Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

חתך עצמות טמפורליות אנושיות במהירות גבוהה להערכת פתולוגיה של האוזן התיכונה הקשורה ל-COVID-19

Published: May 18, 2022 doi: 10.3791/64012
Automatic Translation
1, 2, 3, 1
1Department of Otolaryngology - Head & Neck Surgery, Johns Hopkins University School of Medicine, 2W. Harry Feinstone Department of Molecular Microbiology and Immunology, Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health, 3Department of Pathology, Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

מאמר זה מתאר טכניקה לחתך מהיר של העצם הטמפורלית האנושית המשתמשת במיקרו-מסור עם להבי יהלום תאומים כדי ליצור פרוסות דקות לצורך טשטוש מהיר וניתוח של אימונוהיסטוכימיה של העצם הטמפורלית.

Abstract

ניתוח היסטופתולוגי של נתחי עצם טמפורליים אנושיים הוא טכניקה בסיסית לחקר פתולוגיה של האוזן הפנימית והתיכונה. מקטעי עצם טמפורליים מוכנים על ידי קציר עצם טמפורלית לאחר המוות, קיבוע, דקלסיפיקציה, הטבעה וצביעה. בשל הצפיפות של העצם הטמפורלית, decalcification הוא תהליך גוזל זמן ועתיר משאבים; הכנת רקמות מלאה עשויה להימשך 9-10 חודשים בממוצע. זה מאט את המחקר באוטופתולוגיה ומעכב מחקרים רגישים לזמן, כמו אלה הרלוונטיים למגפת COVID-19. מאמר זה מתאר טכניקה להכנה מהירה של נתחי עצם טמפורליים כדי להאיץ את עיבוד הרקמות.

עצמות טמפורליות נקטפו לאחר המוות בטכניקות סטנדרטיות והתקבעו ב-10% פורמלין. מיקרו-מסור מדויק עם שני להבי יהלום שימש לחיתוך כל מקטע לשלושה חלקים עבים. לאחר מכן, מקטעי עצם טמפורלית עבים הודבקו בתמיסה דקטלסית במשך 7-10 ימים לפני שהוטמעו בפרפין, נחתכו למקטעים דקים (10 מיקרומטר) באמצעות קריוטום, והורכבו על שקופיות לא טעונות. דגימות רקמות הוחרמו לאחר מכן והתייבשו מחדש לצורך צביעת נוגדנים (ACE2, TMPRSS2, Furin) והצטלמו. טכניקה זו הפחיתה את הזמן מהקציר לניתוח רקמות מ 9-10 חודשים ל 10-14 ימים. חיתוך עצם טמפורלית במהירות גבוהה עשוי להגביר את מהירות המחקר באוטופתולוגיה ולהפחית את המשאבים הדרושים להכנת רקמות, תוך הקלה על מחקרים רגישים לזמן כמו אלה הקשורים ל- COVID-19.

Introduction

מחקר העצם הטמפורלית האנושית מספק משאב שלא יסולא בפז לחקר הפתולוגיה והפתופיזיולוגיה של האוזן הפנימית והתיכונה. לפני המאה ה-19, מעט מאוד היה ידוע על מחלה אוטולוגית 1,2,3. כדי להבין טוב יותר את המחלה האוטולוגית ואת "ניתוחי ההצלה האוראליים מידיו של קוואקים", ג'וזף טוינבי (1815-1866) פיתח שיטות לחקר חלקים היסטולוגיים של העצם הטמפורלית האנושית3. עבודה זו קודמה על ידי אדם פוליצר (1835-1920) בווינה ואחרים ברחבי אירופה במהלך שארית המאה ה -19, שהשתמשו בקטעי עצם טמפורליים כדי לתאר את ההיסטופתולוגיה של מצבים נפוצים רבים המשפיעים על האוזן 2,3,4.

מעבדת העצם הרקתית האנושית הראשונה בארצות הברית נפתחה בשנת 1927 בבית החולים ג'ונס הופקינס, שם פיתחה סטייסי גילד (1890-1966) שיטות לחתך עצמות טמפורליות 5,6. השיטות שפותחו על ידי גילדה כללו תהליך של 9-10 חודשים שכלל קציר לאחר המוות, קיבוע, דקלסיפיקציה בחומצה חנקתית, התייבשות באתנול, הטבעת צלולואידין, חתך, צביעה והרכבה. שינויים בטכניקה זו נעשו מאוחר יותר על ידי הרולד שוקנכט (1917-1996)7; עם זאת, המרכיבים הבסיסיים של תהליך זה נותרו כמעט ללא שינוי.

המשאבים המשמעותיים הנדרשים לתחזוקת מעבדת עצם טמפורלית הציבו אתגר למחקר עצם טמפורלית וככל הנראה תרמו לירידה בפופולריות שלה במהלך 30 השנים האחרונות 4,8. חלק ניכר ממשאבי המעבדה של העצם הרקתית חייבים להיות מוקדשים לתהליך של 9-10 חודשים של הכנת עצם טמפורלית. אחד הצעדים הגוזלים זמן רב ביותר בהכנה הוא decalcification של העצם הטמפורלית, שהיא העצם הצפופה ביותר בגוף האדם. דקלקציה מבוצעת בדרך כלל בחומצה חנקתית או בחומצה אתילנדיאמינט-אצטית (EDTA) ונמשכת שבועות עד חודשים תוך דרישה לשינוי תכוף של תמיסות 7,9. יתר על כן, מחקרים רגישים לזמן של האוזן האנושית, כמו אלה הקשורים למגפת COVID-19, עשויים להיות מעוכבים על ידי תהליך ההכנה האיטי הזה. מאמר זה מתאר טכניקה לחתך עצם טמפורלית במהירות גבוהה המשתמשת במיקרו-מסור יהלום כדי ליצור חתכים עבים המאפשרים טשטוש מהיר וניתוח רקמות תוך 10-14 יום מקצירת עצם טמפורלית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

פרוטוקול זה פותח באישור IRB (IRB00250002) ובהתאם למדיניות המוסדית לשימוש ברקמות אנושיות ובחומר זיהומי. כל תורם עצם זמני נתן הסכמה בכתב לפני המוות, או שההסכמה התקבלה לאחר מותו ממשפחתו של התורם. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים על כל החומרים, הציוד והתוכנות המשמשים בפרוטוקול זה.

1. קציר עצמות זמני

  1. קבל את אישור מועצת הביקורת המוסדית המקומית (IRB), עיין במדיניות המוסדית לשימוש בחומרים אנושיים ומדבקים, וקבל הסכמה לתרומת רקמות לפני השימוש בפרוטוקול זה.
  2. יש לשים ציוד מגן אישי מתאים (PPE) לפני עבודה עם רקמות מתורמי עצם טמפורלית חיוביים ל-COVID-19. ודא שה-PPE מורכב ממכונת הנשמה N-95 ומגן פנים (או לחילופין מערכת טיהור אוויר בלחץ חיובי), חלוק ושני זוגות כפפות. סקור טכניקות להתאמה נכונה ו- doffing PPE לפני תחילת פרוטוקול זה10.
  3. קציר רקמת עצם טמפורלית תוך 12-24 שעות ממוות התורם. אם הגוף אינו מקורר, ודא כי הקציר מתרחש בתוך 8 שעות מהמוות.
    1. קציר עצמות טמפורליות במהלך נתיחה שלאחר המוות באמצעות שיטת ארבע החתכים, בלוק על ידי אוסטאוטום7.
      1. לאחר כריתת גולגולת, הסר את המוח וחלק את עצבי הגולגולת לתעלה השמיעתית הפנימית בחדות.
      2. הפוך את החתך הגרמי הראשון עם האוסטאוטום במקביל לחלק הקשקשי של העצם הטמפורלית ופשוט מדיאלי.
      3. בצע את החתך הגרמי השני במקביל לראשון בגבול המדיאלי של העצם הטמפורלית.
      4. לאחר מכן, הפוך את החתך השלישי 3-4 ס"מ קדמי ומקביל לרכס פטרוס.
      5. הפוך את החתך הרביעי בערך מקביל לשלישי, 2 ס"מ אחורי לרכס פטרוס.
        הערה: ודא שכל החתכים משתרעים דרך בסיס הגולגולת.
      6. לאחר מכן, הסר את העצם הטמפורלית באמצעות דיסקציה חדה כדי לשחרר את חיבור הרקמה הרכה לאורך הקצה הנחות של הדגימה. אם יש לבצע את החניטה לאחר קצירת עצם טמפורלית, קשרו את הגדם של עורק הצוואר.

2. קיבוע רקמות, דקלסיפיקציה וחיתוך

  1. מיד למקם את הרקמה ב 200-300 מ"ל של 10% פורמלין buffered (פורמלדהיד) כך שהרקמה שקועה במלואה. השאירו את הרקמה בפורמלדהיד למשך 72 שעות לפחות בטמפרטורת החדר, והחליפו את התמיסות מדי יום. אחסנו את הרקמה במיכל אטום לאוויר ובצעו שינויי תמיסה מתחת למכסה אדים תוך שימוש ב-PPE מתאים למניעת התפשטות הנגיף.
    הערה: לאחר תקופת הקיבוע של 72 שעות, הדגימות כבר לא צריכות להיחשב כמדבקות.
  2. השתמש במיקרו-מסור מדויק עם שני להבי יהלום כדי לחתוך כל דגימה לשלושה חלקים "עבים" כדי לאפשר טשטוש מהיר יותר של רקמות. הגדר את להבי היהלום התאומים למרחק של 5 מ"מ, כך שהחלק המרכזי של העצם הטמפורלית יהיה בעובי של 5 מ"מ. ודא כי קטעי הרקמה משני הקצוות הם בעובי 3-5 מ"מ.
  3. מניחים את החלקים העבים ב-200-300 מ"ל של 23% w/w תמיסת מדבקות חומצה פורמית למשך 7-10 ימים בטמפרטורת החדר, עד שהרקמה תהיה רכה מספיק להטבעת פרפין. שנה את הפתרונות מדי יום. בדוק אם יש תיקון רקמות הולם על ידי מישוש הדגימה, שאמורה להרגיש רכה.
    הערה: ניתן לאמת את ההפחתה גם על-ידי צילום רנטגן.
  4. שטפו את הדגימות במי ברז זורמים במשך 24 שעות על ידי הנחתן בכוס גדולה מתחת לברז רץ.
  5. לייבש את הרקמה בסדרה של אלכוהולים של ריכוז עולה7. הטביע את הרקמה ב-100-200 מ"ל של 70% אתנול למשך 1.5 שעות, ולאחר מכן שלוש שטיפות ב-95% ו-100% אתנול למשך 1.5 שעות כל אחת, בהתאמה. לאחר מכן, לשטוף את הרקמה 3 x 1.5 שעות ב Xylene.
  6. הטמיעו את החלקים העבים בפרפין, עם ארבעה טיפולים של 45 דקות כל אחד.
  7. השתמש בקריוטום כדי לחתוך מקטעים דקים (10 מיקרומטר). מקם את הרקמה כך שהרקמה נחתכה במישור הצירי. חתכו קטעים עבים יותר (20 מיקרומטר) אם רוצים.

3. אימונוהיסטוכימיה והדמיה

  1. אם רוצים צביעת המטוקסילין ואאוזין מסורתית (לא מתוארת כאן), יש לבצע צביעה לפני הרכבת החלקים על שקופיות זכוכית7.
  2. הרכיבו את החלקים על מגלשות זכוכית טעונות חיובית.
  3. אופים את המגלשות על צלחת חמה בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
  4. מניחים את השקופיות במחזיק ומטביעים אותן בתמיסת טיפול מקדים מסחרית המכילה ממס אורגני (דיאתנולמין במקרה זה) ואתנול כדי לנטרל, לייבש מחדש ולחשוף את הרקמה.
    הערה: שלב זה נחוץ כדי להשיג תוצאות משביעות רצון עם אימונוהיסטוכימיה עבור רקמות קבועות פורמלין ומוטבעות פרפין.
  5. מחממים את המגלשות בסיר לחץ בלחץ גבוה במשך 20 דקות.
  6. מניחים את השקופיות בתא לח וחוסמים את הרקמה באמצעות תמיסת חסימה מסחרית.
  7. בדקו את מקטעי הרקמה עם הנוגדן העיקרי נגד אנזים ממיר אנגיוטנסין 2 (ACE2; 1:50), פרוטאז סרין טרנס-ממברנה 2 (TMPRSS2, 1:1,000), ופרוטאז פורין (1:250).
    הערה: הנוגדנים ACE2, TMPRSS2 ו-Furin משמשים מכיוון שלפי ההערכות חלבונים אלה ממלאים תפקיד בהדבקת SARS-CoV-2 11,12, ופרוטוקול זה ביקש לחקור את המנגנונים האפשריים שבאמצעותם SARS-CoV-2 עלול להדביק את האוזן התיכונה13.
  8. טפלו בנוגדן משני נגד ארנב מצומד HRP (ACE2, Furin; דילול 1:100) או בנוגדן משני נגד עזים (TMPRSS2, 1:100 דילול).
  9. נגד המגלשות עם 70% המטוקסילין במים.
  10. רכשו תמונות במיקרוסקופ אור באמצעות מצלמה דיגיטלית מותקנת. קבל תמונות של רירית האוזן התיכונה והצינור האוסטכי בהגדלה של פי 20 ו-10x, בהתאמה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

צביעת המטוקסילין ואאוזין ברירית האוזן התיכונה ובצינור האוסטכי הראתה שימור של רירית האוזן התיכונה ושל רקמת האוזן התת-קרקעית התת-קרקעית לאחר העיבוד (איור 1). תמונות אימונוהיסטוכימיות הראו ביטוי של חלבוני ACE2, TMPRSS2 ופורין בתוך רירית האוזן התיכונה והצינור האוסטכימי (איור 1). נוכחותם של חלבונים אלה בתוך האוזן התיכונה מספקת מסלול אפשרי שבאמצעותו SARS-CoV-2 עלול להדביק את האפיתל הנשימתי בתוך האוזן התיכונה 11,12,13. יתר על כן, הביטוי של חלבונים אלה בתוך הצינור Eustachian עשוי להסביר מסלול שבו הנגיף נכנס לאוזן התיכונה, ועובר לאוזן התיכונה מהנאסו-לוע דרך הצינור האוסטכי.

Figure 1
איור 1: דוגמה לרקמת אוזן תיכונה מוכתמת. האיור מראה את ההמטוקסילין והאוזין, ACE2, TMPRSS2 וצביעת פורין של רירית האוזן התיכונה (שורה עליונה, הגדלה של פי 20) וצינור אוסטכי (שורה תחתונה, הגדלה של פי 10). סרגלי קנה מידה = 50 מיקרומטר (שורה עליונה); 100 מיקרומטר (שורה תחתונה). קיצורים: H&E = המטוקסילין ואוזין; אנזים ממיר אנגיוטנסין 2; TMPRSS2 = טרנסממברנה פרוטאז, סרין 2. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

מחקר עצמות טמפורליות אנושיות הוא קריטי לחקר הפתולוגיה של האוזן הפנימית והתיכונה, אך הוא נותר מאמץ עתיר זמן ומשאבים. מאמר זה מתאר טכניקה המשתמשת במיקרו-מסור יהלום כדי ליצור מקטעי עצם טמפורליים עבים שניתן לנטרל במהירות לפני חתך נוסף, כך שניתן יהיה להפחית את הזמן מקצירת הרקמות למחקר מ-9-10 חודשים ל-10-14 ימים. טכניקה זו עשויה להפחית את המשאבים הדרושים לעיבוד עצם טמפורלית ולהקל על מחקרים רגישים לזמן, כגון אלה הקשורים לפתולוגיה של COVID-19 באוזן התיכונה והפנימית13, שהייתה המוטיבציה לפיתוח פרוטוקול זה. פרוטוקול זה איפשר הדמיה של ביטוי ACE2, TMPRS22 ופורין בתוך האוזן התיכונה והצינור האוסטכי, וסיפק מנגנון סביר שבאמצעותו SARS-CoV-2 עשוי להדביק את האוזן התיכונה על ידי התפשטות מהנאסו-לוע דרך הצינור האוסטכי.

החידוש העיקרי של פרוטוקול זה הוא השימוש במסור יהלום שחותך את הרקמה לפני הדקלציפיקציה, אשר יוצרת מקטעים "עבים" של עצם טמפורלית שעשויים להימחק במהירות על ידי הגדלת שטח הפנים של הרקמה החשופה לחומר המדבק. שלב זה מאפשר לדקלסיפיקציה של רקמות להתרחש תוך 7-10 ימים במקום 1-2 החודשים שהפרוטוקולים המסורתיים עשויים לדרוש עבור דטלקציה. החלקים ה"עבים" של הרקמה הנוצרים עם מסור היהלום עשויים גם להתייבש מהר יותר מאשר גוש סטנדרטי של רקמת עצם טמפורלית, ובכך לקצר את הזמן שבין טשטוש להטבעה. יתר על כן, פרוטוקול זה משתמש בפרפין כסוכן הטבעה ולא בצלואידין, שלוקח לו כ-3 חודשים להתקשות7. בעוד שצלואידין מספק שימור מעולה של מבנים שבלוליים, פרפין מתקשה הרבה יותר מהר ומאפשר שמירה חיסונית. עם שינויים אלה, ניתן לעבד רקמת עצם טמפורלית תוך 10-14 ימים לעומת 9-10 החודשים הנדרשים באסטרטגיות עיבוד מסורתיות יותר 7,9.

לפרוטוקול זה יש מספר מגבלות. חיתוך הרקמה עם מסור היהלום לפני ההטבעה מסתכן בפגיעה באיבר קורטי (OOC). ה- OOC נפגע קשות ברוב הדגימות במהלך התפתחות טכניקה זו, מה שעשוי להגביל את הערך של טכניקה זו לחקר פתולוגיות כגון אובדן שמיעה הקשור לגיל, שם חיוני שהמבנים העדינים של האוזן הפנימית יישמרו. ייתכן שניתן יהיה למקם את הדגימה כך שמסור היהלום לא יחתוך ישירות את עצם הקפסולה האוטית וישמור על מבני האוזן הפנימית, אך זה נשאר תחום של חקירה פעילה. מודלים של בעלי חיים עשויים לספק כלי רב ערך כדי לחדד עוד יותר את הפרוטוקול הזה ולהגדיל את הסיכוי לשמר את מבני האוזן הפנימית בדגימות אנושיות יקרות ערך אלה. איכות הרקמה בפרוטוקול זה מוגבלת בנוסף על ידי שימוש בחומר הטבעת הפרפין, שנבחר בשל אילוצי זמן. הטמעת צלולואידין שומרת טוב יותר על שלמות התאים בדגימות אוטופתולוגיות, אך לוקח חודשים להתקשות7. לבסוף, פרוטוקול זה עדיין דורש זמן משמעותי והשקעת משאבים. השימוש במיקרו-מסור יהלום הוא עלות נוספת לחומרים הנדרשים להכנת עצם טמפורלית מסורתית, ו-7-10 הימים הנדרשים לתיקום עדיין ארוכים. בעתיד, ייתכן שניתן יהיה לשלב שיטות אלה עם דקדוק בסיוע מיקרוגל14 כדי לקצר עוד יותר את הזמן הנדרש לעיבוד.

למרות מגבלותיו, הפרוטוקול לעיבוד עצם טמפורלית במהירות גבוהה המתואר כאן מציע כלי נוסף לחקר הפתולוגיה של האוזן התיכונה, ואולי גם האוזן הפנימית. טכניקה זו הייתה שימושית במהלך מגיפת COVID-19 ועשויה גם להפחית את העלויות הכרוכות בשמירה על מעבדת עצם טמפורלית פעילה על ידי הפחתת הזמן והעבודה הדרושים לעיבוד רקמות. מחקר העצמות הטמפורליות ירד בפופולריות בארצות הברית, וירד מ-28 מעבדות פעילות בשנות ה-80 ל-4 מעבדות פעילות בלבד כיום4. ירידה זו במספר מעבדות העצמות הרקתיות התפעוליות עשויה להיות קשורה לעלויות המשמעותיות הכרוכות בקטיף ועיבוד עצמות טמפורליות 4,8. כתוצאה מכך, חשוב כי אנו שואפים לפתח טכניקות המפחיתות את המשאבים הדרושים לעיבוד עצם טמפורלית וגם את אלה המאפשרות מחקר של פתולוגיית עצם טמפורלית בהקשרים חדשים, כגון מגיפת COVID-19. יתר על כן, עיבוד רקמות במהירות גבוהה, כמו זה המתואר בפרוטוקול זה, עשוי לסייע בשימוש בטכניקות ביולוגיות חדשות (למשל, אימונוהיסטוכימיה, תעתיק) המאפשרות הערכה של פתולוגיה של האוזן התיכונה והפנימית ברמה המולקולרית 15,16,17,18,19 . בקושי גירדנו את פני השטח במונחים של שימוש בטכניקות מולקולריות לחקר רקמות אנושיות במחלות אוטולוגיות, והן עשויות לספק תובנות חשובות שלא ניתן לספק על ידי מודלים של בעלי חיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר עליהם.

Acknowledgments

אנו מודים למוחמד להאר על עזרתו בפרויקט זה. עבודה זו נתמכה באופן חלקי על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (T32DC000027, NSA).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-ACE-2 Antibody (1:50 applied dilution) Novus Biologicals SN0754
Anti-Furin Antibody (1:250 dilution) Abcam EPR 14674
Anti-TMPRSS2 Antibody (1:1,000 dilution) Novus Biologicals NBP1-20984
BX43 Manual System Microscope Olympus Life Science Solutions
CBN/Diamond Hybrid Wafering Blade Pace Technologies WB-007GP
Collin Mallet - 8'' Surgical Mart SM1517
DS-Fi3 Microscope Camera Nikon
Dual Endogenous Enzyme Block (commercial blocking solution) Dako S2003
Eaosin Stain Sigma-Aldrich 548-24-3
Formalin solution, neutral buffered 10% Sigma-Aldrich HT501128
Formical-4 Decalcifier (formic acid decalcifying solution) StatLab 1214-1 GAL
Hematoxylin Stain Sigma-Aldrich H9627
HRP-Conjugated Anti-Rabbit Secondary Antibody (1:100 dilution) Leica Biosystems PV6119
ImmPRESS HRP Horse Anti-Goat igG Detection Kit, Peroxidase (1:100 dilution) Vector Laboratories MP-7405
Lambotte Osteotome Surgical Mart SM1553
Metallographic PICO 155P Precision Saw Pace Technologies PICO 155P microsaw
NIS Elements Software Version 4.6 Nikon
Paraplast Plus Sigma-Aldrich P3683 paraffin
Positive Charged Microscope Slides with White Frosted End Walter Products 1140B15
Thermo Shandon Crytome FSE Cryostat Microtome New Life Scientific Inc. A78900104 cryotome
Triology Pretreatment Solution (commercial pretreatment solution) Sigma-Aldrich 920P-05
Xylene Sigma-Aldrich 920P-05

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nogueira, J. F., et al. A brief history of otorhinolaryngology: Otology, laryngology and rhinology. Brazilian Journal of Otorhinolaryngology. 73 (5), 693-703 (2007).
  2. Pappas, D. G. Otology through the ages. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 114 (2), 173-196 (1996).
  3. Schuknecht, H. F. Otopathology: The past, present, and future. Auris Nasus Larynx. 23, 43-45 (1996).
  4. Monsanto, R. D. C., Pauna, H. F., Paparella, M. M., Cureoglu, S. Otopathology in the United States: History, current situation, and future perspectives. Otology & Neurotology. 39 (9), 1210-1214 (2018).
  5. Crowe, S. J., Guild, S. R., Polvogt, L. M. Observations on the pathology of high-tone deafness. Journal of Nervous and Mental Disease. 80, 480 (1934).
  6. Andresen, N. S., et al. Insights into presbycusis from the first temporal bone laboratory within the United States. Otology & Neurotology. 43 (3), 400-408 (2022).
  7. Schuknecht, H. Pathology of the Ear. , Lea and Febiger. Philadelphia, PA. (1993).
  8. Chole, R. A. Labs in crisis: Protecting the science--and art--of otopathology. Otology & Neurotology. 31 (4), 554-556 (2010).
  9. Nager, G. T. Pathology of the Ear and Temporal Bone. , Williams and Wilkins. Baltimore, MD. (1993).
  10. COVID-19 Personal Protective Equipment (PPE). , Available from: https://www.cdc.gov/niosh/emres/2019_ncov_ppe.html (2022).
  11. Essalmani, R., et al. Distinctive roles of Furin and TMPRSS2 in SARS-CoV-2 infectivity. Journal of Virology. 96 (8), 0012822 (2022).
  12. Ueha, R., Kondo, K., Kagoya, R., Shichino, S., Yamasoba, T. ACE2, TMPRSS2, and Furin expression in the nose and olfactory bulb in mice and humans. Rhinology. 59 (1), 105-109 (2021).
  13. Frazier, K. M., Hooper, J. E., Mostafa, H. H., Stewart, C. M. SARS-CoV-2 virus isolated from the mastoid and middle ear: Implications for COVID-19 precautions during ear surgery. JAMA Otolaryngology - Head & Neck Surgery. 146 (10), 964-966 (2020).
  14. Cunningham, C. D., Schulte, B. A., Bianchi, L. M., Weber, P. C., Schmiedt, B. N. Microwave decalcification of human temporal bones. Laryngoscope. 111 (2), 278-282 (2001).
  15. Stephenson, R., et al. Immunohistochemical location of Na+, K+-ATPase α1 subunit in the human inner ear. Hearing Research. 400, 108113 (2021).
  16. McCall, A. A., et al. Extralabyrinthine manifestations of DFNA9. Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 12 (2), 141-149 (2011).
  17. Wu, P. Z., O'Malley, J. T., de Gruttola, V., Liberman, M. C. Age-related hearing loss is dominated by damage to inner ear sensory cells, not the cellular battery that powers them. The Journal of Neuroscience. 40 (33), 6357-6366 (2020).
  18. Miller, M. E., Lopez, I. A., Linthicum, F. H., Ishiyama, A. Connexin 26 immunohistochemistry in temporal bones with cochlear otosclerosis. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 127 (8), 536-542 (2018).
  19. Lopez, I. A., et al. Immunohistochemical techniques for the human inner ear. Histochemistry and Cell Biology. 146 (4), 367-387 (2016).

Tags

אימונולוגיה וזיהום גיליון 183
חתך עצמות טמפורליות אנושיות במהירות גבוהה להערכת פתולוגיה של האוזן התיכונה הקשורה ל-COVID-19
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Andresen, N. S., Wood, M. K.,… More

Andresen, N. S., Wood, M. K., Čiháková, D., Stewart, C. M. High-Speed Human Temporal Bone Sectioning for the Assessment of COVID-19-Associated Middle Ear Pathology. J. Vis. Exp. (183), e64012, doi:10.3791/64012 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter