Summary
Denne artikkelen beskriver en teknikk for rask menneskelig temporal beinseksjonering som benytter en mikrosag med tvillingdiamantblader for å generere tynne skiver for rask avkalkning og analyse av temporal beinimmunhistokjemi.
Abstract
Histopatologisk analyse av menneskelige temporale beinseksjoner er en grunnleggende teknikk for å studere indre og mellomørepatologi. Temporale beinseksjoner fremstilles ved postmortem temporal beinhøsting, fiksering, avkalkning, innebygging og farging. På grunn av tettheten av tinningbenet er avkalkning en tidkrevende og ressurskrevende prosess; fullstendig vevsforberedelse kan ta 9-10 måneder i gjennomsnitt. Dette bremser otopatologiforskning og hindrer tidssensitive studier, som de som er relevante for COVID-19-pandemien. Dette papiret beskriver en teknikk for rask forberedelse og avkalkning av temporale beinseksjoner for å øke hastigheten på vevsbehandling.
Temporale bein ble høstet postmortem ved hjelp av standardteknikker og festet i 10% formalin. En presisjonsmikrosag med doble diamantblader ble brukt til å kutte hver seksjon i tre tykke seksjoner. Tykke tinningbeinseksjoner ble deretter avkalket i avkalkningsoppløsning i 7-10 dager før de ble innebygd i parafin, seksjonert i tynne (10 μm) seksjoner ved hjelp av et kryotom og montert på uladede lysbilder. Vevsprøver ble deretter deparaffinisert og rehydrert for antistofffarging (ACE2, TMPRSS2, Furin) og avbildet. Denne teknikken reduserte tiden fra høsting til vevsanalyse fra 9-10 måneder til 10-14 dager. Høyhastighets temporal beinseksjonering kan øke hastigheten på otopatologiforskning og redusere ressursene som er nødvendige for vevsforberedelse, samtidig som det letter tidsfølsomme studier som de som er relatert til COVID-19.
Introduction
Menneskelig temporal beinforskning gir en uvurderlig ressurs for å studere patologien og patofysiologien til det indre og mellomøret. Før det 19. århundre var lite kjent om otologisk sykdom 1,2,3. For bedre å forstå otologisk sykdom og "redde lydkirurgi fra kvakksalverens hender", utviklet Joseph Toynbee (1815-1866) metoder for å studere histologiske deler av det menneskelige tinningbenet3. Dette arbeidet ble fremmet av Adam Politzer (1835-1920) i Wien og andre over hele Europa i løpet av resten av det 19. århundre, som brukte temporale beinseksjoner for å beskrive histopatologien til mange vanlige forhold som påvirker øret 2,3,4.
Det første menneskelige temporale beinlaboratoriet i USA ble åpnet i 1927 på Johns Hopkins Hospital, hvor Stacy Guild (1890-1966) utviklet metoder for temporal beinseksjonering 5,6. Metodene utviklet av Guild besto av en 9-10 måneders prosess som inkluderte postmortem høsting, fiksering, avkalkning i salpetersyre, dehydrering i etanol, celloidininnbygging, seksjonering, farging og montering. Modifikasjoner av denne teknikken ble senere gjort av Harold Schuknecht (1917-1996)7; Imidlertid forblir de grunnleggende komponentene i denne prosessen i det vesentlige uendret.
De betydelige ressursene som kreves for å opprettholde et temporalt beinlaboratorium har presentert en utfordring for temporal beinforskning og sannsynligvis bidratt til dens fallende popularitet de siste 30 årene 4,8. En betydelig del av temporal bein laboratorieressurser må være viet til 9-10 måneders prosess med temporal bein forberedelse. En av de mest tidkrevende trinnene i forberedelsen er avkalkning av tinningbenet, som er det tetteste beinet i menneskekroppen. Avkalkning utføres vanligvis i salpetersyre eller etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) og tar uker til måneder mens det krever hyppig endring av løsninger 7,9. Videre kan tidsfølsomme studier av det menneskelige øre, som de som er relatert til COVID-19-pandemien, bli hindret av denne langsomme forberedelsesprosessen. Dette papiret beskriver en teknikk for høyhastighets temporal beinseksjonering som bruker en diamantmikrosag for å generere tykke seksjoner som muliggjør rask avkalkning og vevsanalyse innen 10-14 dager etter temporal beinhøsting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne protokollen ble utviklet med IRB (IRB00250002) godkjenning og i samsvar med institusjonelle retningslinjer for bruk av humant vev og smittsomt materiale. Hver temporal bone donor ga skriftlig samtykke før døden, eller samtykke ble innhentet posthumt fra donorens familie. Se materialtabellen for detaljer om alle materialer, utstyr og programvare som brukes i denne protokollen.
1. Temporal beinhøsting
- Få godkjenning fra lokalt institusjonelt tilsynsråd (IRB), gjennomgå institusjonelle retningslinjer for bruk av menneskelig og smittsomt materiale, og få samtykke til vevdonasjon før du bruker denne protokollen.
- Ta på riktig personlig verneutstyr (PPE) før du arbeider med vev fra COVID-19-positive temporale beindonorer. Forsikre deg om at PPE består av en N-95 åndedrettsvern og ansiktsskjerm (eller alternativt et luftrensingssystem med positivt trykk), kjole og to par hansker. Gjennomgå teknikker for riktig donning og doffing PPE før du begynner denne protokollen10.
- Høst temporal beinvev innen 12-24 timer etter donordød. Hvis kroppen ikke er nedkjølt, må du sørge for at høsten skjer innen 8 timer etter døden.
- Høst temporale bein under obduksjon ved hjelp av fire-snittet, blokkmetoden ved osteotom7.
- Etter kraniotomi, fjern hjernen og del kranialnervene til den indre hørskanalen skarpt.
- Gjør det første benete snittet med osteotomen parallelt med og bare medialt til den plateepiteløse delen av tinningbenet.
- Utfør det andre benete snittet parallelt med det første ved den mediale grensen til tinningbenet.
- Gjør deretter det tredje snittet 3-4 cm fremre og parallelt med petrousryggen.
- Gjør det fjerde snittet omtrent parallelt med det tredje, 2 cm bakre til petrousryggen.
MERK: Sørg for at alle snitt strekker seg gjennom skallebasen. - Fjern deretter tinningbenet ved hjelp av skarp disseksjon for å frigjøre bløtvevsfesten langs den nedre kanten av prøven. Hvis balsamering skal utføres etter temporal beinhøst, bind av stubben av halspulsåren.
- Høst temporale bein under obduksjon ved hjelp av fire-snittet, blokkmetoden ved osteotom7.
2. Vevsfiksering, avkalkning og seksjonering
- Plasser vevet umiddelbart i 200-300 ml med 10% bufret formalin (formaldehyd) slik at vevet er helt nedsenket. La vevet stå i formaldehyd i minst 72 timer ved romtemperatur, og endre løsningene daglig. Oppbevar vevet i en lufttett beholder og utfør løsningsendringer under en avtrekkshette mens du bruker passende PPE for å forhindre virusspredning.
MERK: Etter 72 timers fikseringsperiode trenger prøvene ikke lenger å betraktes som smittsomme. - Bruk en presisjonsmikrosag med doble diamantblader for å kutte hvert eksemplar i tre "tykke" seksjoner for å muliggjøre raskere vevsavkalkning. Sett de to diamantbladene i en avstand på 5 mm, slik at den sentrale delen av tinningbenet er 5 mm tykk. Sørg for at delene av vevet i hver ende er 3-5 mm tykke.
- Plasser de tykke seksjonene i 200-300 ml med 23 % w/w maursyreavkalkningsoppløsning i 7-10 dager ved romtemperatur, til vevet er mykt nok til å legge inn parafin. Endre løsningene daglig. Kontroller for tilstrekkelig vevsavkalkning ved å palpere prøven, som skal føles myk.
MERK: Avkalkning kan også verifiseres med røntgen. - Skyll prøvene i rennende vann fra springen i 24 timer ved å plassere dem i et stort beger under en rennende kran.
- Dehydrer vevet i en serie alkoholer med økende konsentrasjon7. Senk vevet i 100-200 ml 70% etanol i 1,5 timer, etterfulgt av tre vasker i henholdsvis 95% og 100% etanol i 1,5 timer hver. Vask deretter vevet 3 x 1,5 timer i xylen.
- Legg de tykke seksjonene i parafin, med fire behandlinger på 45 min hver.
- Bruk et kryotom til å kutte tynne (10 μm) seksjoner. Plasser vevet slik at vevet blir kuttet i det aksiale planet. Skjær tykkere (20 μm) seksjoner om ønskelig.
3. Immunhistokjemi og bildebehandling
- Hvis tradisjonell hematoksylin- og eosinfarging er ønsket (ikke beskrevet her), utfør farging før du monterer seksjonene på glassglass7.
- Monter seksjonene på positivt ladede glassglass.
- Stek lysbildene på en kokeplate ved 60 °C i 20 min.
- Plasser lysbildene i en holder og senk dem i en kommersiell forbehandlingsløsning som inneholder et organisk løsningsmiddel (dietanolamin i dette tilfellet) og etanol for å deparaffinisere, rehydrere og avdekke vevet.
MERK: Dette trinnet er nødvendig for å oppnå tilfredsstillende resultater med immunhistokjemi for formalinfiksert og parafininnstøpt vev. - Varm lysbildene i en trykkoker på høyt trykk i 20 minutter.
- Plasser lysbildene i et fuktet kammer og blokker vevet med en kommersiell blokkeringsløsning.
- Probe vevssnittene med det primære antistoffet mot angiotensinkonverterende enzym 2 (ACE2; 1:50), transmembranproteaseserin 2 (TMPRSS2, 1:1000) og Furinproteasen (1:250).
MERK: ANTISTOFFENE ACE2, TMPRSS2 og Furin brukes fordi disse proteinene antas å spille en rolle i SARS-CoV-2 smittsomhet11,12, og denne protokollen søkte å undersøke mulige mekanismer som SARS-CoV-2 kan infisere mellomøret13. - Behandle med HRP-konjugert antikanin sekundært antistoff (ACE2, Furin; 1:100 fortynning) eller anti-geit (TMPRSS2, 1:100 fortynning) sekundært antistoff.
- Kontroller lysbildene med 70% hematoksylin i vann.
- Skaff bilder på et lysmikroskop med et montert digitalkamera. Få bilder av mellomøre slimhinnen og Eustachian-røret ved henholdsvis 20x og 10x forstørrelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hematoksylin- og eosinfarging av mellomørehinnen og Eustachian-tuben viste bevaring av mellomørehinnen og submukosalt mellomørevev etter prosessering (figur 1). Immunhistokjemiske bilder viste ekspresjon av proteinene ACE2, TMPRSS2 og Furin i mellomørehinnen og Eustachian-røret (figur 1). Tilstedeværelsen av disse proteinene i mellomøret gir en mulig rute der SARS-CoV-2 kan infisere respiratorisk epitel i mellomøret 11,12,13. Videre kan uttrykket av disse proteinene i Eustachian-røret forklare en rute hvor viruset kommer inn i mellomøret, reiser til mellomøret fra nasopharynx via Eustachian-røret.
Figur 1: Eksempel på farget mellomørevev. Figuren viser hematoksylin og eosin, ACE2, TMPRSS2 og Furinfarging av mellomørehinnen (øverste rad, 20x forstørrelse) og Eustachian tube (nederste rad, 10x forstørrelse). Skala barer = 50 μm (øverste rad); 100 μm (nederste rad). Forkortelser: H&E = hematoksylin og eosin; angiotensin-konverterende enzym 2; TMPRSS2 = transmembran protease, serin 2. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Menneskelig temporal beinforskning er kritisk for å studere indre og mellomørepatologi, men er fortsatt en tids- og ressurskrevende innsats. Dette papiret beskriver en teknikk som bruker en diamantmikrosag for å generere tykke temporale beinseksjoner som raskt kan avkalkes før videre snitting, slik at tiden fra vevshøst til studie kan reduseres fra 9-10 måneder til 10-14 dager. Denne teknikken kan redusere ressursene som kreves for temporal beinbehandling og legge til rette for tidsfølsomme studier, for eksempel de som er relatert til COVID-19 mellom- og indre ørepatologi13, som var motivasjonen for å utvikle denne protokollen. Denne protokollen tillot visualisering av ACE2, TMPRS22 og Furin-uttrykk i mellomøret og Eustachian-røret, og gir en sannsynlig mekanisme der SARS-CoV-2 kan infisere mellomøret ved å spre seg fra nasopharynx gjennom Eustachian-røret.
Den primære innovasjonen i denne protokollen er bruken av en diamantsag som kutter vevet før avkalkning, noe som genererer "tykke" seksjoner av tinningben som raskt kan avkalkes ved å øke overflaten av vevet som er utsatt for avkalkningsmiddelet. Dette trinnet gjør det mulig for vevsavkalkning å skje innen 7-10 dager i stedet for de 1-2 månedene som tradisjonelle protokoller kan kreve for avkalkning. De "tykke" delene av vev som er opprettet med diamantsagen, kan også dehydreres raskere enn en standard blokk med tinningbenvev, og dermed redusere tiden mellom avkalkning og innebygging. Videre bruker denne protokollen parafin som et innebyggingsmiddel i stedet for celloidin, som tar omtrent 3 måneder å herde7. Mens celloidin gir overlegen bevaring av cochleastrukturer, herdes parafin mye raskere og letter immunostaining. Med disse modifikasjonene kan temporalt beinvev behandles på 10-14 dager i motsetning til de 9-10 månedene som kreves i mer tradisjonelle prosesseringsstrategier 7,9.
Denne protokollen har flere begrensninger. Kutting av vevet med diamantsagen før innbygging risikerer å skade Corti-organet (OOC). OOC ble alvorlig skadet i de fleste prøver under utviklingen av denne teknikken, noe som kan begrense verdien av denne teknikken for å studere patologier som aldersrelatert hørselstap, hvor det er viktig at de delikate strukturer i det indre øret blir bevart. Det kan være mulig å plassere prøven slik at diamantsagen ikke skjærer direkte gjennom det otiske kapselbenet og bevarer indre ørestrukturer, men dette er fortsatt et område med aktiv undersøkelse. Dyremodeller kan gi et verdifullt verktøy for å videreutvikle denne protokollen og øke sjansen for å bevare indre ørestrukturer i disse verdifulle menneskelige prøvene. Vevskvaliteten i denne protokollen er i tillegg begrenset ved bruk av parafininnstøpingsmiddelet, som ble valgt på grunn av tidsbegrensninger. Celloidininnbygging opprettholder bedre cellulær integritet i otopatologiske prøver, men tar måneder å herde7. Sist, denne protokollen krever fortsatt betydelig tid og ressursinvestering. Bruken av en diamantmikrosag er en ekstra kostnad for materialene som kreves for tradisjonell temporal beinforberedelse, og de 7-10 dagene som kreves for avkalkning er fortsatt lange. I fremtiden kan det være mulig å kombinere disse metodene med mikrobølgeassistert avkalkning14 for ytterligere å forkorte tiden som kreves for behandling.
Til tross for sine begrensninger, tilbyr protokollen for høyhastighets temporal beinbehandling beskrevet her et annet verktøy for å studere mellomøret, og potensielt indre øre, patologi. Denne teknikken har vært nyttig under COVID-19-pandemien og kan også redusere kostnadene forbundet med å opprettholde et aktivt tinningbenlaboratorium ved å redusere tiden og arbeidskraften som er nødvendig for vevsbehandling. Temporal beinforskning har gått ned i popularitet i USA, og avtar fra 28 aktive laboratorier på 1980-tallet til bare 4 aktive laboratorier for tiden4. Denne nedgangen i antall operative temporale beinlaboratorier kan ha sammenheng med de betydelige kostnadene forbundet med høsting og bearbeiding av tinningbein 4,8. Derfor er det viktig at vi tar sikte på å utvikle teknikker som reduserer ressursene som er nødvendige for temporal beinbehandling og også de som tillater studier av temporal beinpatologi i nye sammenhenger, for eksempel COVID-19-pandemien. Videre kan høyhastighets vevsbehandling, som den som er skissert i denne protokollen, hjelpe til med bruk av nye biologiske teknikker (f.eks. Immunhistokjemi, transkriptomikk) som tillater vurdering av mellom- og indre ørepatologi på molekylært nivå 15,16,17,18,19 . Vi har knapt skrapt overflaten når det gjelder å bruke molekylære teknikker for å studere menneskelig vev i otologisk sykdom, og de kan gi viktig innsikt som ikke kan gis av dyremodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter å oppgi.
Acknowledgments
Vi takker Mohamed Lehar for hans hjelp med dette prosjektet. Dette arbeidet ble delvis støttet av National Institutes of Health (T32DC000027, NSA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-ACE-2 Antibody (1:50 applied dilution) | Novus Biologicals | SN0754 | |
| Anti-Furin Antibody (1:250 dilution) | Abcam | EPR 14674 | |
| Anti-TMPRSS2 Antibody (1:1,000 dilution) | Novus Biologicals | NBP1-20984 | |
| BX43 Manual System Microscope | Olympus Life Science Solutions | ||
| CBN/Diamond Hybrid Wafering Blade | Pace Technologies | WB-007GP | |
| Collin Mallet - 8'' | Surgical Mart | SM1517 | |
| DS-Fi3 Microscope Camera | Nikon | ||
| Dual Endogenous Enzyme Block (commercial blocking solution) | Dako | S2003 | |
| Eaosin Stain | Sigma-Aldrich | 548-24-3 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma-Aldrich | HT501128 | |
| Formical-4 Decalcifier (formic acid decalcifying solution) | StatLab | 1214-1 GAL | |
| Hematoxylin Stain | Sigma-Aldrich | H9627 | |
| HRP-Conjugated Anti-Rabbit Secondary Antibody (1:100 dilution) | Leica Biosystems | PV6119 | |
| ImmPRESS HRP Horse Anti-Goat igG Detection Kit, Peroxidase (1:100 dilution) | Vector Laboratories | MP-7405 | |
| Lambotte Osteotome | Surgical Mart | SM1553 | |
| Metallographic PICO 155P Precision Saw | Pace Technologies | PICO 155P | microsaw |
| NIS Elements Software Version 4.6 | Nikon | ||
| Paraplast Plus | Sigma-Aldrich | P3683 | paraffin |
| Positive Charged Microscope Slides with White Frosted End | Walter Products | 1140B15 | |
| Thermo Shandon Crytome FSE Cryostat Microtome | New Life Scientific Inc. | A78900104 | cryotome |
| Triology Pretreatment Solution (commercial pretreatment solution) | Sigma-Aldrich | 920P-05 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 920P-05 |
References
- Nogueira, J. F., et al. A brief history of otorhinolaryngology: Otology, laryngology and rhinology. Brazilian Journal of Otorhinolaryngology. 73 (5), 693-703 (2007).
- Pappas, D. G.
- Schuknecht, H. F. Otopathology: The past, present, and future. Auris Nasus Larynx. 23, 43-45 (1996).
- Monsanto, R. D. C., Pauna, H. F., Paparella, M. M., Cureoglu, S. Otopathology in the United States: History, current situation, and future perspectives. Otology & Neurotology. 39 (9), 1210-1214 (2018).
- Crowe, S. J., Guild, S. R., Polvogt, L. M. Observations on the pathology of high-tone deafness. Journal of Nervous and Mental Disease. 80, 480 (1934).
- Andresen, N. S., et al. Insights into presbycusis from the first temporal bone laboratory within the United States. Otology & Neurotology. 43 (3), 400-408 (2022).
- Schuknecht, H. Pathology of the Ear. , Lea and Febiger. Philadelphia, PA. (1993).
- Chole, R. A. Labs in crisis: Protecting the science--and art--of otopathology. Otology & Neurotology. 31 (4), 554-556 (2010).
- Nager, G. T. Pathology of the Ear and Temporal Bone. , Williams and Wilkins. Baltimore, MD. (1993).
- COVID-19 Personal Protective Equipment (PPE). , Available from: https://www.cdc.gov/niosh/emres/2019_ncov_ppe.html (2022).
- Essalmani, R., et al. Distinctive roles of Furin and TMPRSS2 in SARS-CoV-2 infectivity. Journal of Virology. 96 (8), 0012822 (2022).
- Ueha, R., Kondo, K., Kagoya, R., Shichino, S., Yamasoba, T. ACE2, TMPRSS2, and Furin expression in the nose and olfactory bulb in mice and humans. Rhinology. 59 (1), 105-109 (2021).
- Frazier, K. M., Hooper, J. E., Mostafa, H. H., Stewart, C. M. SARS-CoV-2 virus isolated from the mastoid and middle ear: Implications for COVID-19 precautions during ear surgery. JAMA Otolaryngology - Head & Neck Surgery. 146 (10), 964-966 (2020).
- Cunningham, C. D., Schulte, B. A., Bianchi, L. M., Weber, P. C., Schmiedt, B. N. Microwave decalcification of human temporal bones. Laryngoscope. 111 (2), 278-282 (2001).
- Stephenson, R., et al. Immunohistochemical location of Na+, K+-ATPase α1 subunit in the human inner ear. Hearing Research. 400, 108113 (2021).
- McCall, A. A., et al.
- Wu, P. Z., O'Malley, J. T., de Gruttola, V., Liberman, M. C. Age-related hearing loss is dominated by damage to inner ear sensory cells, not the cellular battery that powers them. The Journal of Neuroscience. 40 (33), 6357-6366 (2020).
- Miller, M. E., Lopez, I. A., Linthicum, F. H., Ishiyama, A. Connexin 26 immunohistochemistry in temporal bones with cochlear otosclerosis. Annals of Otology, Rhinology & Laryngology. 127 (8), 536-542 (2018).
- Lopez, I. A., et al. Immunohistochemical techniques for the human inner ear. Histochemistry and Cell Biology. 146 (4), 367-387 (2016).
