تحديد مستوى التعبير البروتين في الخلايا المستزرعة إيمونوسيتوتشيميستري في كتل الخلايا جزءا لا يتجزأ من البارافين

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحليل التعبير عن علامات التكاثر ذات الأهمية من خلال التحليلات الكيميائية المناعية والنسيجية لكتل الأنسجة المضمنة لخلايا الثرومبوبلاستين والبلازما. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على السؤال الرئيسي حول علم الأمراض السريري لحجب الخلايا بواسطة الأنسجة. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة البديلة للتحليل الكيميائي المناعي لكتل الخلايا المدمجة في البارافين هي البساطة التقنية للإجراءات.

عندما يصل طبق 100 ملم من ثقافة خلايا HeLa إلى التقاء ، استبدل المادة الطافية ب 10 ملليلتر من وسط زراعة خلايا HeLa بدون FBS وأعد الطبق إلى حاضنة زراعة الخلايا. بعد 48 ساعة ، اغسل الخلايا بملليلترين من PBS متبوعا بالحضانة في ملليلترين من 0.25٪ EDTA بالإضافة إلى التربسين لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون. عندما تنفصل الخلايا ، أوقف التفاعل بخمسة ملليلتر من الوسط الكامل وانقل محلول الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلترا.

اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي متبوعا بغسلتين في ملليلترين من PBS البارد لكل غسلة. بعد الغسيل الثاني ، استبدل المادة الطافية بمليلتر واحد من 95٪ من الإيثانول واخلط الحبيبات عن طريق الدوامة. ثم ضع الخلايا الثابتة على الجليد.

لتحضير كتلة خلايا البارافين ، بعد جمع بلازما EDTA من دم المتبرع السليم ، قم بالطرد المركزي للعينات ونقل 200 إلى 400 ميكرولتر من البلازما الطافية إلى أنابيب الطرد الدقيق الفردية. بعد ذلك ، أضف حوالي 200 ميكرولتر من البلازما ، وحوالي 200 ميكرولتر من الثرومبوبلاستين ، وحوالي 200 ميكرولتر من كلوريد الكالسيوم 025 مولار إلى خلايا HeLa الثابتة. اترك الخلائط لتكوين جلطات خلوية في درجة حرارة الغرفة لمدة عشر دقائق ، ثم اغسل الجلطات مرتين باستخدام مليلتر واحد من PBS لصب الجلطات بالكامل على قطع فردية من ورق الترشيح المبلل بالفورمالين بعد الغسيل الثاني.

لف الجلطات في ورق الترشيح واستخدم مجموعة دبوس لوضع الأقمشة في علب مناديل فردية في وسط أربع قطع أخرى من الورق المبلل بالفورمالين. ثم ضع أشرطة المناديل في برطمانات زجاجية تحتوي على 50 مل من الفورمالين المخزن لتثبيت الفورمالين طوال الليل عند أربع درجات مئوية. في صباح اليوم التالي ، قم بتحميل الكاسيت في معالج المناديل لإزالة الماء طوال الليل وتكييف الخلايا الثابتة.

قبل ساعة واحدة على الأقل من نهاية إجراء المعالجة ، قم بتشغيل محطة تضمين ساخنة لإذابة البارافين. عندما تكون محطة التضمين والجلطة جاهزة ، تأكد من وجود البارافين المنصهر في القالب المعدني وانقل جلطة خلوية مشكلة إلى البارافين. ضع كاسيت مناديل جديد بدون غطاء في القالب المعدني وقم بتغطية الكاسيت بمزيد من البارافين المنصهر.

دع البارافين يتجمد في طبق بارد لمدة 30 إلى 60 ثانية. ثم افصل كاسيت الأنسجة عن القالب المعدني. لتحضير أقسام للتحليل الكيميائي المناعي ، حدد موقع جلطة الخلية في كتلة خلية بارافين واحدة واستخدم ميكروتوم لتقطيع الكتلة إلى شرائح بسمك ثلاثة إلى أربعة ميكرومترات.

ضع أقسام البارافين على شرائح زجاجية مطلية بالمحلول الملحي وضع الشرائح في فرن 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. عندما تلتصق الأقسام بالشرائح ، قم بإزالة البارافين من الشرائح في 15 مل من الزيلين لمدة أربع دقائق متبوعا بتجفيف الأقسام مع حضانات الإيثانول الهابطة المتتالية لمدة دقيقتين. بعد حضانة الإيثانول بنسبة 80٪ ، اشطف الأقسام بالماء الجاري لمدة 10 دقائق واغلي الشرائح في وعاء يحتوي على 40 مل من مخزن استرجاع tris-EDTA لمدة 30 دقيقة.

في نهاية الحضانة ، اغسل المستضد المستخرج من الشرائح تحت الماء الجاري متبوعا بحضانة لمدة 10 دقائق في 95٪ من الإيثانول عند أربع درجات مئوية. بعد التجفيف بالهواء ، استخدم قلما مسعورا لتطويق منطقة تلطيخ الخلية في كل شريحة. اغسل الشرائح في TBS-T متبوعا بالحضانة في كتلة بيروكسيد الهيدروجين لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لإزالة أي نشاط بقايا من البيروكسيديز.

اغسل الشرائح ثلاث مرات في TBS-T لمدة دقيقتين لكل غسلة ، ثم قم بتسمية الأقسام ب 100 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة الأولية من مجموعة البقع الكيميائية المناعية ذات الأهمية لمدة ساعة واحدة متبوعة بخمس غسلات TBS-T لمدة دقيقتين. بعد الغسيل الأخير ، احتضن الشرائح في محسن الجسم المضاد الأساسي من المجموعة لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. في نهاية الحضانة ، اغسل الأقسام أربع مرات في TBS-T مع إضافة حوالي 200 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي المسمى ببيروكسيداز الفجل الحار بعد الغسيل الأخير لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.

اغسل الأقسام المحسنة خمس مرات في TBS-T طازج متبوعا بإضافة 100 ميكرولتر من محلول ديامينوبينزيدين لكل قسم لمدة ثلاث دقائق. اغسل الشرائح مرتين في TBS-T وقم بتسمية الأقسام ب 100 ميكرولتر من محلول الهيماتوكسيلين لمدة دقيقة واحدة. ثم اغسل الشرائح مرة أخرى في TBS-T واحتضن الشرائح في 95٪ من الإيثانول لمدة دقيقتين متبوعة بغمس واحد في الإيثانول الطازج بنسبة 95٪ وتغمسين في 100٪ الإيثانول.

احتضان الأقسام المجففة بالإيثانول في 40 مل من الزيلين في وعاء زجاجي لمدة خمس دقائق واترك الشرائح تجف في الهواء. ثم قم بتركيب زلة غطاء على كل شريحة وراقب العينات تحت المجهر الضوئي. يكشف تلطيخ الهيماتوكسيلين والأيوزين للأنسجة المضمنة في البارافين كما هو موضح للتو في الغالب في نوى اللباقة والسيتوبلازم مما يشير إلى الحفاظ المورفولوجي الممتاز على عينات الخلايا بهذه الطريقة.

ومع ذلك ، فإن كتل الخلايا سيئة التحضير تظهر مورفولوجيا سيئة وملصقات غير منتظمة حتى لو كانت العينات ملطخة بشكل صحيح. عادة ما يتم ملاحظة البروتين الثاني المرتبط بالهيكل الخلوي داخل الكروماتين المكثف والمغزل الانقسامي والسيتوبلازم. فقط الخلايا التي تحتوي على بروتين مرتبط بالهيكل الخلوي الثاني في الكروماتين المكثف هي خلايا انقسامية بينما تم العثور على عدد قليل من البروتين المرتبط بالهيكل الخلوي خليتين إيجابيتين داخل مجموعة زراعة خلايا HeLa المتعطشة في الدم.

معظم خلايا HeLa عالية الانقسام هي أيضا إيجابية Ki-67 ويلاحظ تلطيخ Ki-67 في نوى الخلية. فقط حوالي نصف خلايا HeLa الجائعة في المصل تعبر عن علامة التكاثر هذه. بمجرد إتقانها ، يمكن إكمال هذه التقنية في ست ساعات إذا تم إجراؤها بشكل صحيح.

أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر تخفيف الخلايا إلى كثافة مناسبة لعمل جلطة جيدة. باتباع هذا الإجراء ، يمكن إجراء طريقة أخرى مثل تحليل قياس التدفق الخلوي للخلايا الثابتة للإجابة على سؤال إضافي حول مرحلة دورة الخلية أثناء التزامن. بعد تطويرها ، مهدت هذه التقنية الطريق لمستقبل في مجال أمراض الكبد لاستكشاف توصيف التعبير في خط الخلية مع الحفاظ على المعلومات المورفولوجية في الخلايا المستنبتة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء كيمياء الخلايا المناعية وإعداد كتل الثرومبوبلاستين في البلازما من الخلايا المستنبتة. لا تنس أن العمل مع الكواشف الخطرة مثل الزيلين يمكن أن يكون خطيرا للغاية وأنه يجب دائما اتخاذ الاحتياطات مثل ارتداء القفازات ومعطف المختبر أثناء تنفيذ هذا الإجراء.