Summary
Cet article décrit une technique de section osseuse temporale humaine rapide qui utilise une micro scie à lames de diamant jumelles pour générer de fines tranches de décalcification rapide et l’analyse de l’immunohistochimie osseuse temporale.
Abstract
L’analyse histopathologique des sections osseuses temporales humaines est une technique fondamentale pour étudier la pathologie de l’oreille interne et moyenne. Les coupes osseuses temporales sont préparées par prélèvement osseux temporal post-mortem, fixation, décalcification, encastrement et coloration. En raison de la densité de l’os temporal, la décalcification est un processus long et gourmand en ressources; la préparation complète des tissus peut prendre de 9 à 10 mois en moyenne. Cela ralentit la recherche en otopathologie et entrave les études urgentes, telles que celles pertinentes pour la pandémie de COVID-19. Cet article décrit une technique de préparation et de décalcification rapides des coupes osseuses temporales pour accélérer le traitement des tissus.
Les os temporaux ont été récoltés après l’autopsie à l’aide de techniques standard et fixés dans 10% de formol. Une micro scie de précision avec deux lames diamantées a été utilisée pour couper chaque section en trois sections épaisses. Les coupes osseuses temporales épaisses ont ensuite été décalcifiées dans une solution décalcifiante pendant 7 à 10 jours avant d’être incorporées dans de la paraffine, sectionnées en sections minces (10 μm) à l’aide d’un cryotome et montées sur des lames non chargées. Les échantillons de tissus ont ensuite été déparaffinisés et réhydratés pour la coloration des anticorps (ACE2, TMPRSS2, Furin) et imagés. Cette technique a réduit le temps entre la récolte et l’analyse des tissus de 9-10 mois à 10-14 jours. La section osseuse temporale à grande vitesse peut augmenter la vitesse de la recherche en otopathologie et réduire les ressources nécessaires à la préparation des tissus, tout en facilitant les études urgentes telles que celles liées à la COVID-19.
Introduction
La recherche sur les os temporaux humains fournit une ressource inestimable pour étudier la pathologie et la physiopathologie de l’oreille interne et moyenne. Avant le 19ème siècle, on savait peu de choses sur les maladies otologiques 1,2,3. Pour mieux comprendre les maladies otologiques et « sauver la chirurgie auditive des mains des charlatans », Joseph Toynbee (1815-1866) a développé des méthodes pour étudier les sections histologiques de l’os temporal humain3. Ce travail a été poursuivi par Adam Politzer (1835-1920) à Vienne et dans d’autres à travers l’Europe pendant le reste du 19ème siècle, qui a utilisé des sections osseuses temporales pour décrire l’histopathologie de nombreuses conditions courantes affectant l’oreille 2,3,4.
Le premier laboratoire d’os temporaux humains aux États-Unis a été ouvert en 1927 à l’hôpital Johns Hopkins, où Stacy Guild (1890-1966) a développé des méthodes de section osseuse temporale 5,6. Les méthodes développées par Guild consistaient en un processus de 9 à 10 mois qui comprenait la récolte post-mortem, la fixation, la décalcification dans l’acide nitrique, la déshydratation dans l’éthanol, l’incorporation de celloïdine, le sectionnement, la coloration et le montage. Des modifications à cette technique ont ensuite été apportées par Harold Schuknecht (1917-1996)7; toutefois, les éléments de base de ce processus demeurent essentiellement inchangés.
Les ressources importantes nécessaires pour maintenir un laboratoire d’os temporal ont représenté un défi pour la recherche sur les os temporaux et ont probablement contribué à sa popularité déclinante au cours des 30 dernières années 4,8. Une partie importante des ressources du laboratoire osseux temporal doit être consacrée au processus de préparation osseuse temporale de 9 à 10 mois. L’une des étapes les plus longues de la préparation est la décalcification de l’os temporal, qui est l’os le plus dense du corps humain. La décalcification est généralement effectuée dans l’acide nitrique ou l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) et prend des semaines à des mois tout en nécessitant le changement fréquent de solutions 7,9. De plus, les études urgentes de l’oreille humaine, telles que celles liées à la pandémie de COVID-19, peuvent être entravées par ce lent processus de préparation. Cet article décrit une technique de section osseuse temporale à grande vitesse qui utilise une microsevis diamantée pour générer des sections épaisses qui permettent une décalcification rapide et une analyse tissulaire dans les 10 à 14 jours suivant la récolte osseuse temporale.
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Protocol
Ce protocole a été élaboré avec l’approbation de la CISR (IRB00250002) et conformément aux politiques institutionnelles relatives à l’utilisation de tissus humains et de matières infectieuses. Chaque donneur d’os temporel a donné son consentement écrit avant son décès, ou le consentement a été obtenu à titre posthume de la famille du donneur. Consultez le Tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, équipements et logiciels utilisés dans ce protocole.
1. Récolte osseuse temporale
- Obtenir l’approbation du conseil d’examen institutionnel local (CISR), examiner les politiques institutionnelles relatives à l’utilisation de matières humaines et infectieuses et obtenir le consentement au don de tissus avant d’utiliser ce protocole.
- Mettez un équipement de protection individuelle (EPI) approprié avant de travailler avec des tissus provenant de donneurs d’os temporaux positifs à la COVID-19. Assurez-vous que l’EPI se compose d’un respirateur N-95 et d’un écran facial (ou d’un système de purification de l’air à pression positive), d’une blouse et de deux paires de gants. Passez en revue les techniques d’enfilage et de retrait appropriés de l’EPI avant de commencer ce protocole10.
- Prélevez du tissu osseux temporal dans les 12 à 24 heures suivant le décès du donneur. Si le corps n’est pas réfrigéré, assurez-vous que la récolte a lieu dans les 8 heures suivant le décès.
- Prélever les os temporaux pendant l’autopsie en utilisant la méthode des quatre incisions, bloc par ostéotomie7.
- Après la craniotomie, retirez le cerveau et divisez brusquement les nerfs crâniens dans le conduit auditif interne.
- Faites la première incision osseuse avec l’ostéotomie parallèle et juste médiale à la partie squameuse de l’os temporal.
- Effectuez la deuxième incision osseuse parallèle à la première à la bordure médiale de l’os temporal.
- Ensuite, faites la troisième incision de 3 à 4 cm antérieure et parallèle à la crête pétreuse.
- Faites la quatrième incision à peu près parallèlement à la troisième, à 2 cm postérieure de la crête pétreuse.
REMARQUE: Assurez-vous que toutes les incisions s’étendent à travers la base du crâne. - Ensuite, retirez l’os temporal à l’aide d’une dissection nette pour libérer l’attache des tissus mous le long du bord inférieur de l’échantillon. Si l’embaumement doit être effectué après la récolte osseuse temporale, attacher le moignon de l’artère carotide.
- Prélever les os temporaux pendant l’autopsie en utilisant la méthode des quatre incisions, bloc par ostéotomie7.
2. Fixation, décalcification et sectionnement des tissus
- Placez immédiatement le tissu dans 200-300 mL de formol tamponné à 10% (formaldéhyde) afin que le tissu soit complètement immergé. Laisser le tissu dans du formaldéhyde pendant au moins 72 h à température ambiante, en changeant les solutions quotidiennement. Conservez le tissu dans un récipient hermétique et effectuez des changements de solution sous une hotte tout en portant un EPI approprié pour prévenir la propagation du virus.
REMARQUE: Après la période de fixation de 72 heures, les échantillons n’ont plus besoin d’être considérés comme infectieux. - Utilisez une micro scie de précision avec deux lames diamantées pour couper chaque spécimen en trois sections « épaisses » afin de permettre une décalcification tissulaire plus rapide. Réglez les lames jumelles diamantées à une distance de 5 mm, de sorte que la section centrale de l’os temporal ait une épaisseur de 5 mm. Assurez-vous que les sections de tissu à chaque extrémité ont une épaisseur de 3 à 5 mm.
- Placer les sections épaisses dans 200-300 mL de solution décalcifiante d’acide formique à 23% p / p pendant 7 à 10 jours à température ambiante, jusqu’à ce que le tissu soit suffisamment mou pour l’incorporation de paraffine. Changez les solutions quotidiennement. Vérifiez la décalcification adéquate des tissus en palpant l’échantillon, qui devrait être doux.
REMARQUE: La décalcification peut également être vérifiée par rayons X. - Rincez les spécimens dans l’eau courante du robinet pendant 24 h en les plaçant dans un grand bécher sous un robinet qui coule.
- Déshydratez le tissu dans une série d’alcools de concentration croissante7. Immergez le tissu dans 100 à 200 mL d’éthanol à 70 % pendant 1,5 h, puis trois lavages dans de l’éthanol à 95 % et 100 % pendant 1,5 h chacun, respectivement. Ensuite, lavez le mouchoir 3 x 1,5 h dans du xylène.
- Incorporer les sections épaisses dans de la paraffine, avec quatre traitements de 45 min chacun.
- Utilisez un cryotome pour couper des sections minces (10 μm). Positionnez le tissu de manière à ce qu’il soit coupé dans le plan axial. Couper des sections plus épaisses (20 μm) si désiré.
3. Immunohistochimie et imagerie
- Si une coloration traditionnelle à l’hématoxyline et à l’éosine est souhaitée (non décrite ici), effectuez une coloration avant de monter les sections sur des lames de verre7.
- Montez les sections sur des lames de verre chargées positivement.
- Cuire les lames sur une plaque chauffante à 60 °C pendant 20 min.
- Placez les lames dans un support et immergez-les dans une solution de prétraitement commerciale contenant un solvant organique (diéthanolamine dans ce cas) et de l’éthanol pour déparaffiniser, réhydrater et démasquer le tissu.
REMARQUE: Cette étape est nécessaire pour obtenir des résultats satisfaisants avec l’immunohistochimie pour les tissus fixés au formol et incorporés à la paraffine. - Chauffer les lames dans un autocuiseur à haute pression pendant 20 min.
- Placez les lames dans une chambre humidifiée et bloquez le tissu avec une solution de blocage commerciale.
- Sondez les coupes tissulaires avec l’anticorps primaire contre l’enzyme de conversion de l’angiotensine 2 (ACE2; 1:50), la sérine 2 de la protéase transmembranaire (TMPRSS2, 1:1 000) et la protéase furine (1:250).
REMARQUE: Les anticorps ACE2, TMPRSS2 et Furin sont utilisés parce que ces protéines sont censées jouer un rôle dans l’infectiosité du SARS-CoV-211,12, et ce protocole a cherché à étudier les mécanismes possibles par lesquels le SARS-CoV-2 peut infecter l’oreille moyenne13. - Traiter avec un anticorps secondaire anti-lapin conjugué HRP (ACE2, Furin; dilution 1:100) ou anti-chèvre (TMPRSS2, dilution 1:100).
- Contre-tache les lames avec 70% d’hématoxyline dans l’eau.
- Acquérir des images sur un microscope optique avec un appareil photo numérique monté. Obtenez des images de la muqueuse de l’oreille moyenne et de la trompe d’Eustache à un grossissement de 20x et 10x, respectivement.
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Representative Results
La coloration à l’hématoxyline et à l’éosine de la muqueuse de l’oreille moyenne et de la trompe d’Eustache a montré une préservation de la muqueuse de l’oreille moyenne et du tissu sous-muqueux de l’oreille moyenne après traitement (figure 1). Les images immunohistochimiques ont montré l’expression des protéines ACE2, TMPRSS2 et Furin dans la muqueuse de l’oreille moyenne et la trompe d’Eustache (Figure 1). La présence de ces protéines dans l’oreille moyenne fournit une voie possible par laquelle le SRAS-CoV-2 peut infecter l’épithélium respiratoire dans l’oreille moyenne 11,12,13. En outre, l’expression de ces protéines dans la trompe d’Eustache peut expliquer une voie par laquelle le virus pénètre dans l’oreille moyenne, se déplaçant vers l’oreille moyenne du nasopharynx via la trompe d’Eustache.
Figure 1 : Exemple de tissu de l’oreille moyenne taché. La figure montre la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine, à l’ACE2, au TMPRSS2 et à la furine de la muqueuse de l’oreille moyenne (rangée supérieure, grossissement 20x) et de la trompe d’Eustache (rangée inférieure, grossissement 10x). Barres d’échelle = 50 μm (rangée du haut); 100 μm (rangée du bas). Abréviations : H&E = hématoxyline et éosine ; enzyme de conversion de l’angiotensine 2; TMPRSS2 = protéase transmembranaire, sérine 2. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
La recherche sur les os temporaux humains est essentielle pour étudier la pathologie de l’oreille interne et moyenne, mais reste une entreprise exigeante en temps et en ressources. Cet article décrit une technique qui utilise une microse à diamant pour générer des coupes osseuses temporales épaisses qui peuvent être rapidement décalcifiées avant d’autres coupes afin que le temps entre la récolte des tissus et l’étude puisse être réduit de 9-10 mois à 10-14 jours. Cette technique peut réduire les ressources nécessaires au traitement osseux temporal et faciliter les études urgentes, telles que celles liées à la pathologie de l’oreille moyenne et interneCOVID-19 13, ce qui a motivé le développement de ce protocole. Ce protocole a permis de visualiser l’expression de l’ACE2, du TMPRS22 et de furin dans l’oreille moyenne et la trompe d’Eustache, fournissant un mécanisme probable par lequel le SARS-CoV-2 peut infecter l’oreille moyenne en se propageant du nasopharynx à travers la trompe d’Eustache.
La principale innovation de ce protocole est l’utilisation d’une scie à diamant qui coupe le tissu avant la décalcification, ce qui génère des sections « épaisses » d’os temporal qui peuvent être rapidement décalcifiées en augmentant la surface du tissu exposé à l’agent décalcifiant. Cette étape permet à la décalcification des tissus de se produire dans les 7-10 jours au lieu des 1-2 mois que les protocoles traditionnels peuvent exiger pour la décalcification. Les sections « épaisses » de tissu créées avec la scie à diamant peuvent également être déshydratées plus rapidement qu’un bloc standard de tissu osseux temporal, réduisant ainsi le temps entre la décalcification et l’incorporation. De plus, ce protocole utilise la paraffine comme agent d’incorporation plutôt que la celloïdine, qui prend environ 3 mois pour durcir7. Alors que la celloïdine assure une préservation supérieure des structures cochléaires, la paraffine durcit beaucoup plus rapidement et facilite l’immunocoloration. Avec ces modifications, le tissu osseux temporal peut être traité en 10-14 jours au lieu des 9-10 mois requis dans les stratégies de traitement plus traditionnelles 7,9.
Ce protocole a plusieurs limitations. Couper le tissu avec la scie à diamant avant d’encastrer risque d’endommager l’organe de Corti (OOC). L’OOC a été gravement endommagé dans la plupart des échantillons au cours du développement de cette technique, ce qui peut limiter la valeur de cette technique pour l’étude de pathologies telles que la perte auditive liée à l’âge, où il est essentiel que les structures délicates de l’oreille interne soient préservées. Il peut être possible de positionner l’échantillon de manière à ce que la scie à diamant ne coupe pas directement à travers l’os de la capsule otique et préserve les structures de l’oreille interne, mais cela reste une zone d’investigation active. Les modèles animaux peuvent fournir un outil précieux pour affiner davantage ce protocole et augmenter les chances de préserver les structures de l’oreille interne dans ces précieux spécimens humains. La qualité des tissus dans ce protocole est en outre limitée par l’utilisation de l’agent d’incorporation de paraffine, qui a été sélectionné en raison de contraintes de temps. L’incorporation de celloïdine maintient mieux l’intégrité cellulaire dans les échantillons otopathologiques, mais prend des mois à durcir7. Enfin, ce protocole nécessite encore beaucoup de temps et de ressources. L’utilisation d’une microse à diamant est un coût supplémentaire par rapport aux matériaux nécessaires à la préparation osseuse temporale traditionnelle, et les 7 à 10 jours nécessaires à la décalcification sont encore longs. À l’avenir, il sera peut-être possible de combiner ces méthodes avec la décalcification assistée par micro-ondes14 afin de raccourcir davantage le temps nécessaire au traitement.
Malgré ses limites, le protocole de traitement osseux temporal à grande vitesse décrit ici offre un autre outil pour étudier la pathologie de l’oreille moyenne et potentiellement de l’oreille interne. Cette technique a été utile pendant la pandémie de COVID-19 et peut également réduire les coûts associés au maintien d’un laboratoire osseux temporal actif en réduisant le temps et la main-d’œuvre nécessaires au traitement des tissus. La recherche sur les os temporaux a perdu en popularité aux États-Unis, passant de 28 laboratoires actifs dans les années 1980 à seulement 4 laboratoires actifs à l’heure actuelle4. Cette baisse du nombre de laboratoires d’os temporaux en activité peut être liée aux coûts importants associés à la récolte et au traitement des os temporaux 4,8. Par conséquent, il est important que nous visions à développer des techniques qui réduisent les ressources nécessaires au traitement osseux temporal et aussi celles qui permettent l’étude de la pathologie osseuse temporale dans de nouveaux contextes, tels que la pandémie de COVID-19. De plus, le traitement tissulaire à grande vitesse, tel que celui décrit dans le présent protocole, peut faciliter l’utilisation de nouvelles techniques biologiques (p. ex. immunohistochimie, transcriptomique) qui permettent d’évaluer la pathologie de l’oreille moyenne et interne au niveau moléculaire 15,16,17,18,19 . Nous avons à peine effleuré la surface en termes d’utilisation de techniques moléculaires pour étudier les tissus humains dans les maladies otologiques, et elles peuvent fournir des informations importantes qui ne peuvent pas être fournies par des modèles animaux.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.
Acknowledgments
Nous remercions Mohamed Lehar pour son aide dans ce projet. Ce travail a été partiellement soutenu par les National Institutes of Health (T32DC000027, NSA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-ACE-2 Antibody (1:50 applied dilution) | Novus Biologicals | SN0754 | |
| Anti-Furin Antibody (1:250 dilution) | Abcam | EPR 14674 | |
| Anti-TMPRSS2 Antibody (1:1,000 dilution) | Novus Biologicals | NBP1-20984 | |
| BX43 Manual System Microscope | Olympus Life Science Solutions | ||
| CBN/Diamond Hybrid Wafering Blade | Pace Technologies | WB-007GP | |
| Collin Mallet - 8'' | Surgical Mart | SM1517 | |
| DS-Fi3 Microscope Camera | Nikon | ||
| Dual Endogenous Enzyme Block (commercial blocking solution) | Dako | S2003 | |
| Eaosin Stain | Sigma-Aldrich | 548-24-3 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Formical-4 Decalcifier (formic acid decalcifying solution) | StatLab | 1214-1 GAL | |
| Hematoxylin Stain | Sigma-Aldrich | H9627 | |
| HRP-Conjugated Anti-Rabbit Secondary Antibody (1:100 dilution) | Leica Biosystems | PV6119 | |
| ImmPRESS HRP Horse Anti-Goat igG Detection Kit, Peroxidase (1:100 dilution) | Vector Laboratories | MP-7405 | |
| Lambotte Osteotome | Surgical Mart | SM1553 | |
| Metallographic PICO 155P Precision Saw | Pace Technologies | PICO 155P | microsaw |
| NIS Elements Software Version 4.6 | Nikon | ||
| Paraplast Plus | Sigma-Aldrich | P3683 | paraffin |
| Positive Charged Microscope Slides with White Frosted End | Walter Products | 1140B15 | |
| Thermo Shandon Crytome FSE Cryostat Microtome | New Life Scientific Inc. | A78900104 | cryotome |
| Triology Pretreatment Solution (commercial pretreatment solution) | Sigma-Aldrich | 920P-05 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 920P-05 |
References
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