Summary
Un metodo è descritto per la preparazione di singole cellule fotorecettori che vivono da diverse specie di vertebrati per l'imaging di fluorescenza. Il metodo può essere utilizzato per l'immagine della fluorescenza di fluorofori endogeni, come la NADH o vitamina A, o quella di esogena coloranti aggiunti fluorescenti sensibili a Ca
Abstract
Nella retina dei vertebrati, fototrasduzione, la conversione della luce in un segnale elettrico, è effettuata dal bastone e coni fotorecettori 1-4. Bastoncelli sono responsabili della visione in penombra, i coni di luce. Fototrasduzione avviene nel segmento esterno della cellula fotorecettore, un comparto specializzato che contiene un'alta concentrazione di pigmento visivo, il rilevatore di luce principale. Il pigmento visivo è composto da un cromoforo, 11 - cis retinico, attaccato ad una proteina, opsina. Un fotone assorbito dal pigmento visivo isomerizza il cromoforo da 11 - cis a tutto-trans. Questo fotoisomerizzazione determina un cambiamento conformazionale nel pigmento visivo che avvia una cascata di reazioni che culmina in un cambiamento di potenziale di membrana, e determinando la trasduzione dello stimolo della luce in un segnale elettrico. Il recupero della cellula da stimolazione luminosa comporta la disattivazione degli intermedi attivati dalla luce, e il ripristino del potenziale di membrana. Ca 2 + modula l'attività dei diversi enzimi coinvolti nella fototrasduzione, e la sua concentrazione è ridotta alla stimolazione luminosa. In questo modo, Ca 2 + gioca un ruolo importante nel recupero della cellula da stimolazione luminosa e il suo adattamento alla luce di fondo.
Un'altra parte essenziale del processo di recupero è la rigenerazione del pigmento visivo che è stato distrutto durante la luce il rilevamento da parte dei suoi fotoisomerizzazione 11 - cromoforo cis a tutto-trans 5-7. Questa rigenerazione inizia con il rilascio di tutti-trans retinico dal pigmento fotoattivati, lasciandosi alle spalle l'apo-proteina opsina. La rilasciato all-trans retinico è rapidamente ridotto in una reazione che utilizza NADPH a tutto-trans retinolo e opsina combina con fresca 11 - retina cis portato nel segmento esterno di riformare il pigmento visivo. All-trans retinolo viene poi trasferito al di fuori del segmento esterno e nelle celle attigue dalla proteina specializzata retinoidi Interphotoreceptor vettore Binding (IRBP).
Imaging di fluorescenza di cellule fotorecettrici singolo può essere usato per studiare la loro fisiologia e biologia cellulare. Ca 2 +-sensitive coloranti fluorescenti possono essere utilizzate per esaminare in dettaglio l'interazione tra il segmento esterno Ca 2 + modifiche e risposta alla luce 8-12 così come il ruolo del segmento Ca 2 + interna negozi a Ca 2 + omeostasi 13,14 . Coloranti fluorescenti possono essere utilizzati anche per misurare la concentrazione di Mg 2 + 15, pH, e come traccianti di acquosa e scomparti membrana 16. Infine, la fluorescenza intrinseca di all-trans retinolo (vitamina A) può essere utilizzato per monitorare la cinetica della sua formazione e la rimozione delle cellule fotorecettori singolo 17-19.
Protocol
1. Preparazione di piatti Sylgard coperto, camere sperimentali, e lame di rasoio
- Falcon 35 millimetri Petri rivestito con elastomero Sylgard sono necessari per il corretto taglio di una retina isolata per ottenere cellule fotorecettori singolo. L'elastomero è preparato secondo le istruzioni del fornitore e una piccola quantità si riversa in ogni piatto per coprire il fondo con uno strato. Sostituire il piatto dopo il rivestimento copre e li memorizza. In pochi giorni 'l'elastomero indurisce ei piatti sono pronti.
- Fotorecettori isolato necessità di attenersi al fondo della camera sperimentale, in modo che siano immobilizzati durante il corso di un esperimento di imaging. Questo risultato è ottenuto rivestendo la fondali delle camere con poli-L-lisina o poli-L-ornitina. Aggiungere 200 ml di soluzione 0,01% di uno dei due per ogni camera, e coprire le camere con un tovagliolo di carta per proteggerli dalla polvere. Dopo che la soluzione si è asciugata, lavare le camere con acqua distillata e conservare in una scatola chiusa. Usare entro 2 settimane.
- Per la pulizia delle camere alla fine di un esperimento, lavarli con un 100% di etanolo per rimuovere l'olio dal petrolio-immersion lente e detriti cellulari. Per rimuovere i detriti cellulari, utilizzare punte di cotone e con attenzione macchia il fondo della camera. In seguito, lavare con acqua distillata e lasciare asciugare le camere prima di ri-verniciatura.
- Taglio a doppio taglio lame di rasoio in piccoli pezzi (8 da una lama) con una fresa in metallo.
2. Preparazione delle soluzioni
- La composizione delle soluzioni dipende dalla specie. Per gli anfibi, il Ringer ha (in mmol / L): 110 NaCl, 2.5 KCl, 1.6 MgCl 2, 1 CaCl 2, 5 HEPES, pH = 7.55. Il pH deve essere regolato al valore finale con NaOH. Per i mammiferi, il Ringer ha (in mmol / L): 130 NaCl, 5 KCl, 0,5 MgCl 2, 2 CaCl 2, 25 hemisodium-HEPES, pH = 7.40. La soluzione di Ringer può essere tenuto ben chiuso a temperatura ambiente per un paio di mesi.
- Soluzione di glucosio, 1 mol / L, conservato a -20 ° C per evitare la crescita batterica.
- Il giorno dell'esperimento, aggiungere il glucosio per la soluzione di Ringer ad una concentrazione finale di 5 mmol / L. Alla fine della giornata, scartare il Ringer contenente glucosio, perché possa crescere batteri.
3. Isolamento di retine
- Per la corretta asportazione di una retina, è importante che l'animale sia adattata al buio per almeno 2-3 ore prima del sacrificio. Gli animali devono essere adattata al buio in un contenitore adatto ventilata in camera oscura.
- Riempire due piastre di Petri 35 millimetri a metà strada con la soluzione di Ringer.
- Sacrificare l'animale sotto fioca luce rossa e rimuovere gli occhi. Successivamente, tutte le procedure sono effettuate sotto la luce a infrarossi utilizzando un microscopio da dissezione o una macchina fotografica con un monitor video.
- Rimuovere eventuali residui di tessuto dalla superficie esterna dell'occhio. Tagliare e rimuovere la parte anteriore, poi trasferire l'oculare in uno dei piatti pieni di Petri Ringer.
- Rimuovere il vitreo e la retina con attenzione separato dal resto della conchiglia oculare pizzicando off o tagliando gli eventuali allegati. Sollevare delicatamente la retina e separarlo pienamente il paraocchi.
- Trasferire la retina per il secondo piatto di Petri con una pipetta di trasferimento di plastica. Tenere il piatto contenente la retina in una scatola a tenuta di luce.
4. Isolamento dei fotorecettori singolo
- Tutte le procedure sono effettuate sotto la luce a infrarossi. Tagliare un piccolo pezzo di retina e trasferire con una pipetta di plastica ad un Sylgard coperto piatto. Il volume della soluzione contenente il pezzo retina dovrebbe essere di circa 250 microlitri.
- Prendete un piccolo pezzo di lama di un rasoio con il supporto della lama - il filo della lama deve essere di circa 45 ° angolo al titolare. Appiattire il pezzo di retina sullo strato Sylgard e usando la lama tagliare il pezzo di retina finemente mantenendolo attaccato allo strato Sylgard.
- Trasferire 200 microlitri della soluzione contenente le cellule ad una camera sperimentale - lasciare alcun pezzo rimanente della retina nella Sylgard coperta di piatto. Tenere la camera con le cellule isolate in una scatola a tenuta di luce.
- Attendere 10 minuti per le cellule di risolvere, quindi aggiungere 2-3 ml di Ringer. In questa fase, le cellule isolate può essere caricata con un particolare colorante fluorescente (per esempio Fura-2) secondo il protocollo di carico colorante.
- Le cellule possono ora essere adottate per la fase di microscopio per gli esperimenti.
5. Fluorescenza di imaging
- Trasferimento della camera sul palco del microscopio in epifluorescenza. Regolare perfusione soluzione, sonde di temperatura, illuminazione a infrarossi, ecc
- Chiudere le tende e iniziare a sperimentare. Accendere la luce a infrarossi all'interno della gabbia microscopio, si concentrano sul fondo della camera sperimentale, e spostare il palco in cerca di cellule.
6. Rappresentante dei risultatis:
Fig. 1 mostra la morfologia del sano asta isolati e fotorecettori coni ottenuti con questo protocollo da un (Ambystoma tigrinum) retina salamandra. Cellule salamandra sono stati ampiamente utilizzati per gli studi di imaging singola cellula fluorescenza a causa delle loro grandi dimensioni e la loro capacità di sopravvivere per parecchie ore dopo l'isolamento dalla retina. Inoltre, da una retina salamandra si può ottenere sia regolarmente bastone e fotorecettori cono.
Un criterio importante per la salute delle cellule è la presenza di un ellissoide intatta (Fig. 1), la parte della cellula dove sono concentrati i mitocondri. Quando le cellule sono visti sotto l'ottica DAPI, questa concentrazione di mitocondri dà un forte segnale di fluorescenza (Fig. 2) a causa della presenza di NADH. Mancanza di un ellissoide intatto è il segno di una cellula danneggiata, generalmente inadatti per esperimento. Fig. 3 mostra una danneggiata salamandra asta fotorecettore, con un corpo cellulare gonfio e un nucleo condensato. Tali cellule schermo molto più bassi di fluorescenza in ottica DAPI, ma visto sotto l'ottica FITC mostrano un segnale forte FAD nella regione ellissoide (provenienti da nucleotidi flavina ossidato e flavoproteine). Un altro criterio per la salute dei fotorecettori isolato è la loro capacità di generare all-trans retinolo (vitamina A) nei loro segmenti esterni alla stimolazione dalla luce. La generazione di vitamina A richiede notevoli quantità di NADPH, che dipende da un macchinario metabolico intatto. Figure 4 e 5 mostrano la formazione di vitamina A nei segmenti esterni di rana intatta e bastoncelli topo rispettivamente.
Figura 1. Sano fotorecettori singola asta e cono. Le cellule sono state isolate da una retina salamandra tigre. Fototrasduzione avviene nel segmento esterno e l'ellissoide è densamente ricco di mitocondri. Aste sono responsabili per dim visione della luce, i coni per la visione di luce intensa.
Figura 2. Fluorescenza di vivere salamandra asta e cono. Questi sono adattata al buio cellule, che mostra una forte fluorescenza NADH nei loro rispettivi ellissoidi e nessuna vitamina significativo un fluorescenza nei loro segmenti esterni. La cattura delle immagini a fluorescenza rappresenta la loro prima esposizione alla luce visibile dopo il periodo di buio-adattamento.
Figura 3. Danneggiato salamandra asta dei fotorecettori. Il corpo cellulare gonfio e il nucleo condensato sono indicativi di danno. La cella viene ossidato e non vi è minimo segnale di NADH (ottica DAPI), ma molto più forte segnale di FAD (FITC ottica).
Figura 4. Rana con asta NADH e retinolo. Questo è un sano fotorecettore asta rana che mostra una forte fluorescenza NADH nella regione ellissoide. Prima di esposizione alla luce c'è fluorescenza minima nel segmento esterno. A seguito di esposizione alla luce, vi è un significativo aumento della fluorescenza segmento esterno a causa della formazione di vitamina A.
Figura 5. Topo asta con retinolo. Questo è un sano fotorecettore asta del mouse mostrando significativi fluorescenza esterno segmento dopo l'esposizione alla luce a causa della formazione di vitamina A. Le regioni ellissoide di bastoncelli topo non mostrano un forte segnale di fluorescenza.
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Discussion
Se sano cellule isolate non si ottengono, il problema è sia con l'isolamento o la salute della retina o con il suo taglio. Di solito, dopo aver rimosso la parte anteriore dell'occhio e il vitreo, la retina ascensori prontamente spento l'epitelio pigmentato. Se non lo fa, cerca di non staccare a partire dalla periferia del oculare. Se è ancora difficile separare, una possibilità probabile è che l'animale non è stata adattata al buio per un adeguato periodo di tempo, o la luce rossa è troppo luminoso. Assicurare un corretto dark-adattamento per l'animale, e la fioca luce rossa. La presenza di bastoncelli della retina può essere facilmente verificato controllando il colore della retina isolata: tagliare un piccolo pezzo di retina e trasferirlo su un piatto a parte Petri, che possono poi essere visualizzati sotto le luci della stanza. Un pezzo di bastoncelli della retina che contiene ha un colore rosso vivo (a causa della rodopsina) che svanisce rapidamente. Un pezzo incolore indicherebbe l'assenza di rodopsina, e quindi di bastoncelli. Questo potrebbe essere dovuto sia alla separazione improprio della retina da dell'epitelio pigmentato della retina o ad un malsano. In tal caso, si dovrebbe garantire la salute degli animali e il loro adattamento corretto buio. Se una retina sana, ma è ottenuto cellule isolate non sane, allora il problema è più probabile con il taglio. Un taglio bene è fondamentale: se il taglio è troppo grossa, o la retina diventa scollarsi, risulta per lo più in pezzi di retina, invece di cellule isolate. Tritare buoni risultati in genere in una "nuvola" di cellule che compare nella soluzione.
Imaging di fluorescenza di singole cellule fotorecettori possibile utilizzare fluorofori cellulari endogeni, come NADH, FAD o vitamina A, così come coloranti fluorescenti sensibili a vari fattori, di rilevare una vasta gamma di processi fisiologici in tempo reale. Il metodo può essere applicato a molte specie diverse, tra cui gli anfibi come la salamandra (Ambystoma tigrinum) 17,18 e rana (Rana pipiens) 20, lucertole (Gecko gecko) 21, pesce (pesce zebra, Danio rerio) 11, e topo (Mus musculus) 22. L'estensione del metodo a cellule di topo permette lo studio di diversi tipi di animali geneticamente modificati.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Supportato da NEI concedere EY014850.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dark room (100-150 ft2) | |||
| Red lights19 | Online stores | ||
| Infrared light sources andinfrared image viewers | FJW Optical Systems, Inc. | ||
| Dissecting microscope19 | Outfitted with infrared viewers | ||
| Epifluorescence microscope enclosed in a light-tight cage19 | |||
| Dissecting tools(scissors, forceps, blade holder) | Roboz Surgical Instruments Co. | ||
| Sylgard elastomer | Essex (Charlotte, NC) | Sylgard 184 elastomer kit | |
| Poly-L-ornithine (0.01%) | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Poly-L-lysine (0.1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | Dilute to 0.01% |
| Experimental chambers | Warner Instruments | D3512P | |
| Petri dishes, plastic pipettes | Fisher Scientific |
References
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