Summary
ここでは、マウスの肝臓から肝星細胞の単離のための方法を説明します。星状細胞の精製のために、マウスの肝臓は、消化されています
Abstract
肝星細胞は星状形態の肝臓常駐細胞であり、肝類洞内皮細胞と肝細胞の1,2の間にDisseの空間に配置されています。星状細胞は、骨髄の前駆体に由来し、全身のビタミン1、2の80％にまで保存されています。活性化されると、星状細胞は、このように肝線維症3に貢献し、細胞外マトリックスを生成するために筋線維芽細胞に分化する。契約する能力に基づいて、筋線維芽細胞星状細胞は、門脈圧亢進症4に関連血管緊張を調節することができる。最近、我々は、肝星細胞は、強力な抗原提示細胞であり、NKT細胞だけでなく、従来のTリンパ球5をアクティブにすることができます示した。
ここでは、マウスの肝臓から肝星細胞の効率的な製造方法を示す。そのperisinusoidalローカライズのために、肝星細胞の分離は、マルチステップのプロセスです。 Disseのスペースから分離へのアクセス星状細胞をレンダリングするためには、マウスの肝臓は、消化酵素のプロナーゼEとコラゲナーゼP.以下の血流とその場で灌流され、肝臓の組織は、プロナーゼEとコラゲナーゼP の持つ追加の酵素処理に供される試験管 。その後、このメソッドは、肝星細胞のビタミンA -を格納する脂肪滴の膨大な量を利用しています。この機能は8％ナイコデンツの勾配で遠心分離によって、他の肝細胞型から星状細胞を分離することができます。ここで説明するプロトコルは、星状細胞の非常に純粋で均一な人口をもたらします。調剤の純度は、蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリーによる分析の前にマーカー分子グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）、のために染色によって評価することができる。さらに、光学顕微鏡では脂肪滴を大量に抱いて星型肝星細胞のユニークな外観を明らかにする。
一緒になって、我々は、その形態学的外観および星状細胞の実体を定義するために役立つGFAPの発現の代表画像を含む肝星細胞の効率的な分離のための詳細なプロトコールを提示する。
Protocol
C57BL / 6マウスは〜20週齢以上で使用してください。 25〜30グラムの重さ、雄マウスの使用が推奨されています。星状細胞の収量は、細胞の分離を星状に先立って2ヶ月のためにマウスにビタミンAに富む食事を供給することにより増加することができます。 Balb / cマウスからの肝星細胞の収率がかなり高いのに対し、約2 × 10 5肝星細胞は、一つC57BL / 6マウスの肝臓から精製することができる。以下のプロトコルは、5匹のマウスに調整されます。動物のケアと実験が承認された動物実験に基づき行われ、委員会のプロトコルを使用していた。
（1）マウスの肝臓の in situ灌流の消化酵素で
- 37℃の水浴中でSC1バッファーと酵素の灌流液を温める。
- 蠕動ポンプのシリコンチューブにセット翼の注入をマウントします。
- 肝臓の現場灌流のために使用される流量である6.5ml/min、の層流を得るためにPBSでポンプのキャリブレーション。 SC1溶液をシリコンチューブを平衡化する。
- ケタミン（90 mg / kg体重）及びキシラジン（10 mg / kg）のソリューションと深いnarcotizationを確保するために反射の消失のためのテストの腹腔内注射によってマウスを麻酔。
- 適当な塩基での仰臥位でマウスを修正。
- 腹部皮膚に縦切開を行い、腹膜を露出させるハサミとピンセットを使用してください。
- 慎重に門脈を露出させるために腹膜を開き、腹腔の動物の左側に腸を動かす。
- 門脈に設定された注入のカニューレを挿入します。このステップでは、実体顕微鏡の使用が推奨されます。
- 30ミリリットルSC1液と肝臓の灌流を開始します。フローの開始直後に下大静脈を開きます。肝臓の成功したフラッシュは肝臓の組織の色の消失によって示されます。
- 30ミリリットルプロナーゼE溶液を用いて肝臓を灌流。成功した消化されると、肝臓の葉が膨張します、と小葉は、カプセルを介して異なる表示されます。
- 30ミリリットルコラゲナーゼP溶液で肝臓を灌流。この時点で肝臓はその形を失い、弛緩と非晶質に見えるしている。
- 慎重に横隔膜と周囲の臓器から肝臓を分離し、氷上で70ミリリットルSC2ソリューションに格納します。
- 追加のマウスのための手順を繰り返します。
2。マウスの肝臓の in vitro消化において
それ以後のすべての作業手順は、層流フードで無菌条件下で行う必要があります。
- 良く切れるはさみを使用して約2x2x2mm 3の部分に肝臓を切り取ります。
- プロナーゼE -コラゲナーゼP溶液50mlのある肝臓の作品を含む70ミリリットルSC2のサスペンションを組み合わせるとDNase I溶液の1mlを加える。
- 37℃20分のための肝臓を消化° Cで撹拌しながら。
3。密度勾配遠心
- 6 50ミリリットルのファルコンチューブに70μmセルストレーナーを通して細胞懸濁液を濾過し、SC2バッファーで50ミリリットルまで追加。 600グラムと4℃で10分間遠心
- 注意深く上清の40ミリリットルを吸引し、各チューブに150μLDNase I溶液を追加し、細胞を懸濁します。
- 4 50ミリリットルファルコンチューブにプール細胞懸濁液をし、600グラムと4℃で10分間GBSS - B、遠心機で洗う℃に
- 慎重にペレットと各チューブへ追加150μLDNase I溶液を乱すことなく、可能な限り上清のを吸引除去する。チューブあたり10ミリリットルGBSS - Bの細胞ペレットを再懸濁します。
- プールは2 50ミリリットルファルコンチューブに細胞や試験管当たり36ミリリットルの合計体積にGBSS - Bを追加します。各チューブに14ミリリットルナイコデンツのソリューションを加え、よく混ぜる。
- 合計で10本で、その結果、一12ミリリットル勾配遠心チューブに細胞懸濁液10mlのを転送する。優しくチューブあたり1.5ミリリットルGBSS - Bで細胞懸濁液を重ねます。
- 1500グラムと4℃で15分のための勾配を遠心° Cブレーキなし。星状細胞は白い輪のような相間で発見されているのに対し、その後、肝細胞がチューブの底にペレット化されます。
- 慎重に星状細胞を含む中間相を収穫し、GBSS - Bでそれらを洗って、10分間遠心するを600グラムと4℃
- 上清を吸引除去し、10％熱不活性化FBS、1％ペニシリン/ストレプトマイシン、2mMのL -グルタミン、1mMのピルビン酸ナトリウム、及び10mMのHEPESを添加した20ミリリットルDMEMで細胞を懸濁します。 2 × 10 4細胞/ cm 2の濃度で組織培養フラスコに細胞を移す。 37℃、5％CO 2で細胞をインキュベートする。
- とすぐに肝星細胞は死細胞と細胞残渣を洗い流すために（約2時間の準備の後に）接着なので、メディアを変更します。
- 翌日、星状細胞でsは核周囲ビタミンAを格納する脂質小胞との特徴的な星型の形態を開発する必要があります。
- その後の実験では、肝星細胞は容易にそのようなAccutase、などなど、軽度の酵素的ソリューションを使用して、非コーティングプラスチック表面から切り離すことができます。
4。代表的な結果：
提供するプロトコルを使用して肝星細胞の調製後、孤立した個体群の純度は、3等星のような形としてこの細胞型の主な特性は、核周囲の脂質滴、およびグリア線維性酸性タンパク質（GFAPの発現を考慮してテストすることができます）。特徴的な細胞分離後の肝星細胞の2Hの外観だけでなく、in vitro培養の1日目及び3のための代表的な写真を図1に示されている。図2は、細胞の単離後3日間培養された肝星細胞におけるGFAPのための代表的な免疫蛍光染色を示す。肝星細胞は、in vitro培養時の筋線維芽細胞へと分化する。それらの活性化星細胞の特徴特徴は、α平滑筋アクチン（αSMA）の式です。図3は、in vitro培養の7日目に活性化星細胞のアスマとミオシンIIAのための免疫蛍光染色を示す。
図1肝星細胞の特徴的な形態。星状細胞は、提供されるプロトコルを使用してマウスの肝臓から単離された。画像は、星状細胞の細胞単離後2H（A、B）、ならびに1日目（C）とin vitro培養の3日目（D）上を表しています。肝星細胞は、核周辺部位での脂質小胞の高い量を示し、in vitro培養の最初の日（倍率200倍）の間に彼らの独特のアストラル様形態を獲得する。
図2肝星細胞は、特に肝臓でのGFAPを発現している。星細胞は、in vitro培養の3日目に単離され、immunofluorescently GFAP（赤）で染色した。細胞核は青色（ヘキスト染色）に示されている。
図3。肝星細胞が筋線維芽細胞に分化する。 C57BL / 6マウスから単離した肝星細胞は7日間培養した。その後、彼らは、チャンバースライドに移し、そしてアスマ（赤で表示）とミオシンIIA（緑で示される）のために染色した。細胞核はヘキスト（青色）で対比染色した。
| SC1バッファ | |
| EGTA | 190mg |
| グルコース | 900mg |
| HEPES | 1Mストック溶液10mlを |
| 塩化カリウム | 400mgを |
| のNa 2 HPO 4 × 2 H 2 O | 151mg |
| NaClの | 8グラム |
| のNaH 2 PO 4 × H 2 O | 78mg |
| NaHCO 3の | 350mg |
| フェノールレッド | 6mgを |
| のdH 2 O | 1リットルに一杯に |
| SC2バッファ | |
| 塩化カルシウム2 × 2H 2 O | 560mg |
| HEPES | 1Mストック溶液10mlの |
| 塩化カリウム | 400mgを |
| のNa 2 HPO 4 × 2 H 2 O | 151mg |
| NaClの | 8グラム |
| のNaH 2 PO 4 × H 2 O | 78mg |
| NaHCO 3の | 350mg |
| フェノールレッド | 6mgを |
| のdH 2 O | 1リットルに一杯に |
| GBSS -バッファ | |
| 塩化カリウム | 370mg |
| 塩化カルシウム2 × 2H 2 O | 225mg |
| グルコース | 991mg |
| KH 2 PO 4 | 30mgを |
| のMgCl 2 × 6 H 2 O | 210mg |
| MgSO 4を 365 H 2 O | 70mg |
| のNa 2 HPO 4 × 2 H 2 O | 75mg |
| NaHCO 3の | 227mg |
| フェノールレッド | 6mgを |
| のdH 2 O | 1リットルに一杯に |
| GBSS - Bバッファ | |
| 塩化カルシウム2 × 2H 2 O | 225mg |
| グルコース | 991mg |
| 塩化カリウム | 370mg |
| KH 2 PO 4 | 30mgを |
| のMgCl 2 × 6 H 2 O | 210mg |
| MgSO 4を 365 H 2 O | 70mg |
| のNa 2 HPO 4 × 2 H 2 O | 75mg |
| NaClの | 8グラム |
| NaHCO 3の | 227mg |
| フェノールレッド | 6mgを |
| のdH 2 O | 1リットルに一杯に |
| プロナーゼEの灌流液 | |
| プロナーゼE | 100mgの（4000 PU / MG分） |
| SC2バッファ | 200ミリリットル |
| コラゲナーゼPの灌流液 | |
| コラゲナーゼP | 85mg（1.78 U / mgのlyo） |
| SC2バッファ | 200ミリリットル |
| プロナーゼE -コラゲナーゼPソリューション | |
| プロナーゼE | 50mgの（4000 PU / MG分） |
| コラゲナーゼP | 85mg（1.78 U / mgのlyo） |
| SC2バッファ | 50ミリリットル |
| DNase I溶液 | |
| DNase Iを | 6mgを（約2000U/mg） |
| GBSS - B | 3ミリリットル |
| ナイコデンツソリューション | |
| ナイコデンツ | 8グラム |
| GBSS - | 28ミリリットル |
表1。バッファと肝星細胞を分離するために必要な酵素のソリューション。すべてのバッファのpHは7.3から7.4に調整する必要があります。さらに、すべてのバッファの滅菌濾過することをお勧めします。特定の酵素活性に応じて使用される酵素の量を調整することが重要です。
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Discussion
肝星細胞は肝臓に不可欠な生理学的および病態生理学的プロセスを調節する。また、星状細胞は、それらを肝免疫応答の重要な構成要素をレンダリングする、抗原提示特性を有する。肝星細胞が肝臓の総細胞数の10〜15％を占めるが、これらの細胞の分離は、Disseの類洞周囲腔に局在のために挑戦している。
ここでは、 現場消化およびその後の勾配遠心分離のことで、マウスの肝臓から肝星細胞を分離する簡単な方法を提示する。このプロトコルは、免疫学的アッセイに適した高純度の星状細胞の単離を可能にします。
単離された細胞の実体は、星状、核周囲のビタミンを格納する脂質小胞、およびGFAPの発現を含む、肝星細胞の三大特徴を、考慮して制御することができます。免疫蛍光染色およびフローサイトメトリーによって評価されるようにこれらの基準によると、記述されたプロトコルを使用して得られる星状細胞は、日常的に〜99％純粋です。星状細胞のアイソレーションの潜在的な汚染物質は、クッパー細胞と肝臓の樹状細胞（DC）です。したがって、我々は、表面分子F4/80（クッパー細胞）およびCD11c（DC）のためのフローサイトメトリー染色で星状細胞培養を分析した。したがって、F4/80の欠如+およびCD11c +細胞はクッパー細胞や樹状細胞による星状細胞製剤の汚染を除外する。従って、それ以上濃縮またはソートの方法は、肝星細胞の分離、便利で高速な手順については、記述されたプロトコルをレンダリングする、必要ありません。
肝星細胞の実体に関しては、それは 、in vitro培養細胞で活性化になると静止星状細胞から根本的に異なっている筋線維芽細胞に分化することを心に留めておくことが重要です。この変態の間に、肝星細胞が緩んでGFAPの発現と容易にin vitro培養 7日目で検出することができますαSMAを、アップレギュレートする。特に、in vitroで肝星細胞の活性化が強く生体 6 のそれらの活性化パターンに似ています。これは、肝線維症への関与、などで反射され、とはいえ、他のコラーゲン産生筋線維芽細胞の集団は、病気の開発7に寄与する。結論として、記述されたプロトコルで得られた肝星細胞は、静止星細胞のためだけでなく、それらの分化段階に応じて活性化肝筋線維芽細胞のモデルを提供しています。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この作品は、生物医学研究とNIH RO1 AI083426 - 01（FW）の卓越性のためのスミスファミリー賞によって資金を供給された。パトリックMaschmeyerとメラニーフラックは、ベーリンガーインゲルハイム財団からの博士課程の奨学金によってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70μm Cell Strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| CaCL2 x 2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Collagenase P | Roche Group | 11249002001 | |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 11960 | |
| DNase I | Roche Group | 10104159001 | |
| DPBS | Cellgro | 21-031-cv | |
| EGTA | Fluka | 3777 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, by Life Technologies | 16000 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Gradient Centrifugation Tubes | Greiner Bio-One | 163160 | |
| HEPES | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | |
| KCL | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| L-Glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| MgCl2 x 6H2O | Fluka | 63068 | |
| MgSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| Na2HPO4 x 2H2O | Fluka | 71643 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| NaH2PO4 x H2O | Fluka | 71507 | |
| NaHCO3 | Fluka | 71628 | |
| Nycodenz | Accudenz AG | AN7050/BLK | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| Peristaltic Pump | Cole-Parmer | HV-7523-70 | |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P4633 | |
| Pronase E | Calbiochem | 7433-2 | |
| Silicone Tube | Masterflex (Cole Palmer) | HV-96440-14 | |
| Sodium Pyruvate | GIBCO, by Life Technologies | 11360 | |
| Tissue culture flask (25cm2) | BD Biosciences | 353108 | |
| Winged Infusion Set | Terumo Medical Corp. | 1SV27EL |
References
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- Geerts, A. H. istory heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate cells. Semin Liver Dis. 21, 311-335 (2001).
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