Summary
Este artículo describe una técnica para la seccionamiento rápido del hueso temporal humano que utiliza una microsierra con cuchillas de diamante gemelas para generar rodajas delgadas para la descalcificación rápida y el análisis de la inmunohistoquímica del hueso temporal.
Abstract
El análisis histopatológico de las secciones del hueso temporal humano es una técnica fundamental para el estudio de la patología del oído interno y medio. Las secciones de hueso temporal se preparan mediante la extracción de hueso temporal postmortem, fijación, descalcificación, incrustación y tinción. Debido a la densidad del hueso temporal, la descalcificación es un proceso lento y que requiere muchos recursos; La preparación completa del tejido puede tomar de 9 a 10 meses en promedio. Esto ralentiza la investigación de la otopatología y dificulta los estudios sensibles al tiempo, como los relevantes para la pandemia de COVID-19. Este artículo describe una técnica para la preparación rápida y la descalcificación de las secciones del hueso temporal para acelerar el procesamiento de los tejidos.
Los huesos temporales se cosecharon post mortem utilizando técnicas estándar y se fijaron en formalina al 10%. Se utilizó una microsierra de precisión con cuchillas de diamante gemelas para cortar cada sección en tres secciones gruesas. Las secciones gruesas del hueso temporal se descalcificaron en solución descalcificante durante 7-10 días antes de incrustarse en parafina, se seccionaron en secciones delgadas (10 μm) con un criotoma y se montaron en portaobjetos sin carga. Las muestras de tejido se desparafinaron y rehidrataron para la tinción de anticuerpos (ACE2, TMPRSS2, Furin) y se tomaron imágenes. Esta técnica redujo el tiempo desde la cosecha hasta el análisis de tejidos de 9-10 meses a 10-14 días. La seccionamiento del hueso temporal de alta velocidad puede aumentar la velocidad de la investigación de la otopatología y reducir los recursos necesarios para la preparación de tejidos, al tiempo que facilita estudios sensibles al tiempo como los relacionados con COVID-19.
Introduction
La investigación del hueso temporal humano proporciona un recurso invaluable para estudiar la patología y la fisiopatología del oído interno y medio. Antes del siglo 19, poco se sabía con respecto a la enfermedad otológica 1,2,3. Para comprender mejor la enfermedad otológica y "rescatar la cirugía auditiva de las manos de los charlatanes", Joseph Toynbee (1815-1866) desarrolló métodos para estudiar secciones histológicas del hueso temporal humano3. Este trabajo fue promovido por Adam Politzer (1835-1920) en Viena y otros en toda Europa durante el resto del siglo XIX, quien utilizó secciones de hueso temporal para describir la histopatología de muchas afecciones comunes que afectan el oído 2,3,4.
El primer laboratorio de hueso temporal humano en los Estados Unidos se abrió en 1927 en el Hospital Johns Hopkins, donde Stacy Guild (1890-1966) desarrolló métodos para la seccionamiento del hueso temporal 5,6. Los métodos desarrollados por Guild consistieron en un proceso de 9-10 meses que incluyó la cosecha postmortem, fijación, descalcificación en ácido nítrico, deshidratación en etanol, incrustación de celoidina, seccionamiento, tinción y montaje. Las modificaciones a esta técnica fueron hechas más tarde por Harold Schuknecht (1917-1996)7; sin embargo, los componentes básicos de este proceso permanecen esencialmente sin cambios.
Los importantes recursos necesarios para mantener un laboratorio de huesos temporales han presentado un desafío para la investigación de huesos temporales y probablemente han contribuido a su disminución de popularidad en los últimos 30 años 4,8. Una parte significativa de los recursos de laboratorio de hueso temporal debe dedicarse al proceso de 9-10 meses de preparación del hueso temporal. Uno de los pasos más lentos en la preparación es la descalcificación del hueso temporal, que es el hueso más denso del cuerpo humano. La descalcificación se realiza típicamente en ácido nítrico o ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y toma semanas o meses mientras requiere el cambio frecuente de soluciones 7,9. Además, los estudios sensibles al tiempo del oído humano, como los relacionados con la pandemia de COVID-19, pueden verse obstaculizados por este lento proceso de preparación. Este artículo describe una técnica para la seccionamiento óseo temporal de alta velocidad que utiliza una microsierra de diamante para generar secciones gruesas que permiten una rápida descalcificación y análisis de tejidos dentro de los 10-14 días posteriores a la cosecha temporal de huesos.
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Protocol
Este protocolo fue desarrollado con la aprobación del IRB (IRB00250002) y de acuerdo con las políticas institucionales para el uso de tejidos humanos y material infeccioso. Cada donante de hueso temporal proporcionó su consentimiento por escrito antes de la muerte, o el consentimiento se obtuvo póstumamente de la familia del donante. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre todos los materiales, equipos y software utilizados en este protocolo.
1. Cosecha temporal de huesos
- Obtener la aprobación de la junta de revisión institucional local (IRB), revisar las políticas institucionales para el uso de material humano e infeccioso, y obtener el consentimiento para la donación de tejidos antes de utilizar este protocolo.
- Póngase el equipo de protección personal (EPP) adecuado antes de trabajar con tejido de donantes de hueso temporal positivos para COVID-19. Asegúrese de que el EPP consista en un respirador N-95 y un protector facial (o alternativamente un sistema de purificación de aire a presión positiva), bata y dos pares de guantes. Revise las técnicas para ponerse y quitarse correctamente el EPP antes de comenzar este protocolo10.
- Recolecte tejido óseo temporal dentro de las 12-24 h posteriores a la muerte del donante. Si el cuerpo no está refrigerado, asegúrese de que la cosecha ocurra dentro de las 8 h posteriores a la muerte.
- Recolecte huesos temporales durante la autopsia utilizando el método de bloqueo de cuatro incisiones mediante osteotomo7.
- Después de la craneotomía, retire el cerebro y divida los nervios craneales en el canal auditivo interno bruscamente.
- Haga la primera incisión ósea con el osteotomo paralelo y solo medial a la porción escamosa del hueso temporal.
- Realice la segunda incisión ósea paralela a la primera en el borde medial del hueso temporal.
- Luego, haga la tercera incisión 3-4 cm anterior y paralela a la cresta petrosa.
- Haga la cuarta incisión aproximadamente paralela a la tercera, 2 cm posterior a la cresta petrosa.
NOTA: Asegúrese de que todas las incisiones se extiendan a través de la base del cráneo. - Luego, retire el hueso temporal usando una disección aguda para liberar la unión de tejido blando a lo largo del borde inferior de la muestra. Si el embalsamamiento se va a realizar después de la cosecha temporal del hueso, ate el muñón de la arteria carótida.
- Recolecte huesos temporales durante la autopsia utilizando el método de bloqueo de cuatro incisiones mediante osteotomo7.
2. Fijación, descalcificación y seccionamiento de tejidos
- Coloque inmediatamente el tejido en 200-300 ml de formalina tamponada al 10% (formaldehído) para que el tejido esté completamente sumergido. Dejar el tejido en formaldehído durante un mínimo de 72 h a temperatura ambiente, cambiando las soluciones diariamente. Guarde el pañuelo en un recipiente hermético y realice cambios de solución debajo de una campana de humos mientras usa el EPP adecuado para evitar la propagación del virus.
NOTA: Después del período de fijación de 72 h, los especímenes ya no necesitan ser considerados infecciosos. - Use una microsierra de precisión con cuchillas de diamante gemelas para cortar cada muestra en tres secciones "gruesas" para permitir una descalcificación de tejidos más rápida. Ajuste las cuchillas de diamante gemelas a una distancia de 5 mm, de modo que la sección central del hueso temporal tenga un grosor de 5 mm. Asegúrese de que las secciones de tejido en cada extremo tengan un grosor de 3-5 mm.
- Coloque las secciones gruesas en 200-300 ml de solución descalcificante de ácido fórmico al 23% p/p durante 7-10 días a temperatura ambiente, hasta que el tejido esté lo suficientemente blando como para incrustar parafina. Cambie las soluciones diariamente. Verifique la descalcificación adecuada del tejido palpando la muestra, que debe sentirse suave.
NOTA: La descalcificación también se puede verificar mediante rayos X. - Enjuague las muestras en agua corriente del grifo durante 24 horas colocándolas en un vaso de precipitados grande debajo de un grifo corriente.
- Deshidratar el tejido en una serie de alcoholes de concentración creciente7. Sumergir el tejido en 100-200 ml de etanol al 70% durante 1,5 h, seguido de tres lavados en 95% y 100% etanol durante 1,5 h cada uno, respectivamente. A continuación, lavar el pañuelo 3 x 1,5 h en xileno.
- Incrustar las secciones gruesas en parafina, con cuatro tratamientos de 45 min cada uno.
- Use un criotoma para cortar secciones delgadas (10 μm). Coloque el tejido de manera que el tejido se corte en el plano axial. Corte secciones más gruesas (20 μm) si lo desea.
3. Inmunohistoquímica e imágenes
- Si se desea la tinción tradicional de hematoxilina y eosina (no descrita aquí), realice la tinción antes de montar las secciones en portaobjetosde vidrio 7.
- Monte las secciones en diapositivas de vidrio cargadas positivamente.
- Hornea los portaobjetos en una placa caliente a 60 °C durante 20 min.
- Coloque los portaobjetos en un soporte y sumérjalos en una solución comercial de pretratamiento que contenga un disolvente orgánico (dietanolamina en este caso) y etanol para desparafinar, rehidratar y desenmascarar el tejido.
NOTA: Este paso es necesario para lograr resultados satisfactorios con inmunohistoquímica para tejido fijado en formalina e incrustado en parafina. - Calentar los portaobjetos en una olla a presión a alta presión durante 20 min.
- Coloque los portaobjetos en una cámara humidificada y bloquee el tejido con una solución de bloqueo comercial.
- Sondee las secciones de tejido con el anticuerpo primario contra la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2; 1:50), la serina 2 de la proteasa transmembrana (TMPRSS2, 1:1.000) y la proteasa furina (1:250).
NOTA: Los anticuerpos ACE2, TMPRSS2 y Furin se utilizan porque se cree que estas proteínas desempeñan un papel en la infectividad del SARS-CoV-211,12, y este protocolo buscó investigar los posibles mecanismos por los cuales el SARS-CoV-2 puede infectar el oído medio13. - Tratar con anticuerpo secundario anti-conejo conjugado con HRP (ACE2, Furin; dilución 1:100) o anticuerpo secundario anti-cabra (TMPRSS2, dilución 1:100).
- Contramante los portaobjetos con 70% de hematoxilina en agua.
- Adquiera imágenes en un microscopio de luz con una cámara digital montada. Obtenga imágenes de la mucosa del oído medio y la trompa de Eustaquio a un aumento de 20x y 10x, respectivamente.
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Representative Results
La tinción de hematoxilina y eosina de la mucosa del oído medio y la trompa de Eustaquio mostró la preservación de la mucosa del oído medio y el tejido submucoso del oído medio después del procesamiento (Figura 1). Las imágenes inmunohistoquímicas mostraron la expresión de las proteínas ACE2, TMPRSS2 y Furina dentro de la mucosa del oído medio y la trompa de Eustaquio (Figura 1). La presencia de estas proteínas dentro del oído medio proporciona una posible ruta por la cual el SARS-CoV-2 puede infectar el epitelio respiratorio dentro del oído medio 11,12,13. Además, la expresión de estas proteínas dentro de la trompa de Eustaquio puede explicar una ruta por la cual el virus ingresa al oído medio, viajando al oído medio desde la nasofaringe a través de la trompa de Eustaquio.
Figura 1: Ejemplo de tejido teñido del oído medio. La figura muestra la tinción de hematoxilina y eosina, ACE2, TMPRSS2 y furina de la mucosa del oído medio (fila superior, aumento de 20x) y la trompa de Eustaquio (fila inferior, aumento de 10x). Barras de escala = 50 μm (fila superior); 100 μm (fila inferior). Abreviaturas: H&E = hematoxilina y eosina; enzima convertidora de angiotensina 2; TMPRSS2 = proteasa transmembrana, serina 2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La investigación del hueso temporal humano es fundamental para estudiar la patología del oído interno y medio, pero sigue siendo un esfuerzo que requiere mucho tiempo y recursos. Este artículo describe una técnica que utiliza una microsierra de diamante para generar secciones gruesas de hueso temporal que se pueden descalcificar rápidamente antes de seccionar más, de modo que el tiempo desde la cosecha de tejido hasta el estudio se puede reducir de 9-10 meses a 10-14 días. Esta técnica puede reducir los recursos necesarios para el procesamiento del hueso temporal y facilitar estudios sensibles al tiempo, como los relacionados con la patología del oído medio e interno COVID-1913, que fue la motivación para desarrollar este protocolo. Este protocolo permitió la visualización de la expresión de ACE2, TMPRS22 y Furin dentro del oído medio y la trompa de Eustaquio, proporcionando un mecanismo probable por el cual el SARS-CoV-2 puede infectar el oído medio al propagarse desde la nasofaringe a través de la trompa de Eustaquio.
La principal innovación de este protocolo es el uso de una sierra de diamante que corta el tejido antes de la descalcificación, lo que genera secciones "gruesas" de hueso temporal que pueden descalcificarse rápidamente al aumentar el área de superficie del tejido expuesto al agente descalcificante. Este paso permite que la descalcificación de tejidos ocurra dentro de 7-10 días en lugar de los 1-2 meses que los protocolos tradicionales pueden requerir para la descalcificación. Las secciones "gruesas" de tejido creadas con la sierra de diamante también pueden deshidratarse más rápidamente que un bloque estándar de tejido óseo temporal, reduciendo así el tiempo entre la descalcificación y la incrustación. Además, este protocolo utiliza parafina como agente de incrustación en lugar de celoidina, que tarda aproximadamente 3 meses en endurecerse7. Mientras que la celoidina proporciona una preservación superior de las estructuras cocleares, la parafina se endurece mucho más rápido y facilita la inmunotinción. Con estas modificaciones, el tejido óseo temporal se puede procesar en 10-14 días en comparación con los 9-10 meses requeridos en las estrategias de procesamiento más tradicionales 7,9.
Este protocolo tiene varias limitaciones. Cortar el tejido con la sierra de diamante antes de incrustar corre el riesgo de dañar el órgano de Corti (OOC). El OOC fue severamente dañado en la mayoría de los especímenes durante el desarrollo de esta técnica, lo que puede limitar el valor de esta técnica para el estudio de patologías como la pérdida auditiva relacionada con la edad, donde es vital que se conserven las delicadas estructuras del oído interno. Puede ser posible colocar el espécimen de modo que la sierra de diamante no corte directamente a través del hueso de la cápsula ótica y preserve las estructuras del oído interno, pero esto sigue siendo un área de investigación activa. Los modelos animales pueden proporcionar una herramienta valiosa para refinar aún más este protocolo y aumentar la posibilidad de preservar las estructuras del oído interno en estos valiosos especímenes humanos. La calidad del tejido en este protocolo también está limitada por el uso del agente incrustante de parafina, que se seleccionó debido a limitaciones de tiempo. La incrustación de celoidina mantiene mejor la integridad celular en especímenes otopatológicos, pero tarda meses en endurecerse7. Por último, este protocolo todavía requiere una inversión significativa de tiempo y recursos. El uso de una microsierra de diamante es un costo adicional a los materiales requeridos para la preparación tradicional del hueso temporal, y los 7-10 días requeridos para la descalcificación aún son largos. En el futuro, puede ser posible combinar estos métodos con la descalcificación asistida por microondas14 para acortar aún más el tiempo requerido para el procesamiento.
A pesar de sus limitaciones, el protocolo para el procesamiento del hueso temporal de alta velocidad descrito aquí ofrece otra herramienta para estudiar la patología del oído medio y, potencialmente, del oído interno. Esta técnica ha sido útil durante la pandemia de COVID-19 y también puede reducir los costos asociados con el mantenimiento de un laboratorio de hueso temporal activo al reducir el tiempo y la mano de obra necesarios para el procesamiento de tejidos. La investigación del hueso temporal ha disminuido en popularidad dentro de los Estados Unidos, disminuyendo de 28 laboratorios activos en la década de 1980 a solo 4 laboratorios activos en la actualidad4. Esta disminución en el número de laboratorios de huesos temporales en funcionamiento puede estar relacionada con los costos significativos asociados con la recolección y el procesamiento de huesos temporales 4,8. En consecuencia, es importante que nuestro objetivo sea desarrollar técnicas que reduzcan los recursos necesarios para el procesamiento del hueso temporal y también aquellas que permitan el estudio de la patología del hueso temporal en nuevos contextos, como la pandemia de COVID-19. Además, el procesamiento de tejidos de alta velocidad, como el descrito en este protocolo, puede ayudar al uso de nuevas técnicas biológicas (por ejemplo, inmunohistoquímica, transcriptómica) que permiten la evaluación de la patología del oído medio e interno a nivel molecular 15,16,17,18,19 . Apenas hemos arañado la superficie en términos de utilizar técnicas moleculares para estudiar el tejido humano en enfermedades otológicas, y pueden proporcionar información importante que no puede ser proporcionada por modelos animales.
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Disclosures
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Acknowledgments
Agradecemos a Mohamed Lehar por su ayuda con este proyecto. Este trabajo fue parcialmente apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (T32DC000027, NSA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-ACE-2 Antibody (1:50 applied dilution) | Novus Biologicals | SN0754 | |
| Anti-Furin Antibody (1:250 dilution) | Abcam | EPR 14674 | |
| Anti-TMPRSS2 Antibody (1:1,000 dilution) | Novus Biologicals | NBP1-20984 | |
| BX43 Manual System Microscope | Olympus Life Science Solutions | ||
| CBN/Diamond Hybrid Wafering Blade | Pace Technologies | WB-007GP | |
| Collin Mallet - 8'' | Surgical Mart | SM1517 | |
| DS-Fi3 Microscope Camera | Nikon | ||
| Dual Endogenous Enzyme Block (commercial blocking solution) | Dako | S2003 | |
| Eaosin Stain | Sigma-Aldrich | 548-24-3 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Formical-4 Decalcifier (formic acid decalcifying solution) | StatLab | 1214-1 GAL | |
| Hematoxylin Stain | Sigma-Aldrich | H9627 | |
| HRP-Conjugated Anti-Rabbit Secondary Antibody (1:100 dilution) | Leica Biosystems | PV6119 | |
| ImmPRESS HRP Horse Anti-Goat igG Detection Kit, Peroxidase (1:100 dilution) | Vector Laboratories | MP-7405 | |
| Lambotte Osteotome | Surgical Mart | SM1553 | |
| Metallographic PICO 155P Precision Saw | Pace Technologies | PICO 155P | microsaw |
| NIS Elements Software Version 4.6 | Nikon | ||
| Paraplast Plus | Sigma-Aldrich | P3683 | paraffin |
| Positive Charged Microscope Slides with White Frosted End | Walter Products | 1140B15 | |
| Thermo Shandon Crytome FSE Cryostat Microtome | New Life Scientific Inc. | A78900104 | cryotome |
| Triology Pretreatment Solution (commercial pretreatment solution) | Sigma-Aldrich | 920P-05 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 920P-05 |
References
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