Summary
この記事では、ツインダイヤモンドブレードを備えたマイクロソーを使用して薄いスライスを生成し、迅速な脱灰と時間的骨免疫組織化学の分析を行う、迅速なヒト側頭骨切片化の技術について説明します。
Abstract
ヒト側頭骨切片の組織病理学的解析は、内耳および中耳の病理学を研究するための基本的な技術である。側頭骨切片は、死後側頭骨収穫、固定、脱灰、包埋、および染色によって調製される。側頭骨の密度のために、脱灰は時間がかかり、資源集約的なプロセスである。完全な組織調製には、平均して9〜10ヶ月かかることがあります。これは、耳病理学研究を遅らせ、COVID-19パンデミックに関連するような時間に敏感な研究を妨げます。この論文では、組織処理を高速化するために、側頭骨切片の迅速な調製および脱灰のための技術について述べる。
側頭骨を標準的な技術を用いて死後に採取し、10%ホルマリンで固定した。ツインダイヤモンドブレードを備えた精密マイクロソーを使用して、各セクションを3つの厚いセクションに切断しました。次いで、厚い側頭骨切片を脱灰溶液中で7〜10日間脱灰してからパラフィンに包埋し、凍結トームを用いて薄い(10μm)切片に切片化し、荷電していないスライドに取り付けた。次いで、組織サンプルを脱パラフィン処理し、抗体染色のために再水和し(ACE2、TMPRSS2、フューリン)、画像化した。この技術により、収穫から組織分析までの時間が9〜10ヶ月から10〜14日に短縮されました。高速の側頭骨切片化は、COVID-19に関連するような時間に敏感な研究を促進しながら、耳病理研究のスピードを高め、組織調製に必要なリソースを減らす可能性があります。
Introduction
人間の側頭骨研究は、内耳と中耳の病理学と病態生理学を研究するための非常に貴重なリソースを提供します。19世紀以前は、耳鼻咽喉科疾患1,2,3についてはほとんど知られていなかった。耳鼻咽喉科疾患をよりよく理解し、「うんざりの手から聴覚手術を救う」ために、ジョセフ・トインビー(1815-1866)は、人間の側頭骨の組織学的切片を研究する方法を開発しました3。この研究は、19世紀の残りの期間にウィーンのアダム・ポリッツァー(1835-1920)とヨーロッパ中の他の人々によって促進され、彼らは側頭骨セクションを使用して耳に影響を与える多くの一般的な状態の組織病理学を記述しました2,3,4。
米国で最初のヒト側頭骨研究所は、1927年にジョンズホプキンス病院に開設され、ステイシーギルド(1890-1966)が側頭骨切片化の方法を開発しました5,6。ギルドが開発した方法は、死後の収穫、固定、硝酸中の脱灰、エタノール中の脱水、セロイジン埋め込み、切片化、染色、および取り付けを含む9〜10ヶ月のプロセスで構成されていました。この技術への修正は後にハロルド・シュクネヒト(1917-1996)によって行われました7;ただし、このプロセスの基本コンポーネントは基本的に変更されません。
側頭骨検査室を維持するために必要な重要なリソースは、側頭骨研究の課題を提示し、おそらく過去30年間でその人気の低下に貢献しています4,8。側頭骨検査室のリソースの大部分は、側頭骨準備の9-10ヶ月のプロセスに捧げられなければなりません。準備の最も時間のかかるステップの1つは、人体で最も密度の高い骨である側頭骨の脱灰です。脱灰は、典型的には硝酸またはエチレンジアミン四酢酸(EDTA)中で行われ、溶液7,9の頻繁な交換を必要としながら数週間から数ヶ月かかる。さらに、COVID-19パンデミックに関連するものなど、人間の耳の時間に敏感な研究は、この遅い準備プロセスによって妨げられる可能性があります。この論文では、ダイヤモンドマイクロソーを使用して厚い切片を生成し、時間的骨収穫から10〜14日以内に迅速な脱灰と組織分析を可能にする高速側頭骨切片化の技術について説明します。
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Protocol
このプロトコルは、IRB(IRB00250002)の承認を得て、ヒト組織および感染性物質の使用に関する制度的方針に従って開発されました。各時間的骨ドナーは、死亡前に書面による同意を提供したか、またはドナーの家族から死後に同意を得た。このプロトコルで使用されるすべての材料、機器、およびソフトウェアの詳細については、 材料の表 を参照してください。
1. 時間的骨収穫
- このプロトコルを利用する前に、地元の治験審査委員会(IRB)理事会の承認を取得し、ヒトおよび感染性物質の使用に関する制度方針をレビューし、組織提供の同意を得る。
- COVID-19陽性の側頭骨ドナーの組織を扱う前に、適切な個人用保護具(PPE)を着用してください。PPE が N-95 呼吸用保護具とフェイスシールド (または陽圧空気浄化システム)、ガウン、および 2 組の手袋で構成されていることを確認します。このプロトコル10 を開始する前に、PPE を適切に着用およびドフするための手法を確認してください。
- ドナーの死亡から12〜24時間以内に側頭骨組織を採取する。遺体が冷蔵されていない場合は、収穫が死後8時間以内に行われることを確認してください。
- 剖検時に側頭骨を採取し、骨切り7による4切開・ブロック法を用いた。
- 開頭術後、脳を摘出し、脳神経を内耳道に鋭く分割します。
- 骨切り術を側頭骨の扁平上皮部分と平行に、そしてちょうど内側に骨切り込みを入れます。
- 側頭骨の内側境界で第1の骨に平行な第2の骨切開を行う。
- 次に、3回目の切開を3〜4cm前部にしてペトロス隆起部と平行にする。
- 4番目の切開部を3番目の切り込みにほぼ平行にし、ペトロス隆起の後方2cmにします。
注:すべての切開部が頭蓋骨基部を通っていることを確認してください。 - 次いで、鋭利な郭清を用いて側頭骨を除去し、標本の下縁に沿った軟部組織付着部を解放する。エンバーミングが側頭骨収穫後に行われる場合は、頸動脈の切り株を結びます。
- 剖検時に側頭骨を採取し、骨切り7による4切開・ブロック法を用いた。
2. 組織固定、脱灰、切片化
- 組織が完全に水没するように、直ちに組織を10%緩衝ホルマリン(ホルムアルデヒド)の200〜300mLに入れる。組織をホルムアルデヒド中に室温で最低72時間放置し、溶液を毎日交換する。組織を気密容器に保管し、ウイルスの拡散を防ぐために適切なPPEを着用しながらヒュームフードの下で溶液交換を行います。
注:72時間の固定期間の後、検体はもはや感染性であると考える必要はありません。 - ツインダイヤモンドブレードを備えた精密マイクロソーを使用して、各標本を3つの「厚い」セクションに切断し、より迅速な組織脱灰を可能にします。ツインダイヤモンドブレードを5mmの距離に設定し、側頭骨の中央部が厚さ5mmになるようにします。両端の組織の切片が3〜5mmの厚さであることを確認する。
- 厚い切片を200〜300mLの23%w/wギ酸脱灰液に入れ、組織がパラフィン包埋に十分柔らかくなるまで、室温で7〜10日間置きます。ソリューションを毎日変更します。柔らかく感じるはずの標本を触診することによって、適切な組織脱灰をチェックする。
メモ:脱灰はX線でも確認できます。 - 流水道水で標本を24時間すすぎ、走っている蛇口の下の大きなビーカーに入れます。
- 増加濃度7の一連のアルコールで組織を脱水する。組織を100〜200mLの70%エタノールに1.5時間浸し、続いてそれぞれ95%エタノールと100%エタノールでそれぞれ1.5時間3回洗浄する。次に、組織をキシレンで3 x 1.5時間洗浄する。
- 厚い切片をパラフィンに埋め込み、それぞれ45分の4回の処置を行う。
- クライオトームを使用して、薄い(10 μm)切片を切断します。組織が軸平面で切断されるように組織を配置します。必要に応じて、より厚い(20μm)切片を切断します。
3. 免疫組織化学とイメージング
- 伝統的なヘマトキシリンおよびエオジン染色が望まれる場合(ここでは記載されていない)、スライドガラス7に切片を取り付ける前に染色を行う。
- 正に帯電したスライドガラスにセクションを取り付けます。
- スライドを60°Cのホットプレートで20分間焼く。
- スライドをホルダーに入れ、有機溶媒(この場合はジエタノールアミン)とエタノールを含む市販の前処理溶液に沈めて、組織を脱パラフィン化、再水和、およびマスク解除します。
注:このステップは、ホルマリン固定組織およびパラフィン包埋組織の免疫組織化学で満足のいく結果を達成するために必要です。 - スライドを圧力鍋で高圧で20分間加熱する。
- スライドを加湿チャンバーに入れ、市販のブロッキング溶液で組織をブロックします。
- アンジオテンシン変換酵素2に対する一次抗体(ACE2;1:50)、膜貫通プロテアーゼセリン2(TMPRSS2、1:1,000)、およびフューリンプロテアーゼ(1:250)で組織切片をプローブする。
注:ACE2、TMPRSS2、およびFurin抗体が使用されるのは、これらのタンパク質がSARS-CoV-2感染力11,12において役割を果たすと考えられており、このプロトコルは、SARS-CoV-2が中耳13に感染する可能性のあるメカニズムを調査しようとしたためです。 - HRP結合抗ウサギ二次抗体(ACE2、フューリン;1:100希釈)または抗ヤギ(TMPRSS2、1:100希釈)二次抗体で治療する。
- 水中の70%ヘマトキシリンでスライドを対比染色する。
- デジタルカメラを装着した光学顕微鏡で画像を取得します。中耳粘膜および耳管の画像をそれぞれ倍率20倍および10倍で取得する。
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Representative Results
中耳粘膜および耳管のヘマトキシリンおよびエオジン染色は、以下の処理で中耳粘膜および中耳下組織の保存を示した(図1)。免疫組織化学的画像は、中耳粘膜および耳管内でのACE2、TMPRSS2、およびFurinタンパク質の発現を示した(図1)。中耳内のこれらのタンパク質の存在は、SARS−CoV−2が中耳内の呼吸上皮に感染し得る経路を提供する11、12、13。さらに、耳管内でのこれらのタンパク質の発現は、ウイルスが中耳に入り、耳咽頭から耳管を通って中耳に移動する経路を説明することができる。
図1:染色された中耳組織の例。 図は、中耳粘膜のヘマトキシリンおよびエオジン、ACE2、TMPRSS2、およびフューリン染色(上段、倍率20倍)および耳管(下段、倍率10倍)を示す。スケールバー = 50 μm (一番上の行);100 μm (下段)。略語:H&E =ヘマトキシリンおよびエオジン;アンジオテンシン変換酵素2;TMPRSS2=膜貫通プロテアーゼ、セリン2。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
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Discussion
ヒト側頭骨研究は、内耳および中耳の病理学を研究するために不可欠ですが、時間とリソースを大量に消費する努力のままです。この論文では、ダイヤモンドマイクロソーを使用して、組織の収穫から研究までの時間を9〜10ヶ月から10〜14日に短縮できるように、さらなる切片化の前に急速に脱灰することができる厚い側頭骨切片を生成する技術について説明します。この技術は、時間的骨処理に必要なリソースを削減し、このプロトコルを開発する動機となったCOVID-19中耳および内耳病理13に関連するものなど、時間に敏感な研究を促進する可能性があります。このプロトコルは、中耳および耳管内のACE2、TMPRS22、およびFurin発現の可視化を可能にし、SARS-CoV-2が耳咽頭から耳管を介して広がることによって中耳に感染する可能性のあるメカニズムを提供する。
このプロトコルの主な革新は、脱灰剤に曝される組織の表面積を増加させることによって急速に脱灰され得る側頭骨の「厚い」切片を生成する脱灰前に組織を切断するダイヤモンドのこぎりの使用である。このステップにより、従来のプロトコルが脱灰に必要とする1〜2ヶ月ではなく、7〜10日以内に組織脱灰が起こることを可能にする。ダイヤモンドソーで作成された組織の「厚い」切片は、側頭骨組織の標準的なブロックよりも迅速に脱水することができ、それによって脱灰と埋め込みの間の時間を短縮することができる。さらに、このプロトコルは、セロイジンではなくパラフィンを包埋剤として利用しており、硬化に約3ヶ月を要する7。セロイジンは蝸牛構造の優れた保存を提供しますが、パラフィンははるかに迅速に硬化し、免疫染色を容易にします。これらの修飾により、側頭骨組織は、より伝統的な処理戦略7,9で必要とされる9〜10ヶ月とは対照的に、10〜14日で処理することができる。
このプロトコルにはいくつかの制限があります。埋め込む前にダイヤモンドのこぎりで組織を切断すると、コルティ(OOC)の臓器が損傷する危険性があります。OOCは、この技術の開発中にほとんどの標本でひどく損傷を受けており、内耳の繊細な構造を保存することが不可欠な加齢性難聴などの病状を研究するためのこの技術の価値を制限する可能性があります。ダイヤモンドのこぎりが耳嚢骨を直接切断せず、内耳の構造を保持するように標本を配置することは可能ですが、これは依然として積極的な調査の領域です。動物モデルは、このプロトコルをさらに洗練させ、これらの貴重なヒト標本の内耳構造を保存する機会を増やすための貴重なツールを提供する可能性があります。このプロトコールにおける組織品質は、時間の制約のために選択されたパラフィン包埋剤の使用によってさらに制限される。セロイジン包埋は、耳鼻咽喉科標本中の細胞完全性をよりよく維持するが、硬化するのに数ヶ月かかる7。最後に、このプロトコルには依然として多大な時間とリソースの投資が必要です。ダイヤモンドマイクロソーの使用は、従来の側頭骨調製に必要な材料への追加コストであり、脱灰に必要な7〜10日はまだ長いです。将来的には、これらの方法をマイクロ波支援脱灰14 と組み合わせて、処理に要する時間をさらに短縮することが可能かもしれない。
その制限にもかかわらず、ここで説明する高速時間的骨処理のためのプロトコルは、中耳、そして潜在的に内耳の病理学を研究するための別のツールを提供する。この技術は、COVID-19パンデミック中に有用であり、組織処理に必要な時間と労力を削減することにより、アクティブな側頭骨検査室の維持に関連するコストを削減する可能性もあります。時間的骨研究は米国内で人気が下がっており、1980年代の28のアクティブな研究室から現在4つのアクティブな研究室に減少しています。この操作側頭骨検査室の数の減少は、側頭骨の採取および処理に関連する重要なコストに関連し得る4,8。したがって、時間的骨処理に必要なリソースを削減する技術と、COVID-19パンデミックなどの新しい状況での側頭骨病理学の研究を可能にする技術の開発を目指すことが重要です。さらに、このプロトコールに概説されているような高速組織プロセシングは、分子レベルでの中耳および内耳病理の評価を可能にする新しい生物学的技術(例えば、免疫組織化学、トランスクリプトミクス)の使用を支援し得る15、16、17、18、19.分子技術を活用して耳疾患のヒト組織を研究するという点で、私たちはかろうじて表面を傷つけてきましたが、それらは動物モデルでは提供できない重要な洞察を提供するかもしれません。
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Disclosures
著者は、宣言する利益相反を持っていません。
Acknowledgments
我々は、このプロジェクトに対するモハメド・レハールの支援に感謝する。この研究は、国立衛生研究所(T32DC000027、NSA)によって部分的に支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-ACE-2 Antibody (1:50 applied dilution) | Novus Biologicals | SN0754 | |
| Anti-Furin Antibody (1:250 dilution) | Abcam | EPR 14674 | |
| Anti-TMPRSS2 Antibody (1:1,000 dilution) | Novus Biologicals | NBP1-20984 | |
| BX43 Manual System Microscope | Olympus Life Science Solutions | ||
| CBN/Diamond Hybrid Wafering Blade | Pace Technologies | WB-007GP | |
| Collin Mallet - 8'' | Surgical Mart | SM1517 | |
| DS-Fi3 Microscope Camera | Nikon | ||
| Dual Endogenous Enzyme Block (commercial blocking solution) | Dako | S2003 | |
| Eaosin Stain | Sigma-Aldrich | 548-24-3 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Formical-4 Decalcifier (formic acid decalcifying solution) | StatLab | 1214-1 GAL | |
| Hematoxylin Stain | Sigma-Aldrich | H9627 | |
| HRP-Conjugated Anti-Rabbit Secondary Antibody (1:100 dilution) | Leica Biosystems | PV6119 | |
| ImmPRESS HRP Horse Anti-Goat igG Detection Kit, Peroxidase (1:100 dilution) | Vector Laboratories | MP-7405 | |
| Lambotte Osteotome | Surgical Mart | SM1553 | |
| Metallographic PICO 155P Precision Saw | Pace Technologies | PICO 155P | microsaw |
| NIS Elements Software Version 4.6 | Nikon | ||
| Paraplast Plus | Sigma-Aldrich | P3683 | paraffin |
| Positive Charged Microscope Slides with White Frosted End | Walter Products | 1140B15 | |
| Thermo Shandon Crytome FSE Cryostat Microtome | New Life Scientific Inc. | A78900104 | cryotome |
| Triology Pretreatment Solution (commercial pretreatment solution) | Sigma-Aldrich | 920P-05 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 920P-05 |
References
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