Summary
Questo articolo descrive una tecnica per il sezionamento rapido dell'osso temporale umano che utilizza una microsega con due dischi diamantati per generare fette sottili per una rapida decalcificazione e analisi dell'immunoistochimica ossea temporale.
Abstract
L'analisi istopatologica delle sezioni ossee temporali umane è una tecnica fondamentale per lo studio della patologia dell'orecchio interno e medio. Le sezioni ossee temporali sono preparate mediante raccolta ossea temporale post-mortem, fissazione, decalcificazione, incorporamento e colorazione. A causa della densità dell'osso temporale, la decalcificazione è un processo che richiede tempo e risorse; la preparazione completa dei tessuti può richiedere in media 9-10 mesi. Ciò rallenta la ricerca otopatologica e ostacola gli studi sensibili al fattore tempo, come quelli rilevanti per la pandemia di COVID-19. Questo documento descrive una tecnica per la rapida preparazione e decalcificazione delle sezioni ossee temporali per accelerare l'elaborazione dei tessuti.
Le ossa temporali sono state raccolte post mortem utilizzando tecniche standard e fissate in formalina al 10%. Una microsega di precisione con due lame diamantate è stata utilizzata per tagliare ogni sezione in tre sezioni spesse. Sezioni ossee temporali spesse sono state poi decalcificate in soluzione decalcificante per 7-10 giorni prima di essere incorporate nella paraffina, sezionate in sezioni sottili (10 μm) usando un criotomo e montate su vetrini non caricati. I campioni di tessuto sono stati quindi deparaffinati e reidratati per la colorazione degli anticorpi (ACE2, TMPRSS2, Furin) e ripresi. Questa tecnica ha ridotto il tempo dalla raccolta all'analisi dei tessuti da 9-10 mesi a 10-14 giorni. Il sezionamento osseo temporale ad alta velocità può aumentare la velocità della ricerca otopatologica e ridurre le risorse necessarie per la preparazione dei tessuti, facilitando al contempo studi sensibili al tempo come quelli relativi a COVID-19.
Introduction
La ricerca sull'osso temporale umano fornisce una risorsa inestimabile per studiare la patologia e la fisiopatologia dell'orecchio interno e medio. Prima del 19 ° secolo, si sapeva poco per quanto riguarda la malattiaotologica 1,2,3. Per comprendere meglio la malattia otologica e "salvare la chirurgia uditiva dalle mani dei ciarlatani", Joseph Toynbee (1815-1866) sviluppò metodi per studiare le sezioni istologiche dell'osso temporale umano3. Questo lavoro è stato promosso da Adam Politzer (1835-1920) a Vienna e altri in tutta Europa durante il resto del 19 ° secolo, che ha usato sezioni ossee temporali per descrivere l'istopatologia di molte condizioni comuni che interessano l'orecchio 2,3,4.
Il primo laboratorio di ossa temporali umane negli Stati Uniti fu aperto nel 1927 al Johns Hopkins Hospital, dove Stacy Guild (1890-1966) sviluppò metodi per il sezionamento dell'osso temporale 5,6. I metodi sviluppati da Guild consistevano in un processo di 9-10 mesi che includeva la raccolta post-mortem, la fissazione, la decalcificazione in acido nitrico, la disidratazione in etanolo, l'incorporamento di celloidin, il sezionamento, la colorazione e il montaggio. Le modifiche a questa tecnica furono successivamente apportate da Harold Schuknecht (1917-1996)7; tuttavia, le componenti di base di questo processo rimangono sostanzialmente invariate.
Le risorse significative necessarie per mantenere un laboratorio di osso temporale hanno rappresentato una sfida per la ricerca sull'osso temporale e probabilmente hanno contribuito al declino della sua popolarità negli ultimi 30 anni 4,8. Una parte significativa delle risorse di laboratorio dell'osso temporale deve essere dedicata al processo di 9-10 mesi di preparazione dell'osso temporale. Una delle fasi più dispendiose in termini di tempo nella preparazione è la decalcificazione dell'osso temporale, che è l'osso più denso del corpo umano. La decalcificazione viene tipicamente eseguita in acido nitrico o acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) e richiede settimane o mesi mentre richiede il frequente cambio di soluzioni 7,9. Inoltre, gli studi sensibili al tempo dell'orecchio umano, come quelli relativi alla pandemia di COVID-19, possono essere ostacolati da questo lento processo di preparazione. Questo documento descrive una tecnica per il sezionamento osseo temporale ad alta velocità che utilizza una microsega a diamante per generare sezioni spesse che consentono una rapida decalcificazione e analisi dei tessuti entro 10-14 giorni dalla raccolta dell'osso temporale.
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Protocol
Questo protocollo è stato sviluppato con l'approvazione IRB (IRB00250002) e in conformità con le politiche istituzionali per l'uso di tessuti umani e materiale infettivo. Ogni donatore di ossa temporali ha fornito il consenso scritto prima della morte, o il consenso è stato ottenuto postumo dalla famiglia del donatore. Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli su tutti i materiali, le attrezzature e il software utilizzati in questo protocollo.
1. Raccolta ossea temporale
- Ottenere l'approvazione del consiglio di revisione istituzionale locale (IRB), rivedere le politiche istituzionali per l'uso di materiale umano e infettivo e ottenere il consenso per la donazione di tessuti prima di utilizzare questo protocollo.
- Indossare adeguati dispositivi di protezione individuale (DPI) prima di lavorare con tessuti di donatori di ossa temporali covid-19-positivi. Assicurarsi che il DPI sia costituito da un respiratore N-95 e da una visiera (o in alternativa da un sistema di purificazione dell'aria a pressione positiva), un camice e due paia di guanti. Rivedere le tecniche per indossare e togliere correttamente i DPI prima di iniziare questo protocollo10.
- Raccogliere il tessuto osseo temporale entro 12-24 ore dalla morte del donatore. Se il corpo non è refrigerato, assicurarsi che la raccolta avvenga entro 8 ore dalla morte.
- Raccogliere le ossa temporali durante l'autopsia usando il metodo a quattro incisioni, blocco con osteotoma7.
- Dopo la craniotomia, rimuovere il cervello e dividere bruscamente i nervi cranici nel canale uditivo interno.
- Fare la prima incisione ossea con l'osteotoma parallela e solo mediale alla porzione squamosa dell'osso temporale.
- Eseguire la seconda incisione ossea parallela alla prima sul bordo mediale dell'osso temporale.
- Quindi, fare la terza incisione 3-4 cm anteriore e parallela alla cresta petrosa.
- Fai la quarta incisione approssimativamente parallela alla terza, 2 cm posteriore alla cresta petrosa.
NOTA: Assicurarsi che tutte le incisioni si estendano attraverso la base del cranio. - Quindi, rimuovere l'osso temporale usando una dissezione acuta per liberare l'attaccamento dei tessuti molli lungo il bordo inferiore del campione. Se l'imbalsamazione deve essere eseguita dopo la raccolta dell'osso temporale, legare il moncone dell'arteria carotide.
- Raccogliere le ossa temporali durante l'autopsia usando il metodo a quattro incisioni, blocco con osteotoma7.
2. Fissazione dei tessuti, decalcificazione e sezionamento
- Posizionare immediatamente il tessuto in 200-300 ml di formalina tamponata al 10% (formaldeide) in modo che il tessuto sia completamente sommerso. Lasciare il tessuto in formaldeide per un minimo di 72 ore a temperatura ambiente, cambiando le soluzioni quotidianamente. Conservare il tessuto in un contenitore ermetico ed eseguire cambi di soluzione sotto una cappa aspirante mentre si indossano DPI appropriati per prevenire la diffusione del virus.
NOTA: Dopo il periodo di fissazione di 72 ore, i campioni non devono più essere considerati infettivi. - Utilizzare una microsega di precisione con due lame diamantate per tagliare ogni campione in tre sezioni "spesse" per consentire una più rapida decalcificazione dei tessuti. Impostare i dischi gemelli diamantati a una distanza di 5 mm, in modo che la sezione centrale dell'osso temporale abbia uno spessore di 5 mm. Assicurarsi che le sezioni di tessuto su entrambe le estremità abbiano uno spessore di 3-5 mm.
- Posizionare le sezioni spesse in 200-300 ml di soluzione decalcificante di acido formico al 23% p/p per 7-10 giorni a temperatura ambiente, fino a quando il tessuto è abbastanza morbido per l'incorporamento della paraffina. Cambia le soluzioni ogni giorno. Verificare l'adeguata decalcificazione dei tessuti palpando il campione, che dovrebbe sentirsi morbido.
NOTA: La decalcificazione può anche essere verificata mediante raggi X. - Risciacquare i campioni in acqua corrente del rubinetto per 24 ore posizionandoli in un grande becher sotto un rubinetto in esecuzione.
- Disidratare il tessuto in una serie di alcoli di concentrazione crescente7. Immergere il tessuto in 100-200 ml di etanolo al 70% per 1,5 ore, seguito da tre lavaggi rispettivamente al 95% e al 100% di etanolo per 1,5 ore ciascuno. Quindi, lavare il tessuto 3 x 1,5 ore in xilene.
- Incorporare le sezioni spesse in paraffina, con quattro trattamenti di 45 minuti ciascuno.
- Utilizzare un criotomo per tagliare sezioni sottili (10 μm). Posizionare il tessuto in modo che il tessuto venga tagliato nel piano assiale. Tagliare sezioni più spesse (20 μm) se lo si desidera.
3. Immunoistochimica e imaging
- Se si desidera la colorazione tradizionale di ematossilina ed eosina (non descritta qui), eseguire la colorazione prima di montare le sezioni su vetrini7.
- Montare le sezioni su vetrini caricati positivamente.
- Cuocere i vetrini su una piastra calda a 60 °C per 20 min.
- Posizionare i vetrini in un supporto e immergerli in una soluzione di pretrattamento commerciale contenente un solvente organico (dietanolamina in questo caso) ed etanolo per deparaffinizzare, reidratare e smascherare il tessuto.
NOTA: Questo passaggio è necessario per ottenere risultati soddisfacenti con l'immunoistochimica per tessuti fissati con formalina e paraffina. - Riscaldare i vetrini in una pentola a pressione ad alta pressione per 20 minuti.
- Posizionare i vetrini in una camera umidificata e bloccare il tessuto con una soluzione di blocco commerciale.
- Sondare le sezioni tissutali con l'anticorpo primario contro l'enzima di conversione dell'angiotensina 2 (ACE2; 1:50), la proteasi transmembrana 2 (TMPRSS2, 1:1.000) e la proteasi Furin (1:250).
NOTA: Gli anticorpi ACE2, TMPRSS2 e Furin sono usati perché si ritiene che queste proteine svolgano un ruolo nell'infettività sars-CoV-211,12 e questo protocollo ha cercato di studiare i possibili meccanismi con cui SARS-CoV-2 può infettare l'orecchio medio13. - Trattare con anticorpo secondario anti-coniglio coniugato HRP (ACE2, Furin; diluizione 1:100) o anti-capra (TMPRSS2, diluizione 1:100).
- Controbattere i vetrini con il 70% di ematossilina in acqua.
- Acquisisci immagini su un microscopio ottico con una fotocamera digitale montata. Ottenere immagini della mucosa dell'orecchio medio e della tromba di Eustachio rispettivamente con ingrandimento 20x e 10x.
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Representative Results
La colorazione di ematossilina ed eosina della mucosa dell'orecchio medio e della tromba di Eustachio ha mostrato la conservazione della mucosa dell'orecchio medio e del tessuto dell'orecchio medio sottomucoso dopo l'elaborazione (Figura 1). Le immagini immunoistochimiche hanno mostrato l'espressione delle proteine ACE2, TMPRSS2 e Furin all'interno della mucosa dell'orecchio medio e della tromba di Eustachio (Figura 1). La presenza di queste proteine all'interno dell'orecchio medio fornisce una possibile via attraverso la quale SARS-CoV-2 può infettare l'epitelio respiratorio all'interno dell'orecchio medio 11,12,13. Inoltre, l'espressione di queste proteine all'interno della tromba di Eustachio può spiegare un percorso attraverso il quale il virus entra nell'orecchio medio, viaggiando verso l'orecchio medio dal rinofaringe attraverso la tromba di Eustachio.
Figura 1: Esempio di tessuto dell'orecchio medio macchiato. La figura mostra ematossilina ed eosina, ACE2, TMPRSS2 e colorazione Furin della mucosa dell'orecchio medio (fila superiore, ingrandimento 20x) e della tromba di Eustachio (riga inferiore, ingrandimento 10x). Barre di scala = 50 μm (riga superiore); 100 μm (riga inferiore). Abbreviazioni: H&E = ematossilina ed eosina; enzima di conversione dell'angiotensina 2; TMPRSS2 = proteasi transmembrana, serina 2. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La ricerca sull'osso temporale umano è fondamentale per lo studio della patologia dell'orecchio interno e medio, ma rimane uno sforzo ad alta intensità di tempo e risorse. Questo documento descrive una tecnica che utilizza una microsega diamanta per generare sezioni ossee temporali spesse che possono essere rapidamente decalcificate prima di ulteriori sezioni in modo che il tempo dalla raccolta dei tessuti allo studio possa essere ridotto da 9-10 mesi a 10-14 giorni. Questa tecnica può ridurre le risorse necessarie per l'elaborazione dell'osso temporale e facilitare studi sensibili al tempo, come quelli relativi alla patologia dell'orecchio medio e interno COVID-1913, che è stata la motivazione per lo sviluppo di questo protocollo. Questo protocollo ha permesso la visualizzazione dell'espressione di ACE2, TMPRS22 e Furin all'interno dell'orecchio medio e della tromba di Eustachio, fornendo un probabile meccanismo attraverso il quale SARS-CoV-2 può infettare l'orecchio medio diffondendosi dal rinofaringe attraverso la tromba di Eustachio.
L'innovazione primaria di questo protocollo è l'utilizzo di una sega diamantata che taglia il tessuto prima della decalcificazione, che genera sezioni "spesse" di osso temporale che possono essere rapidamente decalcificate aumentando la superficie del tessuto esposto all'agente decalcificante. Questo passaggio consente la decalcificazione dei tessuti entro 7-10 giorni invece degli 1-2 mesi che i protocolli tradizionali possono richiedere per la decalcificazione. Le sezioni "spesse" di tessuto create con la sega diamantata possono anche essere disidratate più rapidamente di un blocco standard di tessuto osseo temporale, riducendo così il tempo tra la decalcificazione e l'incorporamento. Inoltre, questo protocollo utilizza la paraffina come agente incorporante piuttosto che la celloidina, che impiega circa 3 mesi per indurire7. Mentre la celloidina fornisce una conservazione superiore delle strutture cocleari, la paraffina si indurisce molto più rapidamente e facilita l'immunocolorazione. Con queste modificazioni, il tessuto osseo temporale può essere lavorato in 10-14 giorni rispetto ai 9-10 mesi richiesti nelle strategie di lavorazione più tradizionali 7,9.
Questo protocollo ha diverse limitazioni. Tagliare il tessuto con la sega a diamante prima dell'incorporamento rischia di danneggiare l'organo di Corti (OOC). L'OOC è stato gravemente danneggiato nella maggior parte dei campioni durante lo sviluppo di questa tecnica, che può limitare il valore di questa tecnica per lo studio di patologie come la perdita dell'udito legata all'età, dove è fondamentale preservare le delicate strutture dell'orecchio interno. Potrebbe essere possibile posizionare il campione in modo che la sega a diamante non tagli direttamente l'osso della capsula otica e preservi le strutture dell'orecchio interno, ma questa rimane un'area di indagine attiva. I modelli animali possono fornire uno strumento prezioso per perfezionare ulteriormente questo protocollo e aumentare la possibilità di preservare le strutture dell'orecchio interno in questi preziosi esemplari umani. La qualità dei tessuti in questo protocollo è inoltre limitata dall'uso dell'agente incorporante di paraffina, che è stato selezionato a causa di vincoli di tempo. L'incorporamento di celloidin mantiene meglio l'integrità cellulare nei campioni otopatologici, ma richiede mesi per indurirsi7. Infine, questo protocollo richiede ancora un notevole investimento di tempo e risorse. L'uso di una microsega diamantata è un costo aggiuntivo rispetto ai materiali necessari per la tradizionale preparazione dell'osso temporale e i 7-10 giorni necessari per la decalcificazione sono ancora lunghi. In futuro, potrebbe essere possibile combinare questi metodi con la decalcificazione assistita da microonde14 per ridurre ulteriormente il tempo necessario per la lavorazione.
Nonostante i suoi limiti, il protocollo per l'elaborazione dell'osso temporale ad alta velocità qui descritto offre un altro strumento per studiare la patologia dell'orecchio medio e potenzialmente dell'orecchio interno. Questa tecnica è stata utile durante la pandemia di COVID-19 e può anche ridurre i costi associati al mantenimento di un laboratorio osseo temporale attivo riducendo il tempo e la manodopera necessari per la lavorazione dei tessuti. La ricerca sull'osso temporale è diminuita in popolarità negli Stati Uniti, diminuendo da 28 laboratori attivi nel 1980 a soli 4 laboratori attivi al momento4. Questo calo del numero di laboratori operativi di ossa temporali può essere correlato ai costi significativi associati alla raccolta e alla lavorazione delle ossa temporali 4,8. Di conseguenza, è importante che miriamo a sviluppare tecniche che riducano le risorse necessarie per l'elaborazione dell'osso temporale e anche quelle che consentono lo studio della patologia ossea temporale in nuovi contesti, come la pandemia COVID-19. Inoltre, l'elaborazione tissutale ad alta velocità, come quella delineata in questo protocollo, può aiutare l'uso di nuove tecniche biologiche (ad esempio, immunoistochimica, trascrittomica) che consentono la valutazione della patologia dell'orecchio medio e interno a livello molecolare 15,16,17,18,19 . Abbiamo appena scalfito la superficie in termini di utilizzo di tecniche molecolari per studiare il tessuto umano nella malattia otologica, e possono fornire importanti intuizioni che non possono essere fornite da modelli animali.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.
Acknowledgments
Ringraziamo Mohamed Lehar per la sua assistenza in questo progetto. Questo lavoro è stato parzialmente supportato dal National Institutes of Health (T32DC000027, NSA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-ACE-2 Antibody (1:50 applied dilution) | Novus Biologicals | SN0754 | |
| Anti-Furin Antibody (1:250 dilution) | Abcam | EPR 14674 | |
| Anti-TMPRSS2 Antibody (1:1,000 dilution) | Novus Biologicals | NBP1-20984 | |
| BX43 Manual System Microscope | Olympus Life Science Solutions | ||
| CBN/Diamond Hybrid Wafering Blade | Pace Technologies | WB-007GP | |
| Collin Mallet - 8'' | Surgical Mart | SM1517 | |
| DS-Fi3 Microscope Camera | Nikon | ||
| Dual Endogenous Enzyme Block (commercial blocking solution) | Dako | S2003 | |
| Eaosin Stain | Sigma-Aldrich | 548-24-3 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Formical-4 Decalcifier (formic acid decalcifying solution) | StatLab | 1214-1 GAL | |
| Hematoxylin Stain | Sigma-Aldrich | H9627 | |
| HRP-Conjugated Anti-Rabbit Secondary Antibody (1:100 dilution) | Leica Biosystems | PV6119 | |
| ImmPRESS HRP Horse Anti-Goat igG Detection Kit, Peroxidase (1:100 dilution) | Vector Laboratories | MP-7405 | |
| Lambotte Osteotome | Surgical Mart | SM1553 | |
| Metallographic PICO 155P Precision Saw | Pace Technologies | PICO 155P | microsaw |
| NIS Elements Software Version 4.6 | Nikon | ||
| Paraplast Plus | Sigma-Aldrich | P3683 | paraffin |
| Positive Charged Microscope Slides with White Frosted End | Walter Products | 1140B15 | |
| Thermo Shandon Crytome FSE Cryostat Microtome | New Life Scientific Inc. | A78900104 | cryotome |
| Triology Pretreatment Solution (commercial pretreatment solution) | Sigma-Aldrich | 920P-05 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 920P-05 |
References
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