iCLIP -- Transcriptome على صعيد رسم الخرائط من البروتين RNA التفاعلات مع القرار الفردي النكليوتيد

الهدف العام من التجربة التالية هو الحصول على خريطة عريضة للنسخ لمواقع الارتباط لبروتين ربط الحمض النووي الريبي بدقة النيوكليوتيدات الفردية. يتم تحقيق ذلك عن طريق الأشعة فوق البنفسجية للخلايا الحية إلى بروتينات الارتباط المتقاطعة تساهميا والحمض النووي الريبي في الجسم الحي كخطوة ثانية. يتم تنقية بروتين ربط الحمض النووي الريبي المناعي في ظل ظروف صارمة من أجل استعادة شظايا الحمض النووي الريبي المتشابكة.

يولد النسخ العكسي التالي CDNAs التي غالبا ما يتم اقتطاعها عند الببتيد المرفق ، والذي يحافظ على المعلومات المتعلقة بموضع الارتباط المتقاطع داخل الحمض النووي الريبي ، ويتم الحصول على النتائج التي تظهر جميع مواقع الربط داخل النسخ بناء على تسلسل الإنتاجية العالية لمكتبة (كدنا). يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في بيولوجيا الحمض النووي الريبي مثل كيفية تفاعل بروتينات الحمض النووي الريبي المختلفة لتنظيم معالجة الحمض النووي الريبي. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أننا نزيد من أداء ودقة خرائط النسخ الواسعة الخاصة بنا لتفاعلات الحمض النووي الريبي البروتيني لبدء إجراء خلايا زراعة الأنسجة المتشابكة للأشعة فوق البنفسجية.

قم بإزالة الوسط من صفيحة 10 سم من خلايا المعالج. أضف ستة ملليلتر من PBS المثلج وضع الأطباق على الثلج. لوحة واحدة تكفي لثلاث تجارب.

قم بإزالة الغطاء وإشعاع الخلايا. بمجرد الوصول إلى 254 نانومتر مع 150 مللي جول لكل سنتيمتر مربع ، قم بحصاد الخلايا عن طريق كشطها من الألواح باستخدام رافع الخلايا ، ونقل ملليلترين من تعليق الخلية إلى كل من الأنابيب الدقيقة الثلاثة لحبيبات الخلايا. قم بتدويرها بأقصى سرعة لمدة 10 ثوان عند أربع درجات مئوية.

ثم قم بإزالة المفاجئة ، وقم بتجميد كريات الخلية على الثلج الجاف وقم بتخزينها على درجة حرارة 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى الاستخدام. أضف 100 ميكرولتر من البروتين ، وهو حبات دينامية لكل تجربة إلى أنبوب دقيق جديد. إذا كنت تعمل مع الأجسام المضادة للفأر أو الماعز ، فاستخدم حبات بروتين G dyna.

اغسل الخرزات مرتين باستخدام المخزن المؤقت للتحلل ، والذي يمكن العثور عليه في البروتوكول المكتوب المصاحب. أعد تعليق الخرزات في 100 ميكرولتر من محلول التحلل مع اثنين إلى 10 ميكروغرام من الجسم المضاد. قم بتدوير الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 إلى 60 دقيقة.

ثم اغسل الخرزات ثلاث مرات باستخدام 900 ميكرولتر من محلول التحلل واتركها في الغسيل الأخير حتى تصبح جاهزا للمتابعة. إلى إيمونبريسبيبشن ثور خلية قصر على الجليد. يتم تعليق Resus في مليلتر واحد من محلول التحلل ونقله إلى أنبوب صغير سعة 1.5 ملليلتر.

قم بإعداد تخفيف واحد إلى 500 من الحمض النووي الريبي واحد. ثم أضف 10 ميكرولتر مع ميكرولترين من الحمض النووي التوربيني إلى الخلية. المحلل. احتضان العينات لمدة ثلاث دقائق بالضبط عند 37 درجة مئوية ، ورجها بسرعة 1،100 دورة في الدقيقة ، ثم انقلها على الفور إلى الجليد.

ثم قم بتدوير العينات عند أربع درجات مئوية و 22،000 مرة من الجاذبية لمدة 20 دقيقة لمسح المحللة بعناية ، وجمع SUP natant بعناية ، تاركا حوالي 50 ميكرولترا من المحللة مع الحبيبات لترسيب الخرزات المناعية. قم بإزالة مخزن الغسيل ، ثم أضف محللات الخلية المعدة. قم بتدوير العينات لمدة ساعتين عند أربع درجات مئوية.

تخلص من عامل SUP واغسل الخرزات مرتين باستخدام 900 ميكرولتر من المخزن المؤقت عالي الملح ، والذي يمكن العثور عليه في البروتوكول المكتوب المصاحب. أخيرا ، اغسل الخرزات مرتين باستخدام 900 ميكرولتر من محلول الغسيل. ثم انتقل إلى إزالة الفوسفوريل وإضافة رابط إلى الحمض النووي الريبي ثلاثة نهايات أولية.

لتسمية الحمض النووي الريبي خمسة نهايات رئيسية تعمل خلف درع زجاج شبكي. قم بإزالة supinate من الغسيل الأخير لتفاعل ربط الرابط وأعد تعليق الخرز في ثمانية ميكرولترات من مزيج PNK الساخن. احتضن لمدة خمس دقائق عند 37 درجة مئوية.

قم بإزالة مزيج PNK الساخن والريوس. قم بتعليق الخرزات في 20 ميكرولترا من المخزن المؤقت لتحميل الصفحة الجديدة مرة واحدة. ثم احتضان العينة على خلاط حراري على حرارة 70 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.

ضع العينة على الفور على مغناطيس لترسيب الخرزات الفارغة. قم بتحميل العينات على صفحة جديدة من أربعة إلى 12٪. جل بيس حسب تعليمات الشركة المصنعة.

أيضا ، قم بتحميل خمسة ميكرولترات من علامة حجم البروتين الملطخة مسبقا. قم بتشغيل الجل لمدة 50 دقيقة عند 180 فولت. انقل مجمعات الحمض النووي الريبي البروتيني من الجل إلى غشاء النيتروسليلوز باستخدام جهاز النقل الرطب NOVA وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

بعد النقل ، اشطف الغشاء في المخزن المؤقت PBS. ثم لفها في غلاف ساران وعرضها للفيلم عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. قم بإجراء التعرض لمدة 30 دقيقة ، ساعة واحدة وليلة كاملة.

بعد ذلك ، قم بعزل منطقة الغشاء وفقا لمجمعات الحمض النووي الريبي البروتيني من الحمض النووي الريبي المنخفض. جرب استخدام التصوير الشعاعي التلقائي كقناع. استعادة الحمض النووي الريبي من الغشاء مع هضم البروتيناز K واستخراج الفينول كلوروفورم.

بنسخ الحمض النووي الريبي العكسي باستخدام أحد بادئات AYP لتنقية CDNA. امزج ستة ميكرولترات من عينة CDNA مع ستة ميكرولترات من مخزن تخزين اليوريا TBE مرتين. قبل تحميل العينات على مادة هلامية مباشرة.

سخني العينات إلى 80 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. ثم قم بتحميل العينات على جل اليوريا مسبقة الصب 6٪ TBE جنبا إلى جنب مع علامة الوزن الجزيئي المنخفضة. اترك الجل يعمل لمدة 40 دقيقة عند 180 فولت كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة باستخدام الصبغة العلوية والعلامات الموجودة على دعامة الجل البلاستيكي لتوجيه الاستئصال.

قطع ثلاثة نطاقات من 120 إلى 200 نيوكليوتيد ، و 85 إلى 120 نيوكليوتيد و 70 إلى 85 نيوكليوتيد. لاحظ أن برايمر الشفة القوسية والتسلسل L الثلاثة يمثلان معا 52 نيوكليوتيد من تسلسل المقطع. أضف 400 ميكرولتر من te واسحق شريحة الجل إلى قطع صغيرة.

باستخدام مكبس حقنة سعة مليلتر واحد ، قم باحتضان قطع الجل مع الرج عند 1 ، 100 دورة في الدقيقة لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية. ضع مرشحين مسبقيتين من الزجاج بحجم سنتيمترا واحدا في عمود CoStar spinx. انقل الجزء السائل من العينة إلى دوران العمود لمدة دقيقة واحدة بمعدل 13،000 دورة في الدقيقة إلى أنبوب سعة 1.5 ملليلتر.

أضف 0.5 ميكرولتر من الجليكو الأزرق و 40 ميكرولتر من أسيتات الصوديوم درجة الحموضة 5.5. ثم امزج العينة. أضف ملليلتر واحد من 100٪ الإيثانول.

امزج مرة أخرى وقم بترسيب العينة طوال الليل عند درجة حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر. أخيرا ، قم بتدوير جزيئات CD NA لربط منطقة المحول بالطرف الأولي الخمسة. بعد ذلك ، قم بإعادة الخطية وتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل وفقا للبروتوكول المكتوب المصاحب قبل تسلسل مكتبة مشبك العين ، ويمكن مراقبة نجاح التجربة على خطوتين.

يجب رؤية الرسم البياني الراديوي الذاتي لمركب الحمض النووي الريبي البروتيني بعد نقل الغشاء والصورة الهلامية لمنتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل في التصوير الشعاعي التلقائي لعينات الحمض النووي الريبي المنخفض والنشاط الإشعاعي المنتشر فوق الوزن الجزيئي للبروتين لعينات الحمض النووي الريبي العالية. يركز هذا النشاط الإشعاعي بالقرب من الوزن الجزيئي للبروتين. عندما لا يتم استخدام أي جسم مضاد في الترسيب المناعي ، لا ينبغي اكتشاف أي إشارة.

هناك ضوابط مهمة أخرى لخصوصية الترسيب المناعي إما تنبعث منها تشعيع UVE أو تستخدم الخلايا التي لا تعبر عن البروتين محل الاهتمام. يجب أن توضح الصورة الهلامية لمنتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل نطاق حجم يتوافق مع جزء CD NA. لاحظ أن بادئات PCR ، P three Celexa و P five Celexa تقدم 76 نيوكليوتيد إضافي بحجم CD NA. إذا لم يتم استخدام أي جسم مضاد أثناء الترسيب المناعي ، فلا ينبغي الكشف عن منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل المقابل.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن كل خطوة من الخطوات ال 64 أمر بالغ الأهمية ويجب تنفيذها بدقة مائة بالمائة. يمكن دمج بيانات ICL حسابيا مع المقايسات الوظيفية على نطاق واسع. يمكن أن يؤدي ذلك ، على سبيل المثال ، إلى اكتساب نظرة ثاقبة حول التنظيم المعتمد على الموضع لمعالجة الحمض النووي الريبي.

لتحليل البيانات الحسابية ، نود أن نشير إلى منشوراتنا الأخيرة بالتعاون مع معهد نيكولاس KA الأوروبي للمعلوماتية الحيوية و bla zupan في جامعة ليانا. والآن حان الوقت لبدء تجاربك الخاصة. استمتع.