到组织足够柔软以进行石蜡包埋。每天更改解决方案。通过触诊标本检查组织脱钙是否充分，标本应感觉柔软。
注意：脱钙也可以通过X射线验证。 - 将标本放入流水龙头下方的大烧杯中，在自来水中冲洗24小时。
- 使组织在浓度增加的一系列醇中脱水7。将组织浸没在100-200mL 70%乙醇中1.5小时，然后分别在95%和100%乙醇中洗涤三次，每次1.5小时。接下来，在二甲苯中洗涤组织3×1.5小时。
- 将厚切片浸入石蜡中，每次处理45分钟。
- 使用冷冻切片机切割薄（10μm）切片。定位组织，使组织在轴向平面上被切割。如果需要，切割较厚（20 μm）的部分。
3. 免疫组化和成像
- 如果需要传统的苏木精和曙红染色（此处未描述），请在将切片安装到载玻片7之前进行染色。
- 将部分安装在带正电荷的载玻片上。
- 将载玻片在60°C的热板上烘烤20分钟。
- 将载玻片放入支架中，并将其浸没在含有有机溶剂（在本例中为二乙醇胺）和乙醇的商业预处理溶液中，以脱蜡，再水合和揭开组织。
注意：此步骤对于福尔马林固定和石蜡包埋组织的免疫组化获得满意的结果是必要的。 - 在高压锅中用高压加热载玻片20分钟。
- 将载玻片置于加湿室中，并用商业封闭溶液阻断组织。
- 用针对血管紧张素转换酶 2 （ACE2; 1：50）、跨膜蛋白酶丝氨酸 2 （TMPRSS2， 1：1，000） 和 Furin 蛋白酶 （1：250） 的一抗探测组织切片。
注意：使用ACE2，TMPRSS2和Furin抗体是因为这些蛋白质被认为在SARS-CoV-2传染性11，12中起作用，并且该协议试图研究SARS-CoV-2可能感染中耳13的可能机制。 - 用HRP偶联抗兔二抗（ACE2，弗林;1：100稀释）或抗山羊（TMPRSS2，1：100稀释）二抗治疗。
- 用70%的苏木精在水中复染载玻片。
- 使用安装的数码相机在光学显微镜上获取图像。分别以20x和10x放大倍率获得中耳粘膜和咽鼓管的图像。
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Representative Results
中耳粘膜和咽鼓管的苏木精和曙红染色显示处理后中耳粘膜和粘膜下中耳组织保存（图1）。免疫组化图像显示ACE2，TMPRSS2和Furiin蛋白在中耳粘膜和咽鼓管内的表达（图1）。这些蛋白质在中耳内的存在提供了一条可能的途径，通过该途径SARS-CoV-2可能感染中耳内的呼吸道上皮11，12，13。此外，这些蛋白质在咽鼓管内的表达可以解释病毒进入中耳的途径，通过咽鼓管从鼻咽部传播到中耳。
图1：染色的中耳组织示例。 该图显示了中耳粘膜（顶行，20倍放大倍率）和咽鼓管（底行，10倍放大率）的苏木精和曙红，ACE2，TMPRSS2和呋喃染色。比例尺 = 50 μm （顶行）;100 微米（底行）。缩写：H&E = 苏木精和曙红;血管紧张素转换酶2;TMPRSS2 = 跨膜蛋白酶，丝氨酸2。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
人类颞骨研究对于研究内耳和中耳病理学至关重要，但仍然是一项时间和资源密集型工作。本文介绍了一种使用金刚石显微镜锯生成厚颞骨切片的技术，这些切片可以在进一步切片之前快速脱钙，从而将从组织收获到研究的时间从9-10个月减少到10-14天。该技术可以减少颞骨处理所需的资源，并促进时间敏感型研究，例如与COVID-19中耳和内耳病理学13相关的研究，这是开发该协议的动机。该协议允许在中耳和咽鼓管内可视化ACE2，TMPRS22和Furin表达，从而提供了一种可能的机制，通过该机制，SARS-CoV-2可能通过咽喉通过咽鼓管扩散来感染中耳。
该协议的主要创新是使用钻石锯在脱钙之前切割组织，这会产生“厚”的颞骨切片，这些部分可以通过增加暴露于脱钙剂的组织的表面积来快速脱钙。该步骤允许在7-10天内进行组织脱钙，而不是传统方案可能需要的1-2个月脱钙。用金刚石锯形成的“厚”组织切片也可能比标准颞骨组织块更快地脱水，从而减少脱钙和包埋之间的时间。此外，该方案利用石蜡作为包埋剂而不是细胞苷，细胞苷需要大约3个月才能硬化7。虽然细胞苷提供卓越的人工耳蜗结构保存，但石蜡硬化更快，并促进免疫染色。通过这些修改，颞骨组织可以在10-14天内处理，而不是更传统的处理策略所需的9-10个月7，9。
此协议有几个限制。在包埋之前用金刚石锯切割组织可能会损坏 Corti （OOC） 的器官。在该技术的发展过程中，OOC在大多数标本中严重受损，这可能会限制该技术用于研究诸如年龄相关听力损失等病理的价值，其中保存内耳的微妙结构至关重要。可以对标本进行定位，使金刚石锯不会直接切穿耳囊骨并保留内耳结构，但这仍然是一个积极研究的领域。动物模型可能提供一种有价值的工具，以进一步完善该协议，并增加在这些有价值的人类标本中保存内耳结构的机会。该方案中的组织质量还受到使用石蜡包埋剂的限制，该剂是由于时间限制而选择的。细胞蛋白包埋可以更好地维持耳病理学标本中的细胞完整性，但需要数月才能硬化7。最后，该协议仍需要大量的时间和资源投资。使用金刚石显微锯是传统颞骨制备所需材料的额外费用，脱钙所需的7-10天仍然很长。将来，可以将这些方法与微波辅助脱钙14 相结合，以进一步缩短处理所需的时间。
尽管有其局限性，但这里描述的高速颞骨处理方案为研究中耳以及潜在的内耳病理学提供了另一种工具。该技术在COVID-19大流行期间非常有用，并且还可以通过减少组织处理所需的时间和劳动力来降低与维持活跃的颞骨实验室相关的成本。颞骨研究在美国的受欢迎程度有所下降，从1980年代的28个活跃实验室减少到目前只有4个活跃的实验室4个。颞骨实验室数量的下降可能与收获和加工颞骨相关的重大成本有关 4，8。因此，重要的是，我们的目标是开发技术，以减少颞骨加工所需的资源，以及允许在新环境（如COVID-19大流行）下研究颞骨病理学的技术。此外，高速组织处理，例如本方案中概述的，可能有助于使用新的生物学技术（例如，免疫组化，转录组学），从而允许在分子水平上评估中耳和内耳病理学15，16，17，18，19。.在利用分子技术研究耳科疾病中的人体组织方面，我们几乎没有触及表面，它们可能提供了动物模型无法提供的重要见解。
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Disclosures
作者没有利益冲突需要声明。
Acknowledgments
我们感谢穆罕默德·莱哈尔对这个项目的协助。这项工作得到了美国国立卫生研究院（T32DC000027，NSA）的部分支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-ACE-2 Antibody (1:50 applied dilution) | Novus Biologicals | SN0754 | |
| Anti-Furin Antibody (1:250 dilution) | Abcam | EPR 14674 | |
| Anti-TMPRSS2 Antibody (1:1,000 dilution) | Novus Biologicals | NBP1-20984 | |
| BX43 Manual System Microscope | Olympus Life Science Solutions | ||
| CBN/Diamond Hybrid Wafering Blade | Pace Technologies | WB-007GP | |
| Collin Mallet - 8'' | Surgical Mart | SM1517 | |
| DS-Fi3 Microscope Camera | Nikon | ||
| Dual Endogenous Enzyme Block (commercial blocking solution) | Dako | S2003 | |
| Eaosin Stain | Sigma-Aldrich | 548-24-3 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Formical-4 Decalcifier (formic acid decalcifying solution) | StatLab | 1214-1 GAL | |
| Hematoxylin Stain | Sigma-Aldrich | H9627 | |
| HRP-Conjugated Anti-Rabbit Secondary Antibody (1:100 dilution) | Leica Biosystems | PV6119 | |
| ImmPRESS HRP Horse Anti-Goat igG Detection Kit, Peroxidase (1:100 dilution) | Vector Laboratories | MP-7405 | |
| Lambotte Osteotome | Surgical Mart | SM1553 | |
| Metallographic PICO 155P Precision Saw | Pace Technologies | PICO 155P | microsaw |
| NIS Elements Software Version 4.6 | Nikon | ||
| Paraplast Plus | Sigma-Aldrich | P3683 | paraffin |
| Positive Charged Microscope Slides with White Frosted End | Walter Products | 1140B15 | |
| Thermo Shandon Crytome FSE Cryostat Microtome | New Life Scientific Inc. | A78900104 | cryotome |
| Triology Pretreatment Solution (commercial pretreatment solution) | Sigma-Aldrich | 920P-05 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 920P-05 |
References
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