Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Высокоскоростное сечение височной кости человека для оценки COVID-19-ассоциированной патологии среднего уха

Published: May 18, 2022 doi: 10.3791/64012
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Department of Otolaryngology - Head & Neck Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 2W. Harry Feinstone Department of Molecular Microbiology and Immunology, Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health, 3Department of Pathology, Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

В этой статье описывается метод быстрого среза височной кости человека, который использует микропилу с двумя алмазными лезвиями для создания тонких срезов для быстрой декальцинации и анализа иммуногистохимии височной кости.

Abstract

Гистопатологический анализ височных костных отделов человека является фундаментальной методикой изучения патологии внутреннего и среднего уха. Срезы височной кости получают путем посмертного забора височной кости, фиксации, декальцификации, встраивания и окрашивания. Из-за плотности височной кости декальцинация является трудоемким и ресурсоемким процессом; полная подготовка тканей может занять в среднем 9-10 месяцев. Это замедляет исследования отопатологии и препятствует чувствительным ко времени исследованиям, таким как те, которые имеют отношение к пандемии COVID-19. В данной работе описывается методика быстрой подготовки и декальцификации височных костных срезов для ускорения обработки тканей.

Височные кости были собраны посмертно с использованием стандартных методов и зафиксированы в 10% формалине. Прецизионная микропила со сдвоенными алмазными лезвиями использовалась для резки каждой секции на три толстых участка. Толстые висовидные участки кости затем декальцифицировали в декальцифицирующем растворе в течение 7-10 дней, прежде чем были встроены в парафин, разделены на тонкие (10 мкм) участки с использованием криотома и установлены на незаряженных слайдах. Затем образцы тканей депарафинизировали и регидратировали для окрашивания антителами (ACE2, TMPRSS2, Furin) и визуализировали. Эта методика сократила время от сбора урожая до анализа тканей с 9-10 месяцев до 10-14 дней. Высокоскоростное срезание височной кости может увеличить скорость исследований отопатологии и уменьшить ресурсы, необходимые для подготовки тканей, а также облегчить чувствительные ко времени исследования, такие как те, которые связаны с COVID-19.

Introduction

Исследование височной кости человека предоставляет бесценный ресурс для изучения патологии и патофизиологии внутреннего и среднего уха. До 19-го века мало что было известно об отологических заболеваниях 1,2,3. Чтобы лучше понять отологические заболевания и «спасение слуховой хирургии от рук шарлатанов», Джозеф Тойнби (1815-1866) разработал методы изучения гистологических участков височной кости человека3. Эта работа была продолжена Адамом Политцером (1835-1920) в Вене и других странах Европы в течение оставшейся части 19-го века, который использовал срезы височной кости для описания гистопатологии многих распространенных состояний, влияющих на ухо 2,3,4.

Первая лаборатория височной кости человека в США была открыта в 1927 году в больнице Джона Хопкинса, где Стейси Гильд (1890-1966) разработала методыразрезания височной кости 5,6. Методы, разработанные Гильдией, состояли из 9-10-месячного процесса, который включал в себя посмертный сбор, фиксацию, декальцинацию в азотной кислоте, обезвоживание в этаноле, встраивание целлоидина, секционирование, окрашивание и монтаж. Модификации этой техники были позже сделаны Гарольдом Шукнехтом (1917-1996)7; однако основные компоненты этого процесса остаются практически неизменными.

Значительные ресурсы, необходимые для поддержания лаборатории височной кости, представляли собой проблему для исследования височной кости и, вероятно, способствовали снижению ее популярности за последние 30 лет 4,8. Значительная часть лабораторных ресурсов височной кости должна быть направлена на 9-10-месячный процесс подготовки височной кости. Одним из самых трудоемких этапов подготовки является декальцификация височной кости, которая является самой плотной костью в организме человека. Декальцинация обычно выполняется в азотной кислоте или этилендиаминтетрауксусной кислоте (ЭДТА) и занимает от нескольких недель до нескольких месяцев, требуя частой смены растворов 7,9. Кроме того, чувствительные ко времени исследования человеческого уха, такие как те, которые связаны с пандемией COVID-19, могут быть затруднены этим медленным процессом подготовки. В этой статье описывается метод высокоскоростного сечения височной кости, который использует алмазную микропилу для создания толстых участков, которые позволяют быстро декальцинировать и анализировать ткани в течение 10-14 дней после сбора височной кости.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Этот протокол был разработан с одобрения IRB (IRB00250002) и в соответствии с институциональной политикой по использованию тканей человека и инфекционных материалов. Каждый донор височной кости предоставил письменное согласие перед смертью, или согласие было получено посмертно от семьи донора. Смотрите Таблицу материалов для получения подробной информации обо всех материалах, оборудовании и программном обеспечении, используемых в этом протоколе.

1. Зажим височной кости

  1. Получить одобрение местного институционального наблюдательного совета (IRB), пересмотреть институциональную политику в отношении использования человеческого и инфекционного материала и получить согласие на донорство тканей до использования этого протокола.
  2. Наденьте надлежащие средства индивидуальной защиты (СИЗ) перед работой с тканями от COVID-19-положительных доноров височной кости. Убедитесь, что СИЗ состоят из респиратора N-95 и лицевого щитка (или, в качестве альтернативы, системы очистки воздуха под положительным давлением), халата и двух пар перчаток. Просмотрите методы правильного ношения и снятия СИЗ перед началом работы с этим протоколом10.
  3. Собирают височную костную ткань в течение 12-24 ч после смерти донора. Если тело не охлаждено, убедитесь, что сбор урожая происходит в течение 8 часов после смерти.
    1. Сбор височных костей во время вскрытия с использованием метода с четырьмя разрезами, блокированием по остеотому7.
      1. После трепанации черепа удалите мозг и резко разделите черепные нервы на внутренний слуховой проход.
      2. Сделайте первый костный разрез с остеотомом параллельно и просто медиально плоской части височной кости.
      3. Выполняют второй костный разрез параллельно первому на медиальной границе височной кости.
      4. Затем делают третий разрез на 3-4 см спереди и параллельно петроусскому гребню.
      5. Сделайте четвертый разрез примерно параллельно третьему, на 2 см сзади от петрового гребня.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что все разрезы проходят через основание черепа.
      6. Затем удалите височную кость, используя острое рассечение, чтобы освободить прикрепление мягких тканей вдоль нижнего края образца. Если бальзамирование должно быть выполнено после забора височной кости, завяжите культю сонной артерии.

2. Фиксация тканей, декальцинация и сечение

  1. Немедленно поместите ткань в 200-300 мл 10% буферизованного формалина (формальдегида) так, чтобы ткань была полностью погружена. Оставьте ткань в формальдегиде минимум на 72 ч при комнатной температуре, ежедневно меняя растворы. Храните ткань в герметичном контейнере и вносите изменения раствора под вытяжным капюшоном, нося соответствующие СИЗ для предотвращения распространения вируса.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После 72-часового периода фиксации образцы больше не нужно считать инфекционными.
  2. Используйте прецизионную микропилу с двумя алмазными лезвиями, чтобы разрезать каждый образец на три «толстых» участка, чтобы обеспечить более быстрое декальцификацию тканей. Установите двойные алмазные лезвия на расстояние 5 мм, чтобы центральное сечение височной кости имело толщину 5 мм. Убедитесь, что участки ткани на обоих концах имеют толщину 3-5 мм.
  3. Поместите толстые срезы в 200-300 мл 23% мас./мас., декальцинирующего раствор муравьиной кислоты, на 7-10 дней при комнатной температуре, пока ткань не станет достаточно мягкой для встраивания парафина. Меняйте решения ежедневно. Проверьте адекватность декальцификации тканей, пальпируя образец, который должен чувствовать себя мягким.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Декальцинация также может быть проверена рентгеновским снимком.
  4. Промойте образцы в проточной водопроводной воде в течение 24 часов, поместив их в большой стакан под работающим краном.
  5. Обезвоживают ткани в серии спиртов повышенной концентрации7. Погружают ткань в 100-200 мл 70% этанола в течение 1,5 ч с последующим тремя промывками в 95% и 100% этаноле по 1,5 ч соответственно. Далее промыть ткань 3 х 1,5 ч в ксилоле.
  6. Вставьте толстые срезы в парафин, с четырьмя процедурами по 45 минут каждая.
  7. Используйте криотом, чтобы разрезать тонкие (10 мкм) участки. Расположите ткань так, чтобы ткань разрезалась в осевой плоскости. При желании нарежьте более толстые (20 мкм) участки.

3. Иммуногистохимия и визуализация

  1. Если желательно традиционное окрашивание гематоксилином и эозином (не описано здесь), выполните окрашивание перед монтажом секций на стеклянных слайдах7.
  2. Установите секции на положительно заряженные стеклянные слайды.
  3. Выпекайте горки на конфорке при 60 °C в течение 20 минут.
  4. Поместите слайды в держатель и погрузите их в коммерческий раствор для предварительной обработки, содержащий органический растворитель (в данном случае диэтаноламин) и этанол для депарафинизации, регидратации и демаскации ткани.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необходим для достижения удовлетворительных результатов с помощью иммуногистохимии для формалин-фиксированной и парафин-внедренной ткани.
  5. Нагревайте слайды в скороварке на высоком давлении в течение 20 мин.
  6. Поместите слайды в увлажненную камеру и заблокируйте ткань коммерческим блокирующим раствором.
  7. Исследуйте участки тканей первичным антителом против ангиотензинпревращающего фермента 2 (ACE2; 1:50), трансмембранной протеазы серин 2 (TMPRSS2, 1:1000) и протеазы Фурина (1:250).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Антитела ACE2, TMPRSS2 и Furin используются, потому что эти белки, как полагают, играют роль в инфекционности SARS-CoV-211,12, и этот протокол направлен на исследование возможных механизмов, с помощью которых SARS-CoV-2 может инфицировать среднее ухо13.
  8. Лечить HRP-конъюгированным антизаглубийным вторичным антителом (ACE2, Furin; разведение 1:100) или антикоачьим (TMPRSS2, разведение 1:100) вторичным антителом.
  9. Увлажняйте горки 70% гематоксилина в воде.
  10. Получайте изображения на световой микроскоп с помощью установленной цифровой камеры. Получение изображений слизистой оболочки среднего уха и евстахиевой трубы при 20-кратном и 10-кратном увеличении соответственно.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Окрашивание гематоксилином и эозином слизистой оболочки среднего уха и евстахиевой трубы показало сохранение слизистой оболочки среднего уха и подслизистой ткани среднего уха после обработки (рисунок 1). Иммуногистохимические изображения показали экспрессию белков ACE2, TMPRSS2 и Furin в слизистой оболочке среднего уха и евстахиевой трубе (рисунок 1). Присутствие этих белков в среднем ухе обеспечивает возможный путь, по которому SARS-CoV-2 может инфицировать респираторный эпителий в среднем ухе 11,12,13. Кроме того, экспрессия этих белков в евстахиевой трубе может объяснить маршрут, по которому вирус проникает в среднее ухо, путешествуя в среднее ухо из носоглотки через евстахиеву трубу.

Figure 1
Рисунок 1: Пример окрашенной ткани среднего уха. На рисунке показано окрашивание гематоксилина и эозина, ACE2, TMPRSS2 и Фурина слизистой оболочки среднего уха (верхний ряд, 20-кратное увеличение) и евстахиевой трубы (нижний ряд, 10-кратное увеличение). Шкала брусков = 50 мкм (верхний ряд); 100 мкм (нижний ряд). Сокращения: H&E = гематоксилин и эозин; ангиотензинпревращающий фермент 2; TMPRSS2 = трансмембранная протеаза, серин 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Исследование височной кости человека имеет решающее значение для изучения патологии внутреннего и среднего уха, но остается трудоемким и ресурсоемким делом. В этой статье описывается метод, который использует алмазную микропилу для создания толстых височных участков кости, которые могут быть быстро декальцинированы перед дальнейшим сечением, так что время от сбора ткани до исследования может быть сокращено с 9-10 месяцев до 10-14 дней. Этот метод может уменьшить ресурсы, необходимые для обработки височной кости, и облегчить чувствительные ко времени исследования, такие как те, которые связаны с патологией среднего и внутреннего ухаCOVID-19 13, что послужило мотивацией для разработки этого протокола. Этот протокол позволил визуализировать экспрессию ACE2, TMPRS22 и Furin в среднем ухе и евстахиевой трубе, обеспечивая вероятный механизм, с помощью которого SARS-CoV-2 может инфицировать среднее ухо, распространяясь из носоглотки через евстахиеву трубу.

Основным новшеством этого протокола является использование алмазной пилы, которая разрезает ткань перед декальцификацией, которая генерирует «толстые» участки височной кости, которые могут быть быстро декальцифицированы путем увеличения площади поверхности ткани, подвергающейся воздействию декальцифицирующего агента. Этот шаг позволяет декальцификации тканей происходить в течение 7-10 дней вместо 1-2 месяцев, которые могут потребоваться традиционным протоколам для декальцификации. «Толстые» участки ткани, созданные с помощью алмазной пилы, также могут обезвоживаться быстрее, чем стандартный блок височной костной ткани, тем самым сокращая время между декальцификацией и встраиванием. Кроме того, этот протокол использует парафин в качестве встраивающего агента, а не целлоидин, который занимает примерно 3 месяца, чтобы затвердеть7. В то время как целлоидин обеспечивает превосходную сохранность кохлеарных структур, парафин затвердевает намного быстрее и облегчает иммуноокрашивание. С этими модификациями височная костная ткань может быть обработана за 10-14 дней, в отличие от 9-10 месяцев, необходимых в более традиционных стратегиях обработки 7,9.

Этот протокол имеет несколько ограничений. Разрезание ткани алмазной пилой перед встраиванием рискует повредить орган Корти (OOC). OOC был серьезно поврежден в большинстве образцов во время разработки этой техники, что может ограничить ценность этой техники для изучения патологий, таких как возрастная потеря слуха, где жизненно важно сохранить тонкие структуры внутреннего уха. Возможно, удастся расположить образец таким образом, чтобы алмазная пила не разрезала непосредственно отическую капсульную кость и сохраняла структуры внутреннего уха, но это остается областью активного исследования. Животные модели могут стать ценным инструментом для дальнейшего совершенствования этого протокола и увеличения вероятности сохранения структур внутреннего уха в этих ценных человеческих образцах. Качество тканей в этом протоколе дополнительно ограничено использованием парафин-встраивающего агента, который был выбран из-за временных ограничений. Встраивание целлоидина лучше поддерживает клеточную целостность в отопатологических образцах, но для затвердевания7 требуются месяцы. Наконец, этот протокол по-прежнему требует значительных временных и ресурсных вложений. Использование алмазной микропилы является дополнительной стоимостью к материалам, необходимым для традиционной подготовки височной кости, и 7-10 дней, необходимых для декальцинации, все еще длительны. В будущем, возможно, удастся объединить эти методы с микроволновой декальцификацией14 , чтобы еще больше сократить время, необходимое для обработки.

Несмотря на свои ограничения, описанный здесь протокол высокоскоростной обработки височной кости предлагает еще один инструмент для изучения патологии среднего и, возможно, внутреннего уха. Этот метод был полезен во время пандемии COVID-19, а также может снизить затраты, связанные с поддержанием активной лаборатории височной кости, за счет сокращения времени и труда, необходимых для обработки тканей. Популярность исследований височной кости снизилась в Соединенных Штатах, сократившись с 28 активных лабораторий в 1980-х годах до 4 активных лабораторий в настоящее время4. Это снижение числа действующих лабораторий височной кости может быть связано со значительными затратами, связанными со сбором и обработкой височных костей 4,8. Следовательно, важно, чтобы мы стремились разрабатывать методы, которые уменьшают ресурсы, необходимые для обработки височной кости, а также те, которые позволяют изучать патологию височной кости в новых контекстах, таких как пандемия COVID-19. Кроме того, высокоскоростная обработка тканей, такая как описанная в настоящем протоколе, может помочь в использовании новых биологических методов (например, иммуногистохимии, транскриптомики), которые позволяют оценить патологию среднего и внутреннего уха на молекулярном уровне 15,16,17,18,19 . Мы едва поцарапали поверхность с точки зрения использования молекулярных методов для изучения тканей человека при отологических заболеваниях, и они могут дать важную информацию, которая не может быть предоставлена животными моделями.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

У авторов нет конфликта интересов, о которых можно было бы заявить.

Acknowledgments

Мы благодарим Мохамеда Лехара за его помощь в этом проекте. Эта работа была частично поддержана Национальными институтами здравоохранения (T32DC000027, NSA).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-ACE-2 Antibody (1:50 applied dilution) Novus Biologicals SN0754
Anti-Furin Antibody (1:250 dilution) Abcam EPR 14674
Anti-TMPRSS2 Antibody (1:1,000 dilution) Novus Biologicals NBP1-20984
BX43 Manual System Microscope Olympus Life Science Solutions
CBN/Diamond Hybrid Wafering Blade Pace Technologies WB-007GP
Collin Mallet - 8'' Surgical Mart SM1517
DS-Fi3 Microscope Camera Nikon
Dual Endogenous Enzyme Block (commercial blocking solution) Dako S2003
Eaosin Stain Sigma-Aldrich 548-24-3
Formalin solution, neutral buffered 10% Sigma-Aldrich HT501128
Formical-4 Decalcifier (formic acid decalcifying solution) StatLab 1214-1 GAL
Hematoxylin Stain Sigma-Aldrich H9627
HRP-Conjugated Anti-Rabbit Secondary Antibody (1:100 dilution) Leica Biosystems PV6119
ImmPRESS HRP Horse Anti-Goat igG Detection Kit, Peroxidase (1:100 dilution) Vector Laboratories MP-7405
Lambotte Osteotome Surgical Mart SM1553
Metallographic PICO 155P Precision Saw Pace Technologies PICO 155P microsaw
NIS Elements Software Version 4.6 Nikon
Paraplast Plus Sigma-Aldrich P3683 paraffin
Positive Charged Microscope Slides with White Frosted End Walter Products 1140B15
Thermo Shandon Crytome FSE Cryostat Microtome New Life Scientific Inc. A78900104 cryotome
Triology Pretreatment Solution (commercial pretreatment solution) Sigma-Aldrich 920P-05
Xylene Sigma-Aldrich 920P-05

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nogueira, J. F., et al. A brief history of otorhinolaryngology: Otology, laryngology and rhinology. Brazilian Journal of Otorhinolaryngology. 73 (5), 693-703 (2007).
  2. Pappas, D. G. Otology through the ages. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 114 (2), 173-196 (1996).
  3. Schuknecht, H. F. Otopathology: The past, present, and future. Auris Nasus Larynx. 23, 43-45 (1996).
  4. Monsanto, R. D. C., Pauna, H. F., Paparella, M. M., Cureoglu, S. Otopathology in the United States: History, current situation, and future perspectives. Otology & Neurotology. 39 (9), 1210-1214 (2018).
  5. Crowe, S. J., Guild, S. R., Polvogt, L. M. Observations on the pathology of high-tone deafness. Journal of Nervous and Mental Disease. 80, 480 (1934).
  6. Andresen, N. S., et al. Insights into presbycusis from the first temporal bone laboratory within the United States. Otology & Neurotology. 43 (3), 400-408 (2022).
  7. Schuknecht, H. Pathology of the Ear. , Lea and Febiger. Philadelphia, PA. (1993).
  8. Chole, R. A. Labs in crisis: Protecting the science--and art--of otopathology. Otology & Neurotology. 31 (4), 554-556 (2010).
  9. Nager, G. T. Pathology of the Ear and Temporal Bone. , Williams and Wilkins. Baltimore, MD. (1993).
  10. COVID-19 Personal Protective Equipment (PPE). , Available from: https://www.cdc.gov/niosh/emres/2019_ncov_ppe.html (2022).
  11. Essalmani, R., et al. Distinctive roles of Furin and TMPRSS2 in SARS-CoV-2 infectivity. Journal of Virology. 96 (8), 0012822 (2022).
  12. Ueha, R., Kondo, K., Kagoya, R., Shichino, S., Yamasoba, T. ACE2, TMPRSS2, and Furin expression in the nose and olfactory bulb in mice and humans. Rhinology. 59 (1), 105-109 (2021).
  13. Frazier, K. M., Hooper, J. E., Mostafa, H. H., Stewart, C. M. SARS-CoV-2 virus isolated from the mastoid and middle ear: Implications for COVID-19 precautions during ear surgery. JAMA Otolaryngology - Head & Neck Surgery. 146 (10), 964-966 (2020).
  14. Cunningham, C. D., Schulte, B. A., Bianchi, L. M., Weber, P. C., Schmiedt, B. N. Microwave decalcification of human temporal bones. Laryngoscope. 111 (2), 278-282 (2001).
  15. Stephenson, R., et al. Immunohistochemical location of Na+, K+-ATPase α1 subunit in the human inner ear. Hearing Research. 400, 108113 (2021).
  16. McCall, A. A., et al. Extralabyrinthine manifestations of DFNA9. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 12 (2), 141-149 (2011).
  17. Wu, P. Z., O'Malley, J. T., de Gruttola, V., Liberman, M. C. Age-related hearing loss is dominated by damage to inner ear sensory cells, not the cellular battery that powers them. The Journal of Neuroscience. 40 (33), 6357-6366 (2020).
  18. Miller, M. E., Lopez, I. A., Linthicum, F. H., Ishiyama, A. Connexin 26 immunohistochemistry in temporal bones with cochlear otosclerosis. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 127 (8), 536-542 (2018).
  19. Lopez, I. A., et al. Immunohistochemical techniques for the human inner ear. Histochemistry and Cell Biology. 146 (4), 367-387 (2016).

Tags

Иммунология и инфекции выпуск 183
Высокоскоростное сечение височной кости человека для оценки COVID-19-ассоциированной патологии среднего уха
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Andresen, N. S., Wood, M. K.,… More

Andresen, N. S., Wood, M. K., Čiháková, D., Stewart, C. M. High-Speed Human Temporal Bone Sectioning for the Assessment of COVID-19-Associated Middle Ear Pathology. J. Vis. Exp. (183), e64012, doi:10.3791/64012 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter