3 ' نهاية تسلسل إعداد مكتبة مع A-seq2

ويصف هذا البروتوكول طريقة لرسم الخرائط مرناً قبل 3 ' نهاية تجهيز المواقع.

الهدف العام لهذه الطريقة هو التقاط وتسلسل mRNA ثلاث نهايات أولية ، وبالتالي تمكين دراسات معالجة mRNA ، لا سيما الانقسام النهائي الثلاثة والبولي الأدينيل ، بالإضافة إلى القياس الكمي للتعبير الجيني. يمكن أن يساعد بروتوكول A-seq2 وحزمة تحليل البيانات المعروضة هنا في الإجابة على الأسئلة الرئيسية حول توليد ووظيفة الأشكال الإسوية للنسخ في أنواع الخلايا والأنسجة المختلفة. تتمثل المزايا الرئيسية لطريقة A-seq2 في أنها تتجنب التسلسل من خلال امتدادات بولي (A) الطويلة ولا تولد ثنائيات محول.

يتم استخدام الخلايا التي تنمو إلى 80٪ التقاء لهذا الإجراء. قم بإزالة وسط النمو وغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS. قم بتحلل الخلايا مباشرة على اللوحة عن طريق إضافة مليلتر واحد من محلول التحلل لكل بئر واستخدام ملعقة مطاطية لفصل مادة الخلية تماما عن سطح اللوحة.

استخدم طرف ماصة سعة مليلتر واحد لنقل المحللة اللزجة من كل بئر إلى أنبوب بلاستيكي سعة 15 مل. شارك الحمض النووي مع حقنة سعة ملليلتر واحد متصلة بإبرة تحت الجلد قياس 23. قم بإجراء العديد من الحركات القوية لأعلى ولأسفل للمكبس ، حتى يصبح المحلل غير لزج.

انقل المحللة إلى أنبوب سعة 1.5 مل. تدور عند 20 ، 000 مرة جم وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق ، لإزالة الحطام. اجمع المادة الطافية الصافية من المحلل.

أضف إلى oligo d (T) 25 حبة مغناطيسية وأعد تعليق الخليط. ضع الأنابيب على عجلة دوارة لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، ضع الأنابيب على رف مغناطيسي لمدة دقيقتين.

قم بإزالة السائل الصافي. أضف 0.8 مل من المخزن المؤقت A إلى كل أنبوب وقم بتدوير الأنبوب بمقدار 180 درجة مرتين إلى ثلاث مرات. قم بإزالة المخزن المؤقت A من الغسيل الثاني.

أضف 0.8 مل من المخزن المؤقت B إلى كل أنبوب واتركه على الرف لمدة دقيقتين. لتصفية الرنا المرسال المرتبط من الخرزات ، قم بإزالة المخزن المؤقت B ، وأضف 33 ميكرولترا من الماء إلى كل أنبوب ، وأعد تعليق الخرز. يسخن إلى 75 درجة مئوية لمدة خمس دقائق على كتلة قلبية.

على الفور ، قم بتدوير الأنابيب لمدة ثانية واحدة وضعها على الرف المغناطيسي. انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد. أضف 66 ميكرولترا من محلول التحلل المائي القلوي إلى كل أنبوب ، واخلطه وسخنه عند 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق بالضبط على كتلة تسخين.

على الفور ، قم بتبريد الأنابيب على الجليد. بعد ذلك ، قم بإجراء عزل الحمض النووي الريبي باستخدام مجموعة تنظيف الحمض النووي الريبي ، كما هو موضح في بروتوكول النص. لبدء هذا الإجراء ، أضف إلى كل عينة من الحمض النووي الريبي 14 ميكرولترا من مزيج كيناز متعدد النوكليوتيدات.

احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد 30 دقيقة ، قم بتحميل تفاعلات كيناز على أعمدة الدوران المعدة. قم بتدوير الأعمدة في 735 مرة جم لمدة دقيقتين.

تخلص من الأعمدة وضع الأنابيب ذات التفاعلات المجمعة على الجليد. لمنع النهايات الأولية الثلاثة لشظايا الحمض النووي الريبي لتجنب تسلسلها في تفاعلات الربط اللاحقة ، أضف إلى كل عينة 17.5 ميكرولتر من بولي (أ) بوليميراز ماستر ميكس. امزج ودور لمدة ثانية واحدة.

احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد 30 دقيقة ، أضف 32.5 ميكرولتر من الماء إلى كل تفاعل وتنقية الحمض النووي الريبي ، كما هو موضح في بروتوكول النص. ابدأ هذا الإجراء بوضع التفاعلات في مكثف فراغ لمدة 10 دقائق ، لتقليل الحجم إلى ستة ميكرولترات.

ثم أضف إلى كل تفاعل 24 ميكرولترا من RNA ligase Master Mix. احتضان التفاعلات على خلاط ساخن عند 24 درجة مئوية لمدة 16 ساعة ، مع الخلط المتقطع عند ألف دورة في الدقيقة. في اليوم التالي ، أضف 17 ميكرولترا من الماء إلى كل تفاعل واخلط.

تنقية الحمض النووي الريبي ، كما هو موضح في بروتوكول النص. ضع الإلويت في مكثف مفرغ لمدة ثلاث دقائق ، لتقليل الحجم إلى 11 ميكرولترا. انقل التفاعلات إلى 200 ميكرولتر من أنابيب PCR لتفاعل النسخ العكسي.

أضف ميكرولتر واحد من البرايمر. يسخن على حرارة 70 درجة مئوية في جهاز تدوير PCR لمدة خمس دقائق ثم يترك في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. أضف ثمانية ميكرولترات من مزيج رئيسي للنسخ العكسي إلى كل أنبوب واخلطه.

ضع الأنابيب في جهاز تدوير PCR. يسخن إلى 55 درجة مئوية لمدة 10 دقائق وإلى 80 درجة مئوية لمدة 10 دقائق أخرى. ابق على الجليد.

تحضير حبات الستربتافيدين ، كما هو موضح في بروتوكول النص. أضف تفاعل النسخ العكسي إلى محلول الخرزة واحتضنه عند أربع درجات مئوية على عجلة دوارة لمدة 20 دقيقة. باستخدام رف مغناطيسي ، اغسل الخرزات مرتين باستخدام مخزن مؤقت لربط البيوتين ومرتين باستخدام عازلة TEN.

أعد تعليق الخرزات في 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت TEN. أضف ميكرولترين من مزيج إنزيم جليكوسيلاز الحمض النووي اليوراسيل واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة في الخلاط ، مع الخلط المتقطع. أضف 50 ميكرولترا من الماء ، و 11 ميكرولترا من المخزن المؤقت RNase H ، وميكرولتر واحد من Rnase H ، لكل تفاعل.

احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. ضع الأنابيب على الرف المغناطيسي وانقل السائل الذي يحتوي على الحمض النووي (كدنا) المشقوق إلى أنبوب جديد. قم بتنقية الحمض النووي (كدنا) المشقوق باستخدام مجموعة تنقية تفاعل البوليميراز المتسلسل ، كما هو موضح في بروتوكول النص.

ضع (كدنا) المنقى في مكثف مفرغ لمدة ثماني دقائق للتركيز على حجم سبعة ميكرولترات. لربط خمسة محولات رئيسية بالنهايات الأولية الخمسة للحمض النووي (كدنا) المعزول ، أضف إلى كل عينة 23 ميكرولترا من RNA ligase Master Mix واحتضانها عند 24 درجة مئوية لمدة 20 ساعة. أخيرا ، أضف 70 ميكرولترا من الماء إلى كل تفاعل.

يتم إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل التجريبي لتحديد العدد الأمثل لدورات تفاعل البوليميراز المتسلسل للوصول إلى تضخيم المكتبة ، ضمن المرحلة الأسية. ماصة ما يلي في أنبوب PCR سعة 200 ميكرولتر: 25 ميكرولتر من مزيج بوليميراز الحمض النووي ، 20 ميكرولتر من تفاعل الربط ، ميكرولتر من الماء ، 1.5 ميكرولتر من برايمر PCR الأمامي و 1.5 ميكرولتر من برايمر مؤشر PCR العكسي. قم بتشغيل الدراجة بالبرنامج التالي: ثلاث دقائق عند 95 درجة مئوية ، تليها 20 دورة من 20 ثانية عند 98 درجة مئوية ، و 20 ثانية عند 67 درجة مئوية و 30 ثانية عند 72 درجة مئوية.

اجمع سبعة ميكرولتر من الحصص مباشرة من التدوير ، بعد الدورات المشار إليها. افصل المنتجات على جل الاغاروز بنسبة 2٪ وتصور هجرة منتجات PCR. حدد عدد الدورات في بداية التضخيم الأسي ، 12 دورة في هذا المثال ، واستخدم هذا العدد من الدورات لتفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل واسع النطاق.

افصل المنتجات عن تفاعل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل على نطاق واسع على هلام الاغاروز بنسبة 2٪ واقطع شرائح الجل التي تحتوي على 200 إلى 350 منتجا من منتجات الحمض النووي للنيوكليوتيدات. بعد ذلك ، استخرج الحمض النووي من شرائح الجل باستخدام مجموعة استخراج الهلام ، كما هو موضح في بروتوكول النص. سيتم عرض أهم الخطوات الحسابية فقط في هذا الفيديو.

يتوفر مزيد من التفاصيل في بروتوكول النص. ابدأ باستنساخ مستودع Git والتغيير إلى الدليل الذي تم إنشاؤه حديثا. قم بإنشاء بيئة تحتوي على البرنامج وتنشيط هذه البيئة.

قم بتنزيل تسلسل الجينوم للكائن الحي ، والذي تم الحصول على بيانات A-seq2 منه. افتح ملف التكوين وقم بتعيين معلمات الإدخال، كما هو موضح في بروتوكول النص. ابدأ التحليل.

تم فحص استجابة جين معين ، NUP214 للضربة القاضية لبروتين HNRNPC ، من خلال تحليل قراءات a-seq2 من عينتين من خلايا HEK-293 ، تمت معالجتها إما باستخدام RNA صغير متداخل للتحكم أو باستخدام RNA صغير متداخل HNRNPC. تم حفظ القراءات التي وثقت مواقع poly (A) المشروحة بواسطة خط أنابيب التحليل بتنسيق BAM ، والذي تم استخدامه كمدخلات لمتصفح جينوم IGD. النهايات الثلاثة الرئيسية لقمم القراءة ، تم تعيينها في mMRNA ثلاثة نهايات أولية مشروحة في مجموعة.

تشير الملامح إلى زيادة استخدام الشكل الإسوي الطويل الثلاثة الأولي UTR عند ضربة قاضية HNRNCR. بمجرد إتقانه ، يستغرق بروتوكول A-seq ثماني ساعات من التدريب العملي أو حوالي يومين إلى ثلاثة أيام ، دون احتساب وقت زراعة الخلايا والربط بين عشية وضحاها. عند محاولة البروتوكول ، من المهم أولا تصميم مجموعة أولية تتوافق مع منصة التسلسل المستخدمة في موقعك.

بمجرد حصولك على ثلاث نهايات أولية ل mMRA ، يمكن تشكيل طرق أخرى ، مثل الربط المتقاطع والترسيب المناعي ، لتحديد منظمات المعالجة النهائية الثلاثية قبل mRNA. مهد A-seq2 الطريق للباحثين في مجال معالجة الحمض النووي الريبي ، لاستكشاف تنظيم وعواقب بولي أدينليلیشن البديل في أنواع الخلايا الفردية. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إنشاء مكتبات من mRNA ثلاث نهايات أولية ، وتحليل بيانات التسلسل الخاصة بك ، وتحديد مواقع poly (A) الجديدة وتحديد استخدامك.

نأمل أن يسهل A-seq2 عملك في بدء تنظيم معالجة mRNA ويؤدي إلى العديد من الأفكار الجديدة.