Summary
Eine Methode ist für die Herstellung von einzelnen lebenden Sehzellen aus verschiedenen Wirbeltierarten für Fluoreszenz-Bildgebung beschrieben. Die Methode kann zur Abbildung der Fluoreszenz von endogenen Fluorophore wie NADH oder Vitamin A, oder dass von exogen zugesetztem Fluoreszenzfarbstoffen empfindlich gegen Ca
Abstract
In der Retina ist Phototransduktion, die Umwandlung von Licht in ein elektrisches Signal, durch die Stäbchen und Zapfen Sehzellen 1-4 durchgeführt. Stäbchen-Photorezeptoren sind für das Sehen zuständig bei schwachem Licht, Kegel in helles Licht. Phototransduktion erfolgt in den äußeren Teil der Sehzellen, ein spezialisiertes Fach, dass eine hohe Konzentration von visuellen Pigment, das primäre Lichtdetektor enthält. Cis-Retinal, die an ein Protein, Opsin - Die visuelle Pigment besteht aus einem Chromophor, 11 zusammengesetzt. Ein Photon durch die visuelle Pigment absorbiert isomerisiert des Chromophors von 11 - cis zu all-trans. Diese Photoisomerisierung führt zu einer Konformationsänderung in die visuelle Pigment, das eine Kaskade von Reaktionen gipfelte in einer Änderung des Membranpotentials, und die Herbeiführung einer Transduktion der Lichtreiz in ein elektrisches Signal auslöst. Die Erholung der Zelle aus Licht Stimulation beinhaltet die Deaktivierung der Zwischenprodukte durch Licht aktiviert, und die Wiederherstellung des Membranpotentials. Ca 2 + moduliert die Aktivität von mehreren der Enzyme in Phototransduktion beteiligt, und seine Konzentration auf Licht Stimulation reduziert. Auf diese Weise Ca 2 + spielt eine wichtige Rolle in der Erholung der Zelle aus Licht Stimulation und seine Anpassung an Hintergrundlicht.
Ein weiterer wesentlicher Bestandteil der Recovery-Prozess ist die Regeneration der visuellen Pigment, während Licht-Erkennung wurde durch die Photoisomerisierung von seinen 11 zerstört - cis Chromophor all-trans 5-7. Diese Regeneration beginnt mit der Veröffentlichung von all-trans Retinal durch die photoaktivierte Pigment, hinterlässt der Apo-Protein Opsin. Die freigesetzten all-trans-Retinal wird schnell in eine Reaktion unter Verwendung von NADPH zu all-trans-Retinol und Opsin reduziert kombiniert mit frischen 11 - cis-Retinal in die äußere Segment der Sehpigment Reform gebracht. All-trans-Retinol wird dann aus dem äußeren Bereich und in den benachbarten Zellen, die durch den spezialisierten Träger Interphotoreceptor Retinoid Binding Protein (IRBP) übertragen.
Fluoreszenz-Imaging von einzelnen Sehzellen kann verwendet werden, um ihre Physiologie und Zellbiologie studieren. Ca 2 +-sensitiven Fluoreszenzfarbstoffen kann verwendet werden, um im Detail zu untersuchen das Zusammenspiel zwischen äußeren Segment Ca 2 + Veränderungen und Antwort zu 8-12 sowie die Rolle der inneren Segment Ca 2 + Läden in Ca 2 +-Homöostase Licht 13,14 . Fluoreszierende Farbstoffe können auch zur Messung von Mg 2 +-Konzentration verwendet werden 15, pH-Wert und als Tracer von wässrigen und Membran Fächer 16. Schließlich kann die Eigenfluoreszenz von all-trans-Retinol (Vitamin A) verwendet werden, um die Kinetik der Bildung und Entfernung in einzelnen Sehzellen 17-19 überwachen.
Protocol
1. Vorbereitung der Sylgard bedeckten Teller, experimentelle Kammern und Rasierklingen
- 35 mm Falcon Petrischalen mit Sylgard Elastomer beschichtet sind für die ordnungsgemäße Hacken eines isolierten Netzhaut auf einzelne Sehzellen erhalten benötigt. Das Elastomer wird nach den Anweisungen des Lieferanten und eine kleine Menge in jede Schale gegossen, um dessen Boden mit einer Schicht bedecken vorbereitet. Ersetzen Sie die Antenne deckt nach der Beschichtung und speichern sie. In ein paar Tagen wird das Elastomer aushärtet und die Speisen sind fertig.
- Isolierte Photorezeptoren müssen auf dem Boden des experimentellen Kammer-Stick, so dass sie im Laufe eines abbildenden Experiment immobilisiert sind. Dies wird durch die Beschichtung der Böden der Kammern mit Poly-L-Lysin oder Poly-L-Ornithin erreicht. Geben Sie 200 ul von 0,01% Lösung von entweder eine pro Kammer, und decken die Kammern mit einem Papiertuch, um sie vor Staub zu schützen. Nachdem die Lösung getrocknet ist, waschen Sie die Kammern mit destilliertem Wasser und lagern in einer geschlossenen Box. Verwenden Sie innerhalb von 2 Wochen.
- Zum Reinigen der Kammern am Ende eines Experiments, waschen Sie sie mit 100% Ethanol, kein Öl aus der Öl-Immersions-Objektiv und Zelltrümmer zu entfernen. Zum Entfernen der Zelltrümmer, verwenden Wattestäbchen und vorsichtig schrubben den Boden der Kammer. Anschließend mit destilliertem Wasser zu waschen und lassen die Kammern trocknen, bevor re-Beschichtung.
- Cut zweischneidiges Rasiermesser in kleine Stücke (8 von einer Klinge) mit einem Metall-Cutter.
2. Herstellung der Lösungen
- Die Zusammensetzung der Lösungen hängt von der Spezies. Für Amphibien hat der Ringer (in mmol / L): 110 NaCl, 2,5 KCl, 1,6 MgCl 2, 1 CaCl 2, 5 HEPES, pH = 7,55. Der pH-Wert sollte auf den endgültigen Wert mit NaOH eingestellt werden. Für Säugetiere, hat die Ringer-(in mmol / L): 130 NaCl, 5 KCl, 0,5 MgCl 2, 2 CaCl 2, 25 hemisodium-HEPES, pH = 7,40. Die Ringer-Lösung kann bei Raumtemperatur aufbewahrt gut verschlossen für ein paar Monate.
- Lager Glucose-Lösung, 1 mol / L, bei -20 ° C gehalten, um das Bakterienwachstum zu verhindern.
- Am Tag des Experiments, fügen Glukose zu der Ringerlösung auf eine Endkonzentration von 5 mmol / L. Am Ende des Tages, entsorgen Sie die Ringer, die Glukose enthält, da es Bakterien könnte wachsen.
3. Isolation der Netzhaut
- Für die ordnungsgemäße Entfernung der Netzhaut ist es wichtig, dass das Tier für mindestens 2-3 Stunden vor der Tötung dunkel angepasst werden. Die Tiere sollten dunkel sein angepasst in einen geeigneten Behälter belüftet in der Dunkelkammer.
- Füllen Sie zwei 35 mm Petrischalen zur Hälfte mit Ringer-Lösung.
- Sacrifice das Tier unter dim rotes Licht und entfernen Sie die Augen. Anschließend werden sämtliche Verfahren unter Infrarot-Licht mit einem Binokular oder eine Kamera mit einem Video-Monitor durchgeführt.
- Entfernen Sie alle übrig gebliebenen Gewebe aus der äußeren Oberfläche des Auges. Cut und entfernen Sie den vorderen Teil, dann übertragen Sie die Augenmuschel in eine der Petrischalen mit Ringerlösung gefüllt.
- Entfernen Sie den Glaskörper und sorgfältig trennen die Netzhaut aus dem Rest der Augenmuschel durch Abklemmen oder Schneiden aller Anhänge. Heben Sie die Netzhaut und trennen sie vollständig von der Augenmuschel.
- Übertragung der Netzhaut auf die zweite Petrischale mit einer Kunststoff-Transferpipette. Halten Sie die Schale mit der Netzhaut in einem lichtdichten Kasten.
4. Isolierung einzelner Sehzellen
- Alle Verfahren werden unter Infrarot-Licht durchgeführt. Schneiden Sie ein kleines Stück Netzhaut und übertragen Sie es mit einem Kunststoff-Pipette auf eine Sylgard-Schale mit Deckel. Das Volumen der Lösung, welche die Netzhaut Stück sollte etwa 250 ul werden.
- Schnappen Sie sich ein kleines Stück Rasierklinge mit dem Messerhalter - der Rand des Blattes sollte bei ca. 45 °-Winkel an den Inhaber sein. Glätten Sie das Stück auf der Netzhaut Sylgard Schicht und mit dem Messer schneiden das Stück Netzhaut fein, während man selbst auf die Sylgard Schicht geklebt.
- Transfer-200 ul der Lösung, die die Zellen zu einer experimentellen Kammer - lassen Sie alle verbleibenden Stück der Netzhaut in der Sylgard-Schale mit Deckel. Halten Sie die Kammer mit dem isolierten Zellen in einem lichtdichten Kasten.
- Warten Sie 10 min für die Zellen zu regeln, dann fügen Sie 2-3 ml Ringer. In diesem Stadium können die isolierten Zellen mit einem bestimmten Fluoreszenzfarbstoff (z. B. Fura-2) nach dem Farbstoff loading-Protokoll geladen werden.
- Die Zellen können nun mit dem Mikroskop Bühne für Experimente gemacht werden.
5. Fluoreszenz-Imaging
- Übertragen Sie die Kammer auf der Bühne des Epifluoreszenzmikroskop. Passen Lösung Perfusion, Temperaturfühler, Infrarot-Beleuchtung, etc.
- Schließen Sie die Vorhänge und beginnen zu experimentieren. Schalten Sie das Infrarot-Licht im Innern des Mikroskops Käfig auf dem Boden der experimentellen Kammer zu konzentrieren, und bewegen Sie die Bühne auf der Suche nach Zellen.
6. Repräsentatives Ergebniss:
Abb.. 1 zeigt die Morphologie der gesunden isoliert lichtempfindlichen Zäpfchen und Stäbchen mit diesem Protokoll aus einem Salamander (Ambystoma tigrinum) Retina erhalten. Salamander-Zellen wurden ausgiebig für einzelne Zelle Fluoreszenz-Imaging-Studien wegen ihrer Größe und ihrer Fähigkeit, für mehrere Stunden nach der Isolierung von der Netzhaut überleben verwendet. Darüber hinaus von einem Salamander Netzhaut kann man regelmäßig erhalten sowohl lichtempfindlichen Zäpfchen und Stäbchen.
Ein wichtiges Kriterium für die Gesundheit der Zellen ist das Vorhandensein einer intakten Ellipsoid (Abb. 1), die Teil der Zelle, wo die Mitochondrien konzentriert sind. Wenn die Zellen unter DAPI Optik betrachtet, gibt dieser Konzentration der Mitochondrien eine starke Fluoreszenz-Signal (Abb. 2) durch die Anwesenheit von NADH. Der Mangel an einer intakten Ellipsoid ist ein Zeichen für eine beschädigte Zelle, in der Regel ungeeignet für den Versuch. Abb.. 3 zeigt eine beschädigte Salamander Stange Photorezeptor, mit einem geschwollenen Zellkörper und einer kondensierten Kern. Solche Zellen zeigen eine deutlich geringere Fluoreszenz unter DAPI Optik, sondern betrachtet unter FITC Optik zeigen eine starke FAD-Signal in das Ellipsoid Region (aus oxidiertem Flavin Nukleotiden und Flavoproteinen). Ein weiteres Kriterium für die Gesundheit der isolierten Photorezeptoren ist ihre Fähigkeit, all-trans-Retinol (Vitamin A) in ihrer äußeren Segmente nach Stimulation durch Licht zu erzeugen. Die Erzeugung von Vitamin A erfordert erhebliche Mengen an NADPH, die auf eine intakte metabolische Maschinerie abhängt. Abbildungen 4 und 5 zeigen die Bildung von Vitamin A in der äußeren Segmente der intakten Frosch und Maus Stäbchen-Photorezeptoren bzw..
Abbildung 1. Gesunde einzelnen lichtempfindlichen Zäpfchen und Stäbchen. Die Zellen wurden aus einem Tiger Salamander Netzhaut isoliert. Phototransduktion findet im äußeren Segment und das Ellipsoid ist dicht mit Mitochondrien verpackt. Stäbchen sind für das schwache Licht Vision, Kegel für helles Licht Vision.
Abbildung 2. Fluoreszenz lebender Salamander Stäbchen und Zapfen. Diese sind dunkel-adaptierten Zellen, zeigen starke NADH Fluoreszenz in ihren jeweiligen Ellipsoide und keine signifikanten Vitamin-A-Fluoreszenz in ihrer äußeren Segmente. Die Erfassung der Fluoreszenz-Bild repräsentiert die erste Belichtung mit sichtbarem Licht nach dem Zeitraum von dark-Anpassung.
Abbildung 3. Beschädigte Salamander Stange Photorezeptor. Der geschwollene Zellkörper und die verkürzte Kern sind bezeichnend für Schäden. Die Zelle wird oxidiert und es ist minimal NADH-Signal (DAPI-Optik), aber viel stärker FAD-Signal (FITC Optik).
Abbildung 4. Frog Stab mit NADH und Retinol. Dies ist ein gesunder Frosch Stange Photorezeptor ein starkes NADH Fluoreszenz im Ellipsoid Region. Vor Lichteinwirkung eine minimale Fluoreszenz in das äußere Segment. Nach Belichtung gibt es einen deutlichen Anstieg in das äußere Segment Fluoreszenz durch die Bildung von Vitamin A.
Abbildung 5. Maus Stab mit Retinol. Dies ist eine gesunde Maus Stange Photorezeptor zeigt signifikante äußere Segment Fluoreszenz nach der Belichtung durch die Bildung von Vitamin A. Das Ellipsoid Regionen von Maus-Stäbchen-Photorezeptoren nicht zeigen eine starke Fluoreszenz-Signal.
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Discussion
Wenn gesunde isolierten Zellen nicht erhalten werden, liegt das Problem entweder mit der Isolierung oder der Gesundheit der Netzhaut oder mit ihren Hacken. In der Regel nach dem Entfernen der Vorderseite des Auges und der Glaskörper, die Netzhaut leicht hebt das Pigmentepithel. Wenn es nicht zu schälen versuchen Sie ausgehend von der Peripherie der Augenmuschel. Wenn es immer noch schwer zu trennen, ist eine wahrscheinliche Möglichkeit, dass das Tier wurde nicht dunkel-adaptierten für eine angemessene Zeit, oder das rote Licht zu hell ist. Korrekte dark-Anpassung für das Tier, und dim das rote Licht. Die Anwesenheit von Stäbchen-Photorezeptoren in der Netzhaut kann leicht ermittelt werden, indem die Farbe der isolierten Netzhaut: schneiden Sie ein kleines Stück Netzhaut und überträgt es auf einer separaten Petrischale, die dann unter Raumbeleuchtung kann eingesehen werden. Ein Stück der Netzhaut, die Stäbchen-Photorezeptoren hat eine leuchtend rote Farbe (wegen Rhodopsin), die verblasst schnell. Ein farbloses Stück würde bedeuten, das Fehlen von Rhodopsin und damit der Stäbchen-Photorezeptoren. Dies kann entweder durch unsachgemäße Trennung der Netzhaut von der Pigmentepithel oder eine ungesunde Netzhaut. In einem solchen Fall sollten Sie sicherstellen, die Gesundheit der Tiere und ihre ordnungsgemäße Dunkeladaptation. Wenn einer gesunden Netzhaut erreicht, aber nicht gesund isolierten Zellen, dann ist das Problem wahrscheinlich mit dem Hacken. Ein fein zerkleinert ist entscheidend: Wenn die Hacken zu grob ist, oder die Netzhaut ablösen, so führt dies meist in Stücken von Netzhaut statt der isolierten Zellen. Gute Hacken resultiert typischerweise in einer "Wolke" von Zellen, die in der Lösung.
Fluoreszenz-Imaging von einzelnen Zellen Photorezeptoren können zelleigene Fluorophore wie NADH, FAD oder Vitamin A, sowie Fluoreszenzfarbstoffe empfindlich auf verschiedene Faktoren, die ein breites Spektrum von physiologischen Prozessen in Echtzeit Sonde. Das Verfahren kann auf viele verschiedene Arten, darunter Amphibien wie Feuersalamander (Ambystoma tigrinum) 17,18 und Frosch (Rana pipiens) 20, Echsen (Gecko gecko) 21, Fisch (Zebrafisch, Danio rerio) 11 und der Maus (Mus angewendet werden musculus) 22. Die Erweiterung des Verfahrens auf Maus-Zellen ermöglicht die Untersuchung der verschiedenen Arten von gentechnisch veränderten Tieren.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Unterstützt durch NEI gewähren EY014850.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dark room (100-150 ft2) | |||
| Red lights19 | Online stores | ||
| Infrared light sources andinfrared image viewers | FJW Optical Systems, Inc. | ||
| Dissecting microscope19 | Outfitted with infrared viewers | ||
| Epifluorescence microscope enclosed in a light-tight cage19 | |||
| Dissecting tools(scissors, forceps, blade holder) | Roboz Surgical Instruments Co. | ||
| Sylgard elastomer | Essex (Charlotte, NC) | Sylgard 184 elastomer kit | |
| Poly-L-ornithine (0.01%) | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Poly-L-lysine (0.1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | Dilute to 0.01% |
| Experimental chambers | Warner Instruments | D3512P | |
| Petri dishes, plastic pipettes | Fisher Scientific |
References
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