Summary
تم وصف طريقة لإعداد واحدة من خلايا مستقبلة للضوء الذين يعيشون نوعا من الفقاريات المختلفة للتصوير مضان. ويمكن استخدام هذه الطريقة لصورة مضان من fluorophores الذاتية ، مثل NADH أو فيتامين (أ) ، أو أن من الأصباغ الفلورية خارجيا وأضاف حساسة لكاليفورنيا
Abstract
في شبكية الفقاريات ، ويتم phototransduction ، وتحويل الضوء إلى إشارات كهربائية وبها قضبان وخلايا مستقبلة للضوء مخروط 1-4. قضيب مبصرات هي المسؤولة عن الرؤية في الضوء الخافت ، والأقماع في الضوء الساطع. Phototransduction يحدث في الجزء الخارجي للخلية مستقبلة للضوء ، حجرة المتخصصة التي تحتوي على نسبة عالية من الأصباغ البصرية ، وكاشف الضوء الأساسي. تتكون صبغة بصرية من حامل اللون ، 11 -- رابطة الدول المستقلة في شبكية العين ، تعلق على البروتين ، opsin. الفوتون تمتصه صبغة بصرية isomerizes حامل اللون في الفترة من 11 -- رابطة الدول المستقلة إلى العابرة للجميع. الايزوميرة الضوئية يجلب هذا التغيير متعلق بتكوين في الصباغ البصرية الذي يبدأ سلسلة من ردود الفعل وبلغت ذروتها في تغيير محتمل في الغشاء ، وإحداث تنبيغ من التحفيز الضوء إلى إشارات كهربائية. استعادة الخلية من التحفيز تنطوي على ضوء التعطيل من وسيطة تفعيلها من خلال الضوء ، وإمكانات إعادة الغشاء. كاليفورنيا 2 + ينظم نشاط العديد من الأنزيمات المشاركة في phototransduction ، ويتم تقليل تركيزه على تحفيز الضوء. في هذه الطريقة ، كا 2 + يلعب دورا مهما في استعادة الخلية من التحفيز الخفيفة والتكيف للضوء الخلفية.
آخر جزء أساسي من عملية الانتعاش هو تجديد الصباغ البصرية التي تم تدميرها خلال الكشف عن الضوء من قبل الايزوميرة الضوئية من 11 في -- حامل اللون رابطة الدول المستقلة على جميع العابر 5-7. هذا التجدد تبدأ الافراج عن ريتينال مفروق من الصباغ photoactivated ، مخلفين وراءهم opsin الاشتقاق البروتين. يتم تقليل بسرعة الإفراج عن جميع العابر الشبكية في رد فعل على جميع الاستفادة من NADPH العابر الريتينول ، ويجمع بين opsin الطازجة مع 11 -- رابطة الدول المستقلة الشبكية جلبت الى الجزء الخارجي لإصلاح صبغة بصرية. ثم يتم نقل جميع العابر الريتينول من الجزء الخارجي والى الخلايا المجاورة من البروتين الناقل المتخصصة ريتينويد Interphotoreceptor تجليد (IRBP).
ويمكن استخدام التصوير مضان من خلايا مستقبلة للضوء واحد لدراسة علم وظائف الأعضاء وبيولوجيا الخلية. كاليفورنيا 2 + يمكن حساسة الأصباغ الفلورية يمكن استخدامها لفحص بالتفصيل التفاعل بين الجزء الخارجي كا 2 + التغيرات والاستجابة للضوء 12/08 فضلا عن دور الكالسيوم الجزء الداخلي 2 + مخازن في كا 2 + التوازن 13،14 . ويمكن أيضا أن تستخدم الأصباغ الفلورية لقياس تركيز المغنيسيوم 2 + 15 ، ودرجة الحموضة ، وكأثر من الغشاء المائي والمقصورات 16. أخيرا ، يمكن استخدام مضان الجوهرية للجميع عبر الريتينول (فيتامين أ) لرصد حركية من تشكيلها ، وإزالة خلايا مستقبلة للضوء في واحدة 17-19.
Protocol
1. إعداد أطباق Sylgard المغطاة وغرف التجريبية ، وشفرات الحلاقة
- وهناك حاجة إلى 35 مم فالكون أطباق بتري المغلفة مع الاستومر Sylgard لتقطيع السليم للشبكية معزولة للحصول على خلايا مستقبلة للضوء واحدة. مستعدة الاستومر وفقا لتعليمات المورد وسكب كمية صغيرة في كل صحن لتغطية الجزء السفلي مع طبقة. استبدال الطبق بعد يغطي الطلاء وتخزينها. في غضون الأيام القليلة المقبلة لالاستومر يصلب وأطباق جاهزة.
- مبصرات معزولة ضرورة التمسك الجزء السفلي من الغرفة التجريبية بحيث انهم ثبتوا خلال تجربة التصوير. ويتحقق ذلك عن طريق طلاء قيعان الغرف مع بولي - L - يسين أو بولي - L الأورنيثين. إضافة 200 ميكرولتر من محلول 0.01 ٪ من أي واحد لكل دائرة ، ويغطي الغرف مع منشفة ورقية لحمايتها من الغبار. بعد حل قد جفت ، وغسل بالماء المقطر غرف ومخزن في صندوق مغلق. الاستخدام في حدود 2 أسابيع.
- لتنظيف الغرف في نهاية التجربة ، ويغسل لهم الإيثانول بنسبة 100 ٪ لإزالة أي نفط من النفط عدسة الغمر والحطام الخلية. لإزالة الحطام الخلية ، واستخدام القطن يميل تطبيقها بعناية وفرك الجزء السفلي من الغرفة. بعد ذلك ، ويغسل بالماء المقطر ، والسماح للغرف يجف قبل إعادة الطلاء.
- خفض شفرات الحلاقة ذو حدين الى قطع صغيرة (8 من شفرة واحدة) مع قطع معدنية.
2. إعداد الحلول
- تشكيل لحلول تعتمد على الأنواع. لالبرمائيات ، والتي قد رينغر (في ملمول / لتر) : 110 كلوريد الصوديوم ، 2.5 بوكل ، 1.6 MgCl 2 ، 1 CaCl 2 ، 5 HEPES ، ودرجة الحموضة = 7.55. ينبغي تعديل درجة الحموضة إلى القيمة النهائية مع هيدروكسيد الصوديوم. للثدييات ، والتي قد رينغر (في ملمول / لتر) : 130 كلوريد الصوديوم ، 5 بوكل ، 0.5 MgCl 2 ، 2 CaCl 2 ، 25 - hemisodium HEPES ، ودرجة الحموضة = 7.40. يمكن أن تظل الحل رينغر مختومة جيدا في درجة حرارة الغرفة لمدة بضعة أشهر.
- محلول الجلوكوز المخزون ، 1 مول / لتر ، يحتفظ بها في -20 درجة مئوية لتفادي نمو البكتيريا.
- في يوم من التجربة ، إضافة إلى الجلوكوز الحل رينغر إلى تركيز النهائي من 5 ملمول / لتر. في نهاية اليوم ، وتجاهل لرينغر الذي يحتوي على الجلوكوز لأنه قد تنمو البكتيريا.
3. عزلة شبكية العين
- لالختان السليم لشبكية العين من المهم أن تكون مظلمة الحيوان مكيفة على الأقل 2-3 ساعات قبل التضحية. وينبغي أن تكون مظلمة الحيوانات مكيفة في وعاء مناسب التهوية في غرفة مظلمة.
- 35 ملم ملء two أطباق بتري في منتصف الطريق مع الحل رينغر.
- التضحية الحيوانية تحت ضوء أحمر خافت وإزالة العينين. بعد ذلك ، يتم تنفيذ كافة الإجراءات تحت ضوء الأشعة تحت الحمراء باستخدام مجهر تشريح أو الكاميرا مع جهاز الفيديو.
- إزالة أي نوع من الأنسجة المتبقية من السطح الخارجي للعين. قطع وإزالة الجزء الأمامي ، ثم نقل فنجان العين في واحدة من أطباق بتري مليئة رينغر.
- إزالة الجسم الزجاجي والشبكية منفصلة بعناية من بقية فنجان العين بواسطة قبالة معسر أو قطع أي مرفقات. رفع بلطف شبكية العين وفصلها تماما من فنجان العين.
- نقل الشبكية إلى صحن بيتري الثانية مع نقل ماصة بلاستيكية. الحفاظ على صحن يحتوي على شبكية العين في ضوء مربع محكم.
4. عزل خلايا مستقبلة للضوء واحد
- تتم جميع الإجراءات تحت ضوء الأشعة تحت الحمراء. قطع قطعة صغيرة من شبكية العين وتحويلها مع ماصة بلاستيكية لطبق Sylgard المغطاة. وينبغي أن حجم محلول يحتوي على قطعة من شبكية العين حوالي 250 ميكرولتر.
- الاستيلاء على قطعة صغيرة من شفرة الحلاقة مع حامل شفرة -- على حافة شفرة ينبغي أن تكون في زاوية ما يقرب من 45 ° لحاملها. تتسطح قطعة من شبكية العين على طبقة Sylgard واستخدام شفرة يقطع قطعة من شبكية العين ناعما مع الحفاظ على تمسك طبقة Sylgard.
- نقل 200 ميكرولتر من محلول يحتوي على الخلايا إلى الغرفة التجريبية -- ترك أي قطعة المتبقية للشبكية في صحن Sylgard المغطاة. إبقاء الغرفة مع الخلايا المعزولة في ضوء مربع محكم.
- الانتظار لمدة 10 دقيقة للخلايا ليستقر ، ثم إضافة 2-3 مل من رينغر. في هذه المرحلة ، يمكن تحميلها على الخلايا المعزولة مع صبغة الفلورسنت معينة (على سبيل المثال Fura - 2) وفقا لبروتوكول تحميل صباغة.
- ويمكن الآن أن تؤخذ الخلايا إلى مرحلة مجهر لإجراء التجارب.
5. مضان التصوير
- نقل الغرفة الى مرحلة epifluorescence المجهر. ضبط نضح الحل ، مجسات درجة الحرارة ، والإضاءة بالأشعة تحت الحمراء ، الخ.
- إغلاق الستائر وبدء التجربة. بدوره على ضوء الأشعة تحت الحمراء داخل القفص المجهر ، والتركيز على الجزء السفلي من الغرفة التجريبية ، والتحرك في المرحلة يبحث عن الخلايا.
6. ممثل النتيجةليالي :
التين. 1 يبين مورفولوجية قضيب معزولة صحية ومبصرات مخروط حصل مع هذا البروتوكول من شبكية العين (Ambystoma tigrinum) السمندل. وقد استخدمت خلايا السمندل نطاق واسع لدراسات الخلايا التصوير مضان واحد بسبب كبر حجمها وقدرتها على البقاء على قيد الحياة لعدة ساعات بعد بمعزل عن شبكية العين. بالإضافة إلى ذلك ، من شبكية العين لا يمكن للمرء الحصول على السمندل بانتظام على حد سواء ، وقضيب مبصرات المخروط.
أحد المعايير المهمة لصحة الخلايا هي وجود الاهليلجي سليمة (الشكل 1) ، وجزء من الخلية حيث تتركز الميتوكوندريا. عند النظر إلى الخلايا تحت دابي البصريات ، وهذا يعطي تركيز الميتوكوندريا إشارة قوية مضان (الشكل 2) وذلك بسبب وجود NADH. عدم وجود الإهليلجي سليمة هو علامة على خلية معطوب ، مؤهلة للتجربة. الشكل. 3 يظهر معطوب السمندل قضيب مبصرة ، مع تورم في خلايا الجسم ، والنواة مكثف. مثل هذه الخلايا تعرض أدنى بكثير مضان تحت دابي البصريات ، ولكن ينظر تحت البصريات FITC تظهر إشارة قوية FAD في المنطقة الإهليلجي (منشؤها من النيوكليوتيدات فلافين المؤكسد وflavoproteins). معيار آخر للمحافظة على الصحة من مبصرات معزولة هي قدرتها على توليد جميع العابر الريتينول (فيتامين أ) في القطاعات التي تعمل فيها على التحفيز الخارجي من الضوء. جيل من فيتامين (أ) يتطلب كميات كبيرة من NADPH ، التي تعتمد على الآلات الأيضية سليمة. أرقام 4 و 5 اظهار تشكيل فيتامين (أ) في قطاعات الخارجي من الضفادع سليمة وقضيب مبصرات الماوس على التوالي.
الشكل 1. وقد تم عزل صحي واحد وقضيب مبصرات المخروط ، وخلايا الشبكية من السمندل نمر. Phototransduction يحدث في الجزء الخارجي والمزدحمة بالسكان في الإهليلجي مع الميتوكوندريا. قضبان هي المسؤولة عن رؤية الضوء الخافت ، والأقماع لرؤية الضوء الساطع.
الشكل 2. مضان المعيشة السمندل قضيب والمخروط ، وهذه هي داكنة تكييف الخلايا ، والاداء القوي في مضان NADH مجسمات القطع الناقص كل منهما وليس فيتامين A مضان كبيرة في القطاعات التي تعمل فيها الخارجي. التقاط صورة مضان يمثل التعرض لأول مرة في الضوء المرئي بعد فترة من التكيف الظلام.
الشكل 3. تضررت السمندل قضيب مبصرة ، وخلايا الجسم وتورم نواة مكثفة تدل على الضرر. يتأكسد الخلية وليس هناك أدنى إشارة NADH (دابي البصريات) ، ولكن أقوى بكثير إشارة FAD (FITC البصريات).
الشكل 4. الضفدع مع قضيب NADH والريتينول ، وهذا هو قضيب الضفدع صحية مبصرة قويا مضان NADH في المنطقة الإهليلجي. قبل التعرض للضوء وجود الحد الأدنى من مضان في الجزء الخارجي. بعد التعرض للضوء ، وهناك زيادة كبيرة في الجزء الخارجي مضان نظرا لتشكيل فيتامين أ.
الشكل 5. الفأر مع قضيب الريتينول ، وهذا هو قضيب مبصرة الماوس صحية كبيرة تظهر مضان الجزء الخارجي بعد التعرض للضوء نتيجة لتكوين فيتامين (أ) المناطق الإهليلجي من قضيب مبصرات الماوس لا تظهر إشارة قوية مضان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
إذا لم يتم الحصول على الخلايا المعزولة صحية ، والمشكلة تكمن إما العزلة أو صحة شبكية العين أو مع تقطيع والخمسين. عادة ، بعد إزالة الجزء الأمامي من العين والجسم الزجاجي ، والشبكية ترفع بسهولة قبالة ظهارة الصباغ. إذا لم يكن ، في محاولة لقشر تشغيله ابتداء من محيط فنجان العين. إذا كان لا يزال من الصعب الفصل ، وهو احتمال من المرجح أن هذا الحيوان لم تتكيف مع الظلام لفترة كافية من الوقت ، أو ضوء أحمر لامع جدا. ضمان التكيف السليم داكنة للحيوان ، وخافت الضوء الأحمر. يمكن وجود المستقبلات الضوئية في الشبكية قضيب يمكن التحقق منه بسهولة عن طريق التحقق من لون الشبكية معزولة : قطع قطعة صغيرة من شبكية العين وتحويلها إلى طبق بيتري منفصل ، والتي يمكن بعد ذلك أن ينظر تحت أضواء الغرفة. قطعة من قضيب مبصرات شبكية العين تحتوي على لون أحمر (بسبب رودوبسين) الذي يتلاشى سريعا. ومن شأن قطعة عديم اللون تدل على عدم وجود رودوبسين ، وبالتالي من قضيب مبصرات. هذا قد يكون راجعا إما إلى الانفصال غير لائق للشبكية من الظهارة الصبغية الشبكية أو إلى غير صحية. في مثل هذه الحالة ، يجب عليك التأكد من صحة الحيوانات وتكيفها السليم الظلام. إذا تم الحصول على خلايا الشبكية سليمة ولكن ليست صحية معزولة ، ثم المشكلة هو الأكثر احتمالا مع التقطيع. وتقطيع غرامة أمر بالغ الأهمية : إذا كان التقطيع هو الخشنة جدا ، أو في الشبكية تصبح فاشل ، وأنه يؤدي في الغالب في قطعة من شبكية العين بدلا من خلايا منعزلة. تقطيع النتائج الجيدة عادة في "سحابة" من الخلايا التي تظهر في الحل.
يمكن التصوير مضان واحدة من خلايا المستقبلات الضوئية fluorophores استخدام الخلايا الذاتية مثل NADH ، FAD أو فيتامين (أ) ، وكذلك الأصباغ الفلورية الحساسة لعوامل مختلفة ، لبحث مجموعة واسعة من العمليات الفسيولوجية في الوقت الحقيقي. ويمكن تطبيق هذه الطريقة لأنواع عديدة ومختلفة ، بما في ذلك الحيوانات البرمائية مثل السمندل (Ambystoma tigrinum) 17،18 والضفدع (النابصة رنا) 20 ، السحالي (أبو بريص أبو بريص) 21 ، والأسماك (الزرد ، دانيو rerio) 11 ، والماوس (المصحف العضلة) 22. تمديد طريقة لخلايا فأر يسمح للدراسة لأنواع مختلفة من الحيوانات المعدلة وراثيا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
بدعم من منحة NEI EY014850.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dark room (100-150 ft2) | |||
| Red lights19 | Online stores | ||
| Infrared light sources andinfrared image viewers | FJW Optical Systems, Inc. | ||
| Dissecting microscope19 | Outfitted with infrared viewers | ||
| Epifluorescence microscope enclosed in a light-tight cage19 | |||
| Dissecting tools(scissors, forceps, blade holder) | Roboz Surgical Instruments Co. | ||
| Sylgard elastomer | Essex (Charlotte, NC) | Sylgard 184 elastomer kit | |
| Poly-L-ornithine (0.01%) | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Poly-L-lysine (0.1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | Dilute to 0.01% |
| Experimental chambers | Warner Instruments | D3512P | |
| Petri dishes, plastic pipettes | Fisher Scientific |
References
- Burns, M. E., Arshavsky, V. Y. Beyond Counting Photons: Trials and Trends in Vertebrate Visual Transduction. Neuron. 48, 387-401 (2005).
- Ebrey, T., Koutalos, Y.
- Fain, G. L., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Koutalos, Y.
- Palczewski, K.
- Saari, J. C. Biochemistry of Visual Pigment Regeneration: The Friedenwald Lecture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41, 337-348 (2000).
- Lamb, T. D., Pugh, E. N. Dark Adaptation and the Retinoid Cycle of Vision. Prog Retin Eye Res. 23, 307-380 (2004).
- Imanishi, Y., Lodowski, K. H., Koutalos, Y. Two-Photon Microscopy: Shedding Light on the Chemistry of Vision. Biochemistry. 46, 9674-9684 (2007).
- Sampath, A. P., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Fain, G. L. Bleached Pigment Produces a Maintained Decrease in Outer Segment Ca2+ in Salamander Rods. J Gen Physiol. 111, 53-64 (1998).
- Sampath, A. P., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Bandarchi, J., Fain, G. L. Light-Dependent Changes in Outer Segment Free-Ca2+ Concentration in Salamander Cone Photoreceptors. J Gen Physiol. 113, 267-277 (1999).
- Woodruff, M. L., Sampath, A. P., Matthews, H. R., Krasnoperova, N. V., Lem, J., Fain, G. L. Measurement of Cytoplasmic Calcium Concentration in the Rods of Wild-Type and Transducin Knock-out Mice. J Physiol. 542, 843-854 (2002).
- Leung, Y. T., Fain, G. L., Matthews, H. R. Simultaneous Measurement of Current and Calcium in the Ultraviolet-Sensitive Cones of Zebrafish. J Physiol. 579, 15-27 (2007).
- Matthews, H. R., Fain, G. L. Laser Spot Confocal Technique to Measure Cytoplasmic Calcium Concentration in Photoreceptors. Methods Enzymol. 316, 146-163 (2000).
- Szikra, T., Cusato, K., Thoreson, W. B., Barabas, P., Bartoletti, T. M., Krizaj, D. Depletion of Calcium Stores Regulates Calcium Influx and Signal Transmission in Rod Photoreceptors. J Physiol. 586, 4859-4875 (2008).
- Krizaj, D., Copenhagen, D. R. Compartmentalization of Calcium Extrusion Mechanisms in the Outer and Inner Segments of Photoreceptors. Neuron. 21, 249-256 (1998).
- Chen, C., Nakatani, K., Koutalos, Y. Free Magnesium Concentration in Salamander Photoreceptor Outer Segments. J Physiol. 553, 125-135 (2003).
- Chen, C., Jiang, Y., Koutalos, Y. Dynamic Behavior of Rod Photoreceptor Disks. Biophys J. 83, 1403-1412 (2002).
- Tsina, E., Chen, C., Koutalos, Y., Ala-Laurila, P., Tsacopoulos, M., Wiggert, B., Crouch, R. K., Cornwall, M. C. Physiological and Microfluorometric Studies of Reduction and Clearance of Retinal in Bleached Rod Photoreceptors. J Gen Physiol. 124, 429-443 (2004).
- Ala-Laurila, P., Kolesnikov, A. V., Crouch, R. K., Tsina, E., Shukolyukov, S. A., Govardovskii, V. I., Koutalos, Y., Wiggert, B., Estevez, M. E., Cornwall, M. C. Visual Cycle: Dependence of Retinol Production and Removal on Photoproduct Decay and Cell Morphology. J Gen Physiol. 128, 153-169 (2006).
- Koutalos, Y., Cornwall, M. C. Microfluorometric Measurement of the Formation of All-Trans-Retinol in the Outer Segments of Single Isolated Vertebrate Photoreceptors. Methods Mol Biol. 652, 129-147 (2010).
- Wu, Q., Blakeley, L. R., Cornwall, M. C., Crouch, R. K., Wiggert, B. N., Koutalos, Y. Interphotoreceptor Retinoid-Binding Protein Is the Physiologically Relevant Carrier That Removes Retinol from Rod Photoreceptor Outer Segments. Biochemistry. 46, 8669-8679 (2007).
- Kolesnikov, A. V., Ala-Laurila, P., Shukolyukov, S. A., Crouch, R. K., Wiggert, B., Estevez, M. E., Govardovskii, V. I., Cornwall, M. C. Visual Cycle and Its Metabolic Support in Gecko Photoreceptors. Vision Res. 47, 363-374 (2007).
- Chen, C., Blakeley, L. R., Koutalos, Y. Formation of All-Trans Retinol after Visual Pigment Bleaching in Mouse Photoreceptors. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 3589-3595 (2009).
