Summary
Denna artikel beskriver en teknik för snabb mänsklig temporal bensektionering som använder en mikrosåg med dubbla diamantblad för att generera tunna skivor för snabb avkalkning och analys av temporal benimmunhistokemi.
Abstract
Histopatologisk analys av mänskliga temporala bensektioner är en grundläggande teknik för att studera inre och mellanörats patologi. Temporala bensektioner framställs genom temporal benskörd efter döden, fixering, avkalkning, inbäddning och färgning. På grund av det temporala benets densitet är avkalkning en tidskrävande och resurskrävande process; fullständig vävnadsberedning kan ta 9-10 månader i genomsnitt. Detta bromsar otopatologisk forskning och hindrar tidskänsliga studier, såsom de som är relevanta för COVID-19-pandemin. Detta dokument beskriver en teknik för snabb beredning och avkalkning av temporala bensektioner för att påskynda vävnadsbehandling.
Temporala ben skördades postmortem med hjälp av standardtekniker och fixerades i 10% formalin. En precisionsmikrosåg med dubbla diamantblad användes för att skära varje sektion i tre tjocka sektioner. Tjocka temporala bensektioner avkalkades sedan i avkalkningslösning i 7-10 dagar innan de inbäddades i paraffin, delades i tunna (10 μm) sektioner med hjälp av ett kryotom och monterades på oladdade bilder. Vävnadsprover deparaffiniserades sedan och rehydrerades för antikroppsfärgning (ACE2, TMPRSS2, Furin) och avbildades. Denna teknik minskade tiden från skörd till vävnadsanalys från 9-10 månader till 10-14 dagar. Höghastighets temporal bensektionering kan öka hastigheten på otopatologisk forskning och minska de resurser som krävs för vävnadsberedning, samtidigt som de underlättar tidskänsliga studier som de som är relaterade till COVID-19.
Introduction
Mänsklig temporal benforskning ger en ovärderlig resurs för att studera patologin och patofysiologin i inner- och mellanörat. Före 19-talet var lite känt om otologisk sjukdom 1,2,3. För att bättre förstå otologisk sjukdom och "rädda ljudkirurgi från händerna på kvacksalvare" utvecklade Joseph Toynbee (1815-1866) metoder för att studera histologiska delar av det mänskliga temporala benet3. Detta arbete främjades av Adam Politzer (1835-1920) i Wien och andra över hela Europa under resten av 19-talet, som använde temporala bensektioner för att beskriva histopatologin för många vanliga tillstånd som påverkar örat 2,3,4.
Det första mänskliga temporala benlaboratoriet i USA öppnades 1927 på Johns Hopkins Hospital, där Stacy Guild (1890-1966) utvecklade metoder för temporal bensnittning 5,6. Metoderna som utvecklades av Guild bestod av en 9-10 månaders process som inkluderade skörd efter döden, fixering, avkalkning i salpetersyra, uttorkning i etanol, celloidinbäddning, sektionering, färgning och montering. Modifieringar av denna teknik gjordes senare av Harold Schuknecht (1917-1996)7; De grundläggande komponenterna i denna process förblir emellertid väsentligen oförändrade.
De betydande resurser som krävs för att upprätthålla ett temporalt benlaboratorium har inneburit en utmaning för temporal benforskning och sannolikt bidragit till dess minskande popularitet under de senaste 30 åren 4,8. En betydande del av temporala benlaboratoriets resurser måste ägnas åt 9-10 månaders process för temporal benberedning. Ett av de mest tidskrävande stegen i beredningen är avkalkningen av det temporala benet, vilket är det tätaste benet i människokroppen. Avkalkning utförs vanligtvis i salpetersyra eller etylendiamintetraättiksyra (EDTA) och tar veckor till månader samtidigt som det kräver frekvent byte av lösningar 7,9. Vidare kan tidskänsliga studier av det mänskliga örat, såsom de som är relaterade till COVID-19-pandemin, hindras av denna långsamma förberedelseprocess. Detta dokument beskriver en teknik för höghastighets temporal bensektionering som använder en diamantmikrosåg för att generera tjocka sektioner som möjliggör snabb avkalkning och vävnadsanalys inom 10-14 dagar efter tidsmässig benskörd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Detta protokoll utvecklades med IRB (IRB00250002) godkännande och i enlighet med institutionella policyer för användning av mänsklig vävnad och smittsamt material. Varje tidsbestämd bendonator gav skriftligt samtycke före döden, eller samtycke erhölls postumt från donatorns familj. Se materialförteckningen för mer information om allt material, utrustning och programvara som används i detta protokoll.
1. Tidsmässig benskörd
- Få godkännande från den lokala institutionella granskningsnämnden (IRB), granska institutionella policyer för användning av mänskligt och smittsamt material och få samtycke till vävnadsdonation innan du använder detta protokoll.
- Ta på dig rätt personlig skyddsutrustning (PPE) innan du arbetar med vävnad från COVID-19-positiva temporala bendonatorer. Se till att PPE består av en N-95 andningsskydd och ansiktsskydd (eller alternativt ett luftreningssystem med positivt tryck), klänning och två par handskar. Granska tekniker för att korrekt ta på och doffa PPE innan du börjar detta protokoll10.
- Skörda temporal benvävnad inom 12-24 timmar efter donatordöd. Om kroppen inte är kyld, se till att skörden sker inom 8 timmar efter döden.
- Skörda temporala ben under obduktion med hjälp av fyrsnitt, blockmetoden med osteotom7.
- Efter kraniotomi, ta bort hjärnan och dela kranialnerven kraftigt till den inre hörselgången.
- Gör det första beniga snittet med osteotomet parallellt med och bara medialt till skivepiteldelen av det temporala benet.
- Utför det andra beniga snittet parallellt med det första vid det tidiga benets mediala kant.
- Gör sedan det tredje snittet 3-4 cm främre och parallellt med petrousryggen.
- Gör det fjärde snittet ungefär parallellt med det tredje, 2 cm bakom petrousryggen.
OBS: Se till att alla snitt sträcker sig genom skallbasen. - Ta sedan bort det temporala benet med skarp dissektion för att frigöra mjukvävnadsfästet längs provets underlägsna kant. Om balsamering ska utföras efter tidsmässig benskörd, bind av stubben i halspulsådern.
- Skörda temporala ben under obduktion med hjälp av fyrsnitt, blockmetoden med osteotom7.
2. Vävnadsfixering, avkalkning och sektionering
- Placera omedelbart vävnaden i 200-300 ml 10% buffrat formalin (formaldehyd) så att vävnaden är helt nedsänkt. Lämna vävnaden i formaldehyd i minst 72 timmar vid rumstemperatur och byt lösningarna dagligen. Förvara vävnaden i en lufttät behållare och utför lösningsbyten under en dragskåp medan du bär lämplig personlig skyddsutrustning för att förhindra virusspridning.
OBS: Efter fixeringsperioden på 72 timmar behöver proverna inte längre betraktas som smittsamma. - Använd en precisionsmikrosåg med dubbla diamantblad för att skära varje prov i tre "tjocka" sektioner för att möjliggöra snabbare vävnadsavkalkning. Ställ in de dubbla diamantbladen på ett avstånd av 5 mm, så att den centrala delen av det temporala benet är 5 mm tjockt. Se till att vävnadssektionerna i vardera änden är 3-5 mm tjocka.
- Placera de tjocka sektionerna i 200-300 ml 23% w / w myrsyraavkalkningslösning i 7-10 dagar vid rumstemperatur tills vävnaden är tillräckligt mjuk för paraffininbäddning. Ändra lösningarna dagligen. Kontrollera om det finns tillräcklig vävnadsavkalkning genom att palpera provet, som ska kännas mjukt.
OBS: Avkalkning kan också verifieras med röntgen. - Skölj proverna i rinnande kranvatten i 24 timmar genom att placera dem i en stor bägare under en rinnande kran.
- Dehydrera vävnaden i en serie alkoholer med ökande koncentration7. Sänk ner vävnaden i 100-200 ml 70% etanol i 1,5 h, följt av tre tvättar i 95% respektive 100% etanol för 1,5 h vardera. Tvätta sedan vävnaden 3 x 1,5 h i Xylen.
- Bädda in de tjocka sektionerna i paraffin, med fyra behandlingar på 45 min vardera.
- Använd ett kryotom för att skära tunna (10 μm) sektioner. Placera vävnaden så att vävnaden skärs i axialplanet. Skär tjockare (20 μm) sektioner om så önskas.
3. Immunohistokemi och avbildning
- Om traditionell hematoxylin- och eosinfärgning önskas (beskrivs inte här), utför färgning innan du monterar sektionerna på glasskivor7.
- Montera sektionerna på positivt laddade glasskivor.
- Grädda diabilderna på en kokplatta vid 60 °C i 20 min.
- Placera objekten i en hållare och sänk ner dem i en kommersiell förbehandlingslösning som innehåller ett organiskt lösningsmedel (dietanolamin i detta fall) och etanol för att deparaffinera, rehydrera och avslöja vävnaden.
OBS: Detta steg är nödvändigt för att uppnå tillfredsställande resultat med immunohistokemi för formalinfixerad och paraffininbäddad vävnad. - Värm utstrykarna i en tryckkokare på högt tryck i 20 min.
- Placera bilderna i en fuktad kammare och blockera vävnaden med en kommersiell blockeringslösning.
- Undersök vävnadssektionerna med den primära antikroppen mot angiotensinkonverterande enzym 2 (ACE2; 1:50), transmembranproteas serin 2 (TMPRSS2, 1:1 000) och Furinproteaset (1:250).
OBS: ACE2-, TMPRSS2- och Furin-antikropparna används eftersom dessa proteiner tros spela en roll i SARS-CoV-2-smittsamhet11,12, och detta protokoll försökte undersöka de möjliga mekanismerna genom vilka SARS-CoV-2 kan infektera mellanörat13. - Behandla med HRP-konjugerad anti-kanin sekundär antikropp (ACE2, Furin; 1:100 utspädning) eller anti-get (TMPRSS2, 1:100 utspädning) sekundär antikropp.
- Motfärga bilderna med 70% hematoxylin i vatten.
- Skaffa bilder på ett ljusmikroskop med en monterad digitalkamera. Få bilder av mellanörat slemhinna och Eustachian rör vid 20x respektive 10x förstoring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hematoxylin- och eosinfärgning av mellanörats slemhinna och Eustachian-röret visade bevarande av mellanörat slemhinna och submukosal mellanöravävnad efter bearbetning (Figur 1). Immunohistokemiska bilder visade uttryck av ACE2-, TMPRSS2- och Furin-proteinerna i mellanörats slemhinna och Eustachian-röret (figur 1). Närvaron av dessa proteiner i mellanörat ger en möjlig väg genom vilken SARS-CoV-2 kan infektera andningsepitelet i mellanörat 11,12,13. Vidare kan uttrycket av dessa proteiner i Eustachian-röret förklara en väg genom vilken viruset kommer in i mellanörat och reser till mellanörat från nasofarynx via Eustachian-röret.
Figur 1: Exempel på färgad mellanörevävnad. Figuren visar hematoxylin och eosin, ACE2, TMPRSS2 och Furin färgning av mellanörat slemhinna (övre raden, 20x förstoring) och Eustachian rör (nedre raden, 10x förstoring). Skalstänger = 50 μm (översta raden); 100 μm (nedre raden). Förkortningar: H&E = hematoxylin och eosin; angiotensinkonverterande enzym 2; TMPRSS2 = transmembranproteas, serin 2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Mänsklig temporal benforskning är avgörande för att studera inre och mellanörats patologi men är fortfarande en tids- och resurskrävande strävan. Detta papper beskriver en teknik som använder en diamantmikrosåg för att generera tjocka temporala bensektioner som snabbt kan avkalkas innan ytterligare sektionering så att tiden från vävnadsskörd till studie kan minskas från 9-10 månader till 10-14 dagar. Denna teknik kan minska de resurser som krävs för temporal benbehandling och underlätta tidskänsliga studier, såsom de som är relaterade till COVID-19 mellan- och inneröratpatologi13, vilket var motivationen för att utveckla detta protokoll. Detta protokoll möjliggjorde visualisering av ACE2-, TMPRS22- och Furin-uttryck i mellanörat och Eustachian-röret, vilket ger en trolig mekanism genom vilken SARS-CoV-2 kan infektera mellanörat genom att sprida sig från nasofarynx genom Eustachian-röret.
Den primära innovationen i detta protokoll är användningen av en diamantsåg som skär vävnaden före avkalkning, vilket genererar "tjocka" delar av temporalbenet som snabbt kan avkalkas genom att öka ytan på vävnaden som utsätts för avkalkningsmedlet. Detta steg gör det möjligt för vävnadsavkalkning att ske inom 7-10 dagar istället för de 1-2 månader som traditionella protokoll kan kräva för avkalkning. De "tjocka" delarna av vävnaden som skapas med diamantsågen kan också dehydreras snabbare än ett standardblock av temporal benvävnad, vilket minskar tiden mellan avkalkning och inbäddning. Vidare använder detta protokoll paraffin som ett inbäddningsmedel snarare än celloidin, vilket tar cirka 3 månader att härda7. Medan celloidin ger överlägsen bevarande av cochleära strukturer, härdar paraffin mycket snabbare och underlättar immunfärgning. Med dessa modifieringar kan temporal benvävnad bearbetas på 10-14 dagar i motsats till de 9-10 månader som krävs i mer traditionella bearbetningsstrategier 7,9.
Detta protokoll har flera begränsningar. Att skära vävnaden med diamantsågen före inbäddning riskerar att skada Cortis organ (OOC). OOC skadades allvarligt i de flesta exemplar under utvecklingen av denna teknik, vilket kan begränsa värdet av denna teknik för att studera patologier som åldersrelaterad hörselnedsättning, där det är viktigt att de känsliga strukturerna i innerörat bevaras. Det kan vara möjligt att placera provet så att diamantsågen inte direkt skär genom det otiska kapselbenet och bevarar innerörats strukturer, men detta förblir ett område för aktiv undersökning. Djurmodeller kan ge ett värdefullt verktyg för att ytterligare förfina detta protokoll och öka chansen att bevara inre öronstrukturer i dessa värdefulla mänskliga exemplar. Vävnadskvaliteten i detta protokoll begränsas dessutom av användningen av paraffininbäddningsmedlet, som valdes på grund av tidsbegränsningar. Celloidinbäddning upprätthåller bättre cellulär integritet i otopatologiska prover men tar månader att härda7. Slutligen kräver detta protokoll fortfarande betydande tids- och resursinvesteringar. Användningen av en diamantmikrosåg är en extra kostnad för de material som krävs för traditionell temporal benberedning, och de 7-10 dagar som krävs för avkalkning är fortfarande långa. I framtiden kan det vara möjligt att kombinera dessa metoder med mikrovågsassisterad avkalkning14 för att ytterligare förkorta den tid som krävs för bearbetning.
Trots dess begränsningar erbjuder protokollet för höghastighets temporal benbehandling som beskrivs här ett annat verktyg för att studera mellanörat och potentiellt inre örat, patologi. Denna teknik har varit användbar under COVID-19-pandemin och kan också minska kostnaderna för att upprätthålla ett aktivt temporalt benlaboratorium genom att minska den tid och det arbete som krävs för vävnadsbehandling. Temporal benforskning har minskat i popularitet i USA och minskat från 28 aktiva laboratorier på 1980-talet till endast 4 aktiva laboratorier för närvarande4. Denna minskning av antalet verksamma temporala benlaboratorier kan vara relaterad till de betydande kostnaderna för skörd och bearbetning av temporala ben 4,8. Följaktligen är det viktigt att vi strävar efter att utveckla tekniker som minskar de resurser som krävs för temporal benbehandling och även de som möjliggör studier av temporal benpatologi i nya sammanhang, såsom COVID-19-pandemin. Vidare kan höghastighetsvävnadsbehandling, såsom den som beskrivs i detta protokoll, underlätta användningen av nya biologiska tekniker (t.ex. immunohistokemi, transkriptomik) som möjliggör bedömning av mellan- och innerörats patologi på molekylär nivå 15,16,17,18,19 . Vi har knappt skrapat på ytan när det gäller att använda molekylära tekniker för att studera mänsklig vävnad vid otologisk sjukdom, och de kan ge viktiga insikter som inte kan tillhandahållas av djurmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att deklarera.
Acknowledgments
Vi tackar Mohamed Lehar för hans hjälp med detta projekt. Detta arbete stöddes delvis av National Institutes of Health (T32DC000027, NSA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-ACE-2 Antibody (1:50 applied dilution) | Novus Biologicals | SN0754 | |
| Anti-Furin Antibody (1:250 dilution) | Abcam | EPR 14674 | |
| Anti-TMPRSS2 Antibody (1:1,000 dilution) | Novus Biologicals | NBP1-20984 | |
| BX43 Manual System Microscope | Olympus Life Science Solutions | ||
| CBN/Diamond Hybrid Wafering Blade | Pace Technologies | WB-007GP | |
| Collin Mallet - 8'' | Surgical Mart | SM1517 | |
| DS-Fi3 Microscope Camera | Nikon | ||
| Dual Endogenous Enzyme Block (commercial blocking solution) | Dako | S2003 | |
| Eaosin Stain | Sigma-Aldrich | 548-24-3 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Formical-4 Decalcifier (formic acid decalcifying solution) | StatLab | 1214-1 GAL | |
| Hematoxylin Stain | Sigma-Aldrich | H9627 | |
| HRP-Conjugated Anti-Rabbit Secondary Antibody (1:100 dilution) | Leica Biosystems | PV6119 | |
| ImmPRESS HRP Horse Anti-Goat igG Detection Kit, Peroxidase (1:100 dilution) | Vector Laboratories | MP-7405 | |
| Lambotte Osteotome | Surgical Mart | SM1553 | |
| Metallographic PICO 155P Precision Saw | Pace Technologies | PICO 155P | microsaw |
| NIS Elements Software Version 4.6 | Nikon | ||
| Paraplast Plus | Sigma-Aldrich | P3683 | paraffin |
| Positive Charged Microscope Slides with White Frosted End | Walter Products | 1140B15 | |
| Thermo Shandon Crytome FSE Cryostat Microtome | New Life Scientific Inc. | A78900104 | cryotome |
| Triology Pretreatment Solution (commercial pretreatment solution) | Sigma-Aldrich | 920P-05 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 920P-05 |
References
- Nogueira, J. F., et al. A brief history of otorhinolaryngology: Otology, laryngology and rhinology. Brazilian Journal of Otorhinolaryngology. 73 (5), 693-703 (2007).
- Pappas, D. G.
- Schuknecht, H. F. Otopathology: The past, present, and future. Auris Nasus Larynx. 23, 43-45 (1996).
- Monsanto, R. D. C., Pauna, H. F., Paparella, M. M., Cureoglu, S. Otopathology in the United States: History, current situation, and future perspectives. Otology & Neurotology. 39 (9), 1210-1214 (2018).
- Crowe, S. J., Guild, S. R., Polvogt, L. M. Observations on the pathology of high-tone deafness. Journal of Nervous and Mental Disease. 80, 480 (1934).
- Andresen, N. S., et al. Insights into presbycusis from the first temporal bone laboratory within the United States. Otology & Neurotology. 43 (3), 400-408 (2022).
- Schuknecht, H. Pathology of the Ear. , Lea and Febiger. Philadelphia, PA. (1993).
- Chole, R. A. Labs in crisis: Protecting the science--and art--of otopathology. Otology & Neurotology. 31 (4), 554-556 (2010).
- Nager, G. T. Pathology of the Ear and Temporal Bone. , Williams and Wilkins. Baltimore, MD. (1993).
- COVID-19 Personal Protective Equipment (PPE). , Available from: https://www.cdc.gov/niosh/emres/2019_ncov_ppe.html (2022).
- Essalmani, R., et al. Distinctive roles of Furin and TMPRSS2 in SARS-CoV-2 infectivity. Journal of Virology. 96 (8), 0012822 (2022).
- Ueha, R., Kondo, K., Kagoya, R., Shichino, S., Yamasoba, T. ACE2, TMPRSS2, and Furin expression in the nose and olfactory bulb in mice and humans. Rhinology. 59 (1), 105-109 (2021).
- Frazier, K. M., Hooper, J. E., Mostafa, H. H., Stewart, C. M. SARS-CoV-2 virus isolated from the mastoid and middle ear: Implications for COVID-19 precautions during ear surgery. JAMA Otolaryngology - Head & Neck Surgery. 146 (10), 964-966 (2020).
- Cunningham, C. D., Schulte, B. A., Bianchi, L. M., Weber, P. C., Schmiedt, B. N. Microwave decalcification of human temporal bones. Laryngoscope. 111 (2), 278-282 (2001).
- Stephenson, R., et al. Immunohistochemical location of Na+, K+-ATPase α1 subunit in the human inner ear. Hearing Research. 400, 108113 (2021).
- McCall, A. A., et al.
- Wu, P. Z., O'Malley, J. T., de Gruttola, V., Liberman, M. C. Age-related hearing loss is dominated by damage to inner ear sensory cells, not the cellular battery that powers them. The Journal of Neuroscience. 40 (33), 6357-6366 (2020).
- Miller, M. E., Lopez, I. A., Linthicum, F. H., Ishiyama, A. Connexin 26 immunohistochemistry in temporal bones with cochlear otosclerosis. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 127 (8), 536-542 (2018).
- Lopez, I. A., et al. Immunohistochemical techniques for the human inner ear. Histochemistry and Cell Biology. 146 (4), 367-387 (2016).
