Larval Кольцо Гланд вскрытие: Изоляция развития эндокринных органов от Drosophila

Overview

Это видео описывает drosophila кольцевой железы, сложная эндокринная структура важна для биосинтеза и секреции экдистероидов и других гормонов. Протокол демонстрирует его вскрытие, фиксацию и иммуностимулятор.

Protocol

Этот протокол является выдержка из Imura и др.,Протоколы для визуализации стероидогенных органов и их интерактивных органов с иммуностимулятором в плодовой мухи Drosophila меланогастер, J. Vis. Exp. (2017).

ПРИМЕЧАНИЕ: Общая схема протоколов показана на рисунке 1.

1. Вскрытие гланда larval кольца (RG)

ПРИМЕЧАНИЕ: В D. melanogaster, который принадлежит к cyclorrhaphous Diptera, PG находится в составном эндокринном органе под названием кольцевая железа (RG, рисунок 2D). Так как это неосуществимо, что PG хирургически отделена от других типов клеток (обсуждается позже), практическая цель состоит в том, чтобы изолировать нетронутыми, неповрежденной RG путем вскрытия.

1. Подготовка личинок на соответствующих стадиях развития
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для синхронизации стадий развития личинок D. melanogaster необходимо собирать яйца в узком времени и собирать личинки в соответствующее время.
   1. Соберите яйца в течение 2 ч на виноград-сок агар пластины при 25 градусов по Цельсию.
   2. Соберите недавно вылупившихся 1-й личинки instar под рассекающий микроскоп с типсами и передать их в небольшой флакон, содержащий пюре стандартных дрожжей / кукурузной муки летать пищи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Возраст личинок представлен "часами после откладки яиц (hAEL)", "часами после люка (hAH)" или "часами после L3 ecdysis (hAL3E)".
   3. В нужное время, собирать постановочные личинки с одноразовой пластиковой петли, чтобы избежать нежелательных травм. Чтобы свести к минимуму разницу в развитии^3-й личинки instar, собирать^{2-й instar} личинок на 70 hAEL (48 hAH) и позволить им линьки в 2 ч интервалов. Затем соберите^{3-е личинки} instar в течение 2 ч после экдиза L3; эта процедура дает 0-2 личинки hAL3E.
   4. Перенесите постановочные личинки в блюдо, наполненное фосфатным буферным солевым раствором (PBS).
   5. Промыть личинки с PBS, чтобы удалить остаточную пищу из организма.
2. Грубое вскрытие личинок под рассечением микроскопа
   1. Держите рот крючок личинки с типсами. Разъединяйте личиное тело на передней трети длины тела с помощью микро ножниц.
   2. Держите разрезанный конец переднего личинообразной тела с одной парой типсов. Используя другую пару типсов, осторожно нажмите кончик головы к внутренней части тела; эта процедура выворачивает личиное тело наизнанко.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может быть пропущен для вскрытия 1-й^{личинки} instar.
   3. Повторите шаги 1.2.1-1.2.2 с дополнительными личинками в течение 5-10 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Количество личинок должно быть равным или менее 20, чтобы сэкономить время для вскрытия.
3. Фиксация и окрашивание тканей иммуногистохимией
   1. Поместите переднюю треть личинообразных тел (шаг 1.2.2) в микротрубки 1,5 мл, заполненную 500 МКЛ раствором исправления (4% параформальдегида в PBS). Исправить менее 20 образцов одновременно, в противном случае PBS прилагается к фиксированным образцам может привести к неблагоприятному разбавлению фиксатора. Для вскрытия филе, удалить каплю PBS, а затем добавить каплю исправить решение.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для решения исправить, либо 3,7% формальдегида или 4% параформальдегид может быть использован.
   2. Инкубировать вскрытые ткани в растворе фиксации в течение 30 мин при комнатной температуре (RT) или в качестве альтернативы в течение 2 ч при температуре 4 градусов по Цельсию.
   3. Замените раствор исправления на 500 хл PBS и быстро промойте образцы 3 раза. Вымойте образцы с 500 йл 0,3% PBT (PBS и 0,3% октилфенол этиксилат) в течение 15 мин на рокер на RT. Для вскрытия филе удалите булавки насекомых и перенесите образцы в микротрубку 1,5 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для повышения проницаемости антител в тканях, образцы обрабатываются 500 йл 2,0% PBT для 1-2 ч на рокер на RT.
   4. Замените PBT блокирующим раствором из 500 йл (2% альбумин сыворотки крупного рогатого скота в PBT). Инкубировать образцы для 1,5 ч на рокер на RT.
   5. Замените блокирующий раствор на 50 мкл первичного раствора антитела, т.е. антитела, разбавленные в блокирующего растворе.
   6. Инкубировать образцы на ночь на рокер при 4 градусов по Цельсию.
   7. Замените раствор первичного антитела на 500 0,3% PBT и быстро промойте образцы 5 раз. Вымойте образцы 3 раза с 500 йл 0,3% PBT в течение 15 минут каждый на рокер на RT.
   8. Замените 0,3% ПБТ на 50 МКЛ вторичным раствором антител (спрягаемые с помощью красителя антитела, разбавленные в блокирующий раствор). Для ядерного окрашивания к раствору 50 МКЛ добавляется 0,5 л 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI, раствор бульона 0,1 мг/мл). Инкубировать образцы на рокер в течение 2 ч на RT или в качестве альтернативы при 4 градусов по Цельсию на ночь.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Храните образцы в темноте.
   9. Замените раствор антител на 500 йл 0,3% PBT и промойте 5 раз. Вымойте образцы 3 раза с 500 йл 0,3% PBT в течение 15 минут каждый на RT.
4. Тонкое рассечение комплекса мозг-RG, содержащего PG и монтаж
   1. Используйте одноразовый пипетку для передачи иммуноотренитных образцов в блюдо, наполненное 0,3% PBT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать неудобных пузырьков во время вскрытия и монтажа, 0,3% PBT можно заменить PBS.
   2. Под рассечением микроскопа держите кутикулу или рот крючок с одной парой типсов. Используя 27 G иглы прилагается к 1 мл шприца в качестве "ножа", сократить передний кончик пищевода и глазных дисков, чтобы удалить мозг-RG-глаз дисков комплекса из кутикулы тела.
   3. Отделить пищевод и кишечник от мозга-RG-глаз дискового комплекса с типсами. Так как пищевод проходит через мозг над желудочковым нервным шнуром (VNC), вытащить кишечник на заднюю сторону.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы удалить дополнительные воображаемые диски из образцов, вырезать связи между мозгом, глазные диски, и ноги диски с помощью иглы ножом.
   4. Повторите шаги 1.4.1-1.4.4 для других образцов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для предотвращения того, чтобы обломки тканей прилипли к образцам, перенесите каждый завершенный образец в другое чистое блюдо, наполненное 0,3% PBT или PBS.
   5. Перенесите образцы в центр чистой стеклянной горки с помощью микропипеда.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для^2-й или^3-й личинки instar, конец наконечника микропипетры должны быть усечены лезвием бритвы.
   6. Под рассечением микроскопа, выровнять отдельные образцы с их спинной стороне вверх с помощью типсов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: RG расположен на спинной стороне мозга (рисунок2A). Такое выравнивание облегчает спецификацию отдельных образцов во время визуализации.
   7. Наклоните стеклянную горку и стереть как можно больше избыточного PBT, как это возможно. Положите каплю монтажа реагента на стороне слайда. Поместите край крышки скольжения с другой стороны капли и положить крышку скольжения на образцы медленно с типсами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура предотвращает перемещение образцов за пределы крышки скольжения.
   8. Храните образцы при 4 градусах Цельсия. Храните образцы в темноте.

Representative Results

Рисунок 1: Общая схема протоколов. Два различных метода вскрытия применимы к личинкам и взрослым самкам, в зависимости от цели экспериментов. Методы монтажа также разработаны в соответствии с условиями выборки. Фиксация, окрашивание и методы визуализации в основном являются общими для всех образцов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Визуализация PG и PG-проецирования нейронов. (A и B) Мозг-кольцо железы (RG) комплекс дикого типа 3 rd^instar личинки. В(B), PG очерчен пунктирными линиями. Нитейная структура между мозгом и RG является трахеей. (C-E) Иннервация PG была визуализирована с помощью mCD8::GFP, управляемой GMR45C06-GAL4 в коллекции FlyLight. PG и GFP-положительные нейроны были помечены анти-Сро антитела (пурента) и анти-GFP антитела (зеленый), соответственно. Флуоресцентное изображение сливается с передаваемым световым изображением, чтобы указать контур тканей. В (D), PG, corpora allata (CA) и corpora сердечной (CC) иллюстрируются. PG-проецирование нейронов являются более заметными в высокой мощности изображения с 40X объектив (стрелки в E), чем малой мощности изображения с 10X объектив (C). Масштабная планка 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть более широкую версию этой цифры.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Egg collection
tissue culture dish (55 mm)	AS ONE	1-8549-02	for grape-juice agar plates
collection cup	HIKARI KAGAKU
yeast paste	Oriental dry yeast, Tokyo
100% grape juice	Welch Food Inc.
rearing larvae
small vials (12ml, 40×23.5 mm, PS)	SARSTEDT	58.487
disposable loop	AS ONE	6-488-01
standard fly food			The recipe is on the website of Bloomington stock center.
Dissection
dissecting microscope	Carl Zeiss	Stemi 2000-C
dissecting microscope	Leica	S8 AP0
tissue culture dish (35 x 10 mm, non-treated)	IWAKI	1000-035
Sylgard	TORAY		coarting silicon inside dishes
Terumo needle (27G, 0.40 x 19 mm)	TERUMO	NN-2719S	A "knife" to cut the tissue
forceps, Inox, #5	Dumont, Switzerland
insect pin (0.18 mm in diameter)	Shiga Brand		for fillet dissection
micro scissors	NATSUME SEISAKUSHO CO LTD.	MB-50-10
Fixation
ultrapure water	Merck Millipore
phosphate buffered saline (PBS)
Formaldehyde	Nacalai tesque	16222-65
Paraformaldehyde	Nacalai tesque	02890-45
Triton-X100	Nacalai tesque	35501-15
microtubes (1.5 ml)	INA OPTIKA	CF-0150
Incubation
As one swist mixer TM-300 (rocker)	As one	TM-300	rocker
Bovine Serum Albumin	SIGMA	9048-46-8
Primary antibody
anti-Sro (guinea pig), 1:1000
anti-GFP (rabbit), 1:1000	Molecular Probes	A6455	Shimada-Niwa ans Niwa, 2014
anti-GFP (mouse mAb, GF200), 1:100	Nakarai tesque	04363-66
anti-5HT (rabbit), 1:500	SIGMA	S5545
anti-Hts 1B1 (mouse)	Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)	1B1
anti-DE-cadherin (rat), 1:20	DSHB	DCAD2
anti-nc82 (mouse), 1:50	DSHB	nc82
Secondary antibody
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Life Technologies	A-11008
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate	Life Technologies	A-11001
Goat anti-Rat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate	Life Technologies	A-11081
Goat anti-Guinea Pig IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate	Life Technologies	A-21435
Alexa Fluor 546 dye-conjugated phalloidin	Life Technologies	A-22283
Mounting reagents
Micro slide glass	Matsunami Glass Ind.,Ltd.	SS7213
Square microscope cover glass	Matsunami Glass Ind.,Ltd.	C218181
FluorSave reagent (Mounting reagent)	Calbiochem	345789
Transfer pipette 1 ml (Disposable dropper)	WATSON	5660-222-1S
Fly stocks
w; GMR45C06-GAL4			from Bloomington Drosophila Stock Center. (#46260)
UAS–GFP; UAS–mCD8::GFP			gifts from K. Ito, The University of Tokyo.
w[1118]
w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP
w; UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4			Li, H. H. (2014) and Alekseyenko, O. V, Lee, C. & Kravitz, E. A. (2010)
w; UAS-mCD8::GFP			from Bloomington Drosophila Stock Center. (#32188)
yw;; nSyb-GAL4			from Bloomington Drosophila Stock Center. (#51941)