تقييم تفاعلات الخلايا المضيفة للبكتيريا باستخدام حبيبات المحاكاة الحيوية

خذ صفيحة متعددة الآبار تحتوي على ثقافة الخلايا الظهارية للثدييات.

في آبار الاختبار ، أضف مسببات الأمراض البكتيرية جنبا إلى جنب مع حبات البوليمر المقترنة بالبروتينات السطحية البكتيرية.

في آبار التحكم ، أضف العامل الممرض والخرز الذي يفتقر إلى البروتينات السطحية البكتيرية. حضن.

في آبار الاختبار ، تحاكي الخرزات سطح البكتيريا وتتنافس مع العامل الممرض للارتباط بحمض الفوسفاتيديك لغشاء الخلية الظهارية ، مما يقلل من الارتباط البكتيري.

في آبار التحكم ، لا تؤثر الخرزات على التعلق البكتيري.

قم بإزالة الوسائط وغسلها بمخزن مؤقت للتخلص من المكونات غير المقيدة.

احتضن بمنظف غير أيوني لتحلل الخلايا ، وإطلاق البكتيريا والخرز المرتبط بالغشاء.

ماصة المحللة لإنشاء تعليق متجانس ، وتخفيف الجانس بشكل متسلسل باستخدام المخزن المؤقت.

انقل التخفيفات إلى ألواح أجار ، واحتضنها للسماح بتكوين المستعمرة ، وعد المستعمرات.

لوحة الاختبار مستعمرات أقل من الضوابط ، مما يشير إلى انخفاض التفاعلات بين البكتيريا والمضيف.

قم بإعداد وسائط العدوى عن طريق تخفيف الثقافات البكتيرية إلى DMEM عديم اللون بدون إضافات.

دافئ مسبقا إلى 37 درجة مئوية يحتوي على 10٪ من الحجم إلى حجم تعليق الخرزة. لإعطاء وزارة الداخلية 10 ، قم بإعداد مليلتر واحد لكل بئر و 10 إلى 20٪ حجم زائد لكل عينة. قم بإزالة الوسط القديم من الآبار واغسل خلايا HeLa المزروعة عن طريق إضافة مليلتر واحد من PBS المعقم إلى 37 درجة مئوية. قم بإزالة PBS وأضف ملليلترا واحدا من وسط العدوى لكل بئر. أضف المحاليل التي تحتوي على حبات التحكم والبكتيريا كعناصر تحكم إيجابية وخرز التصاق ولا توجد بكتيريا كضوابط سلبية.

أضف DMEM الذي يحتوي على 0.1٪ Triton X 100 كأدوات تحكم في التحلل.

احتضان اللوحة في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية لمقدار الوقت المطلوب.

يتم إجراء قياسات الالتصاق البكتيري بعد ساعة واحدة من الإصابة. قم بإزالة الوسائط من طبقة الخلية واغسل طبقة الخلية جيدا باستخدام PBS معقم مسخن مسبقا لإزالة أي خلايا غير متصلة. اغسل ثلاث إلى أربع مرات على الأقل باستخدام مليلتر واحد من PBS في كل مرة. قم بتحليل الخلايا المضيفة عن طريق إضافة مليلتر واحد من حجم معقم بنسبة 1٪ إلى محلول Triton X 100 في PBS. احتضن الطبق عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.

ماصة كل عينة لأعلى ولأسفل عدة مرات قبل نقل محتويات كل بئر لفصل أنابيب سعة 1.5 ملليلتر. قم بإعداد تخفيفات تسلسلية عشرة أضعاف للعينات إلى PBS معقمة. لوحة 100 ميكرولتر من كل عينة على أجار LB البحرية وانتشر باستخدام موزع الخلايا. قم بتحسين التخفيف إلى اللوحة اعتمادا على السلالات البكتيرية والنقطة الزمنية.

بالنسبة لهذا الإعداد التجريبي ، فإن التخفيف من 10 إلى الخامس أو 10 إلى الضعف السادس سيعطي عددا مناسبا من وحدات تشكيل المصافين. احتضان الصفائح عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، تعداد البكتيريا عن طريق عد المستعمرات.