Summary
Burada fare karaciğer hepatik stellat hücrelerin izolasyonu için bir yöntem açıklanmaktadır. Stellat hücre saflaştırma için, fare ciğeri sindirilir
Abstract
Karaciğer yıldız gibi morfoloji stellat hücreleri, karaciğer yerleşik hücreleri ve karaciğer sinüzoidal endotel hücreleri ve hepatositlerde 1,2 arasında Disse bir boşluk bulunmaktadır . Stellat hücreler, kemik iliği öncüleri türetilen ve toplam vücut A vitamini 1, 2% 80 kadar mağaza vardır . Stellat hücrelerin aktivasyonu üzerine, böylece karaciğer fibrozu 3 katkıda miyofibroblastlar içine ekstraselüler matriks üretmek için ayırt. Sözleşme yeteneklerini dayanarak, miyofibroblastik stellat hücreleri, portal hipertansiyon 4 ile ilişkili vasküler tonunu ayarlayabilir . Son zamanlarda, hepatik stellat hücreler güçlü antijen sunan hücreler ve NKT hücrelerinin yanı sıra, geleneksel T lenfositleri 5 etkinleştirebilirsiniz gösterdi.
Burada, fare karaciğer hepatik stellat hücrelerinin etkin bir şekilde hazırlanması için bir yöntem mevcut. Perisinüzoidal yerelleştirme nedeniyle, hepatik stellat hücreler izolasyonu çok adımlı bir süreçtir. Stellat hücreler Disse uzay izolasyon erişilebilir kılmak için, fare ciğeri, sindirim enzimleri Pronase E ve kollajenaz P. ardından perfüzyon ile in situ perfüze olan, karaciğer doku Pronase E ve kollajenaz P ile ek enzimatik muameleye tabi tutulur in vitro. Daha sonra, bu yöntem büyük miktarda A vitamini depolama hepatik stellat hücreler lipid damlacıkları yararlanır. Bu özellik,% 8 Nycodenz degrade santrifüj diğer karaciğer hücre tipleri stellat hücrelerin ayrılmasını sağlar. Burada açıklanan protokol stellat hücreler son derece saf ve homojen bir nüfus verir. Hazırlıkları Saflık floresan mikroskobu veya flow sitometri analizi öncesinde marker molekül glial fibriller asidik protein (GFAP), boyama ile tespit edilebilir. Ayrıca, ışık mikroskobu, yüksek miktarda lipid damlacıklarının limanı yıldız şeklinde hepatik stellat hücreler benzersiz bir görünüm ortaya koymaktadır.
Birlikte ele alındığında, biz temsilcisi morfolojik görünüm görüntüleri ve stellat hücre varlık tanımlamak için yardımcı GFAP ifade de dahil olmak üzere hepatik stellat hücreler, verimli izolasyonu için ayrıntılı bir protokol mevcut.
Protocol
C57BL / 6 fareler ~ 20 hafta veya daha büyük yaş kullanılmalıdır. 25-30g ağırlığındaki erkek farelerin kullanılması tavsiye edilir. Stellat hücrelerin hücre izolasyonu stellat önce 2 ay süreyle fareler A vitamini ile zenginleştirilmiş diyet beslenme verim artırılabilir. Balb / c farelerinde stellat hücreler verimi oldukça yüksek iken, yaklaşık 2x10 5 hepatik stellat hücreler, bir C57BL / 6 fare karaciğer arınmış olabilir. Aşağıdaki protokolü 5 farelere ayarlanır. Hayvan bakım ve deney onaylanan Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu protokolleri uyarınca yapıldı.
1. fare ciğeri in situ perfüzyon sindirim enzimleri
- 37 ° C su banyosunda SC1 tampon ve enzim perfüzyon çözümleri ısıtın.
- Kanatlı bir infüzyon peristaltik bir pompa silikon tüp üzerine monte edin.
- PBS ile pompa karaciğer in situ perfüzyon için kullanılacak olan akış hızı 6.5ml/min, laminer akış elde etmek için kalibre edin. SC1 çözümü ile silikon tüp dengelenmesi.
- Ketamin (90 mg / kg) ve Xylazine çözümü ve derin bir uyuşturma sağlamak için reflekslerin kaybı için test (10 mg / kg) intraperitoneal enjeksiyonu ile fare anestezisi.
- Uygun bir kaide üzerinde yatar pozisyonda fare sabitleyin.
- Karın deride uzunlamasına bir kesi yapmak ve periton maruz makas ve forseps kullanın.
- Periton dikkatlice açın ve portal ven göstermek için karın boşluğunun sol tarafında hayvan bağırsaklarında dışına taşımak.
- Portal ven içine infüzyon kanülü takın. Bu adım için, bir stereomikroskopta kullanılması tavsiye edilir.
- 30ml SC1 çözümü ile karaciğer perfüzyon başlayın. Vena kava inferiyor akışını başlatmak hemen sonra açın. Başarılı kızarma karaciğer, karaciğer doku renk kaybı ile gösterilir.
- 30ml Pronase E çözümü ile karaciğer serpmek. Başarılı sindirim üzerine, karaciğer loblar şişmeye ve lobülleri kapsül ile farklı görünecektir.
- 30ml kollajenaz P çözümü ile karaciğer serpmek. Bu noktada karaciğer şeklini kaybetmiş ve atonik ve şekilsiz görünüyor.
- Diyafram ve çevre organların dikkatle karaciğer ayrı ve 70ml SC2 çözüm buz üzerinde saklayın.
- Ek fareler için prosedürü tekrarlayın.
2. Fare ciğeri in vitro sindirim
Ilave bütün adımlar bir laminer akış kaputu steril koşullar altında yapılmalıdır.
- Ciğeri keskin bir makas kullanarak yaklaşık 2x2x2mm 3 parçalar halinde kesin.
- Pronase E-kollajenaz P çözüm 50ml ile karaciğer parçaları dahil olmak üzere 70ml SC2 askıya birleştirin ve DNaz I çözüm 1ml eklemek.
- 37 20dk için ciğeri Digest ° C karıştırma.
3. Yoğunluk gradient santrifüj
- 6 50ml Falcon tüpler içine 70μm hücre süzgeçler ile hücre süspansiyonu Filtre ve SC2 tampon ile 50ml kadar ekleyin. 600g ve 4 ° C de 10 dakika süreyle Santrifüj
- Süpernatantı dikkatlice 40ml aspirat, daha sonra her tüpe 150μl DNaz I çözümü eklemek ve hücreleri tekrar süspansiyon.
- 4 50ml Falcon tüpler içine Havuzu hücre süspansiyonları ve GBSS-B, santrifüj, 600g ve 4 10 dakika süreyle yıkayın ° C
- Pelet ve her tüp eklemek 150μl DNaz I çözüm rahatsız etmeden dikkatlice aspire kadar mümkün olduğunca süpernatant. 10ml tüp başına GBSS-B hücre pelet yeniden süspanse edin.
- Havuz 2 50ml Falcon tüpler içine hücre ve tüp başına 36ml toplam hacmi GBSS-B. Her bir tüp 14ml Nycodenz çözümü ekleyin ve iyice karıştırın.
- Toplam 10 tüp sonuçlanan hücre süspansiyonu, 10ml 12ml degrade santrifüj tüpü içine aktarın. 1.5ml GBSS-B için tüp yavaşça hücre süspansiyonu kaplaması.
- 1500g ve 4 15dk için gradyanlar Santrifüj ° C frensiz. Daha sonra ise stellat hücreleri, beyaz bir halka olarak interfaz bulunan, hepatositler tüpün alt kısmında pelet olacaktır.
- Stellat hücreler içeren interfaz dikkatlice hasat ve GBSS-B ile yıkayın; 600g ve 4 santrifüj 10dk ° C
- Süpernatantı aspire ve% 10 ısı inaktive FBS,% 1 Penisilin / Streptomisin, 2mm L-Glutamine, 1mm sodyum piruvat ve 10mM Hepes ile desteklenmiş 20ml DMEM hücrelerin tekrar süspansiyon haline getirin. 2x10 4 hücre / cm 2 'lik bir konsantrasyon hücrelerin doku kültürü şişeler içine aktarın. 37 ° C ve% 5 CO 2 hücreleri inkübe edin.
- Medya hepatik stellat hücreleri kısa bir süre (yaklaşık 2 saatlik hazırlıktan sonra) yapışık ölü hücreleri ve hücre artıkları yıkayın olarak değiştirin.
- Ertesi gün, stellat hücres perinükleer A vitamini depolama lipid veziküller ile karakteristik yıldız şeklinde morfoloji geliştirmelidir.
- Sonraki deneyler için, hepatik stellat hücreler Accutase, örneğin hafif bir enzimatik çözümlerini kullanarak kaplı olmayan plastik yüzeylere kolayca ayrılabilir
4. Temsilcisi Sonuçlar:
Sağlanan protokolü kullanılarak hepatik stellat hücreler hazırlanmasını takiben, izole nüfusun saflık glial fibriller asidik protein yıldıza benzer şekil, perinükleer lipid damlacıkları ve anlatım (GFAP gibi bu hücre tipi üç temel özellikleri göz önüne alınarak test edilebilir .) Hücre izolasyonunu takiben hepatik stellat hücreler 2s karakteristik bir görünüm yanı sıra, in vitro kültüründe 1 ve 3 gün Temsilcisi resimler Şekil 1'de tasvir edilmektedir . Şekil 2, hepatik stellat hücreler, hücre izolasyonu takiben 3 gün süreyle kültüre GFAP için bir temsilci immünofloresan boyama gösterir. Hepatik stellat hücreler in vitro kültür sırasında miyofibroblastik hücrelerine ayırt . Bu aktive stellat hücrelerin karakteristik damgasını alfa düz kas aktin (αSMA) ifadesidir. Şekil 3 in vitro kültüründe gün 7 stellat hücreleri aktive ASMA ve miyozin IIA immünofloresan boyama gösterir .
Şekil 1 hepatik stellat hücreler karakteristik morfolojisi. Stellat hücreleri kullanarak fare ciğeri sağlanan protokol izole edildi. Görüntüleri stellat hücreler hücre izolasyonu sonra 2s (a, b) yanı sıra, günde 1 (c) ve 3 (d) in vitro kültüründe gün betimliyor . Hepatik stellat hücreler yüksek miktarda lipid veziküllerin perinükleer sitelerinde sergilerler ve in vitro kültüründe ilk gün (Büyütme 200x) sırasında kendi ayırt edici astral gibi morfoloji kazanmak .
Şekil 2 Karaciğer stellat hücreler, özellikle karaciğer GFAP ifade . Stellat hücreler, in vitro kültüründe gün 3 izole ve immunofluorescently GFAP (kırmızı) için boyandı. Hücre çekirdekleri mavi (leke Hoechst) tasvir edilmektedir.
Şekil 3. Karaciğer stellat hücreler miyofibroblastlar farklılaşırlar. 7 gün boyunca C57BL / 6 farelerinde izole hepatik stellat hücreler kültüre edildi. Daha sonra, odasına slaytlara aktarılır ve ASMA (kırmızı ile gösterilen) ve miyozin IIA (yeşil tasvir) için boyandı. Hücre çekirdekleri Hoechst (mavi) ile zıt.
| SC1 Tampon | |
| EGTA | 190mg |
| Glikoz | 900mg |
| Hepes | 10 ml 1M stok solüsyonu |
| KCl | 400mg |
| Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O | 151mg |
| NaCl | 8g |
| NaH 2 PO 4 x H 2 O | 78mg |
| NaHCO 3 | 350mg |
| Fenol Kırmızı | 6mg/dl |
| dH 2 O | 1l için doldurmak |
| SC2 Tampon | |
| CaCl 2 x 2H 2 O | 560mg |
| Hepes | 1M stok solüsyonu, 10ml |
| KCl | 400mg |
| Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O | 151mg |
| NaCl | 8g |
| NaH 2 PO 4 x H 2 O | 78mg |
| NaHCO 3 | 350mg |
| Fenol Kırmızı | 6mg/dl |
| dH 2 O | 1l için doldurmak |
| GBSS-A Tampon | |
| KCl | 370mg |
| CaCl 2 x 2H 2 O | 225mg |
| Glikoz | 991mg |
| KH 2 PO 4 | 30mg |
| MgCl 2 x 6 H 2 O | 210mg |
| MgSO 4 x 7 H 2 O | 70mg |
| Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O | 75mg |
| NaHCO 3 | 227mg |
| Fenol Kırmızı | 6mg/dl |
| dH 2 O | 1l için doldurmak |
| GBSS-B Tampon | |
| CaCl 2 x 2H 2 O | 225mg |
| Glikoz | 991mg |
| KCl | 370mg |
| KH 2 PO 4 | 30mg |
| MgCl 2 x 6 H 2 O | 210mg |
| MgSO 4 x 7 H 2 O | 70mg |
| Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O | 75mg |
| NaCl | 8g |
| NaHCO 3 | 227mg |
| Fenol Kırmızı | 6mg/dl |
| dH 2 O | 1l için doldurmak |
| Pronase E Perfüzyon Çözüm | |
| Pronase D | 100mg (4000 PU / mg dak.) |
| SC2 Tampon | 200ml |
| Kollajenaz P Perfüzyon Çözüm | |
| Kollajenaz P | 85mg (1.78 U / mg LYO) |
| SC2 Tampon | 200ml |
| Pronase E-kollajenaz P Çözüm | |
| Pronase D | 50mg (4000 PU / mg dak.) |
| Kollajenaz P | 85mg (1.78 U / mg LYO) |
| SC2 Tampon | 50ml |
| DNaz I Çözümü | |
| DNaz I | 6 mg (yaklaşık 2000U/mg) |
| GBSS-B | 3ml |
| Nycodenz Çözüm | |
| Nycodenz | 8g |
| GBSS-A | 28ml |
Tablo 1. Tamponlar ve hepatik stellat hücrelerin izolasyonu için gerekli enzim çözümleri. Tüm tamponları pH 7,3-7,4 ayarlanmış olmalıdır. Ayrıca, tüm tamponlar steril filtrasyon tavsiye edilir. Verilen enzimatik aktivite göre kullanılan enzim miktarı uyum önemlidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Karaciğer stellat hücreler karaciğer temel fizyolojik ve patofizyolojik süreçleri düzenler. Ayrıca, stellat hücreler karaciğer bağışıklık yanıtının önemli bir bileşeni render, antijen sunan özelliklere sahip. Hepatik stellat hücreler karaciğer toplam hücre sayısı% 10-15 oluşturan rağmen, bu hücrelerin izolasyonu Disse perisinüzoidal uzayda lokalizasyonuna nedeniyle zordur.
Burada yerinde sindirim ve sonraki gradient santrifüj fare ciğeri hepatik stellat hücreler izole etmek için basit bir yöntem mevcut. Bu protokol, immünolojik testleri için uygun, son derece saf bir stellat hücrelerin izolasyonu izin verir.
Izole hücrelerinin varlık hepatik stellat hücreler, yıldız gibi bir şekil, perinükleer A vitamini lipid veziküller saklanması ve GFAP ifadesi de dahil olmak üzere üç ana özellikleri dikkate alınarak kontrol edilebilir. Immunofluorescent boyama ve flow sitometri ile değerlendirilen bu kriterlere göre, açıklanan protokol kullanılarak elde stellat hücreler rutin ~% 99 saf. Stellat hücre izolasyonların potansiyel kirleticiler, Kupffer hücreleri ve karaciğer dendritik hücreler (DC). Bu nedenle, yüzey molekülleri F4/80 (Kupffer hücreleri) ve CD11c (DH) için flow sitometri boyama stellat hücre kültürleri analiz etti. Buna göre, F4/80 yokluğunda + ve CD11c + hücreleri Kupffer hücreleri veya DC'ler stellat hücre hazırlıkları kirlenmesini hariç. Böylece, daha fazla zenginleşme ya da sıralama yöntemleri, hepatik stellat hücre izolasyonu rahat ve hızlı bir işlem için açıklanan protokol render gereklidir.
Hepatik stellat hücreler varlık ile ilgili olarak, in vitro kültür hücreleri aktif hale akılda tutmak ve sükunet stellat hücreler temelde farklı miyofibroblastlar içine ayırt etmek için önemlidir . Bu başkalaşım sırasında, hepatik stellat hücreleri gevşek GFAP ifade ve in vitro kültüründe gün 7 kolaylıkla tespit edilebilir αSMA upregüle . Özellikle, in vitro stellat hücrelerin aktivasyonu güçlü, in vivo 6 aktifleşme modeli andırıyor . Bu hastalık gelişme 7 katkıda diğer kollajen üreten miyofibroblast popülasyonları olsa karaciğer fibrozu, örneğin onların katılımı ile yansıtılır. Sonuç olarak, açıklanan protokol ile elde edilen hepatik stellat hücreler latent stellat hücrelerin yanı sıra kendi farklılaşma aşamasında bağlı olarak aktif karaciğer miyofibroblastlar için bir model sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma, Smith Aile Biyomedikal Araştırma ve NIH RO1 AI083426-01 (FW) Mükemmellik Ödülü tarafından finanse edildi. Patrick Maschmeyer ve Melanie Flach Boehringer Ingelheim Vakfı doktora bursları tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 70μm Cell Strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| CaCL2 x 2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| Collagenase P | Roche Group | 11249002001 | |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 11960 | |
| DNase I | Roche Group | 10104159001 | |
| DPBS | Cellgro | 21-031-cv | |
| EGTA | Fluka | 3777 | |
| Fetal Bovine Serum | GIBCO, by Life Technologies | 16000 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 | |
| Gradient Centrifugation Tubes | Greiner Bio-One | 163160 | |
| HEPES | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | |
| KCL | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 | |
| L-Glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| MgCl2 x 6H2O | Fluka | 63068 | |
| MgSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 | |
| Na2HPO4 x 2H2O | Fluka | 71643 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| NaH2PO4 x H2O | Fluka | 71507 | |
| NaHCO3 | Fluka | 71628 | |
| Nycodenz | Accudenz AG | AN7050/BLK | |
| Penicillin/Streptomycin | GIBCO, by Life Technologies | 15140 | |
| Peristaltic Pump | Cole-Parmer | HV-7523-70 | |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P4633 | |
| Pronase E | Calbiochem | 7433-2 | |
| Silicone Tube | Masterflex (Cole Palmer) | HV-96440-14 | |
| Sodium Pyruvate | GIBCO, by Life Technologies | 11360 | |
| Tissue culture flask (25cm2) | BD Biosciences | 353108 | |
| Winged Infusion Set | Terumo Medical Corp. | 1SV27EL |
References
- Friedman, S. L. Hepatic stellate cells: protean, multifunctional, and enigmatic cells of the liver. Physiol Rev. 88, 125-172 (2008).
- Geerts, A. H. istory heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate cells. Semin Liver Dis. 21, 311-335 (2001).
- Gressner, A. M. &, Weiskirchen, R. Modern pathogenetic concepts of liver fibrosis suggest stellate cells and TGF-beta as major players and therapeutic targets. J Cell Mol Med. 10, 76-99 (2006).
- Reynaert, H., Thompson, M. G., Thomas, T., Geerts, A. Hepatic stellate cells: role in microcirculation and pathophysiology of portal hypertension. Gut. 50, 571-581 (2002).
- Winau, F. Ito cells are liver-resident antigen-presenting cells for activating T cell responses. Immunity. 26, 117-129 (2007).
- Minicis, S. D. e Gene expression profiles during hepatic stellate cell activation in culture and in vivo. Gastroenterology. 132, 1937-1946 (2007).
- Knittel, T. Localization of liver myofibroblasts and hepatic stellate cells in normal and diseased rat livers: distinct roles of (myo-)fibroblast subpopulations in hepatic tissue repair. Histochem Cell Biol. 112, 387-401 (1999).
