Summary
En metod beskrivs för beredning av enskilda celler lever fotoreceptor från olika ryggradsdjur för fluorescens avbildning. Metoden kan användas för att avbilda fluorescens av endogena fluoroforer, såsom NADH eller vitamin A, eller som exogent lagt fluorescerande färger känslig för Ca
Abstract
I ryggradsdjur näthinnan, är ljusöverledningen, omvandling av ljus till en elektrisk signal, som utförts av tappar och stavar ljusmätare celler 1-4. Rod fotoreceptorer är ansvariga för visionen i svagt ljus, koner i starkt ljus. Ljusöverledningen sker i den yttre delen av fotoreceptor cell, en specialiserad fack som innehåller en hög koncentration av visuella pigment, det primära ljuset detektorn. Den visuella pigment består av en kromofor, 11 - cis retinal, knutna till ett protein, opsin. En foton absorberas av visuella pigment isomerizes de kromofor från 11 - cis till all-trans. Detta photoisomerization medför en conformationaländring i den visuella pigment som initierar en kaskad av reaktioner som kulminerar i en förändring i membranpotential, och föra över transduktion av ljuset stimulans till en elektrisk signal. Återhämtningen i cellen från ljus stimulering innebär avaktivering av intermediärer aktiveras av ljus, och återupprättandet av membranet potential. Ca 2 + modulerar aktiviteten hos flera av de enzymer som är involverade i ljusöverledningen, och koncentrationen reduceras vid lätt stimulering. På detta sätt Ca 2 + spelar en viktig roll i återhämtningen i cellen från ljus stimulans och dess anpassning till bakgrundsbelysning.
En annan viktig del av återvinningsprocessen är förnyelse av det visuella pigment som har förstörts under ljus-detektion av photoisomerization av dess 11 - cis kromofor till all-trans 5-7. Denna förnyelse börjar med lanseringen av all-trans-retinal av photoactivated pigment och lämnar bakom apo-protein opsin. Den släppt all-trans-retinal snabbt reduceras i en reaktion som använder NADPH till all-trans-retinol, och opsin kombinerar med färska 11 - cis retinal förs in i yttre segmentet för att reformera den visuella pigment. All-trans-retinol överförs sedan ut i den yttre segmentet och i angränsande celler genom att de specialiserade transportören Interphotoreceptor Retinoid bindande protein (IRBP).
Fluorescens avbildning av enstaka fotoreceptor celler kan användas för att studera deras fysiologi och cellbiologi. Ca2 +-känsliga fluorescerande färger kan användas för att i detalj undersöka samspelet mellan yttre segmentet Ca 2 + förändringar och reaktion på ljus 8-12 samt den roll inre segment Ca 2 +-butiker i Ca 2 + homeostas 13,14 . Fluorescerande färger kan också användas för att mäta Mg 2 + koncentrationen 15, pH och som spårämnen i vattenlösning och fack membran 16. Slutligen kan den inneboende fluorescens av all-trans retinol (vitamin A) användas för att övervaka kinetiken av bolagsbildningen och borttagning i enstaka ljusmätare celler 17-19.
Protocol
1. Beredning av Sylgard täckta rätter, experimentella kammare, och rakblad
- 35 mm Falcon petriskålar belagd med Sylgard elastomer behövs för en väl hugga av en isolerad näthinnan för att få samma ljusmätare celler. Den elastomer är upprättad enligt leverantörens anvisningar och en liten mängd hälls i varje rätt att täcka sina botten med ett lager. Sätt skålen täcker efter beläggning och lagra dem. Inom några dagar kommer den elastomer hårdnar och disken är klar.
- Isolerade fotoreceptorer måste hålla oss till botten av den experimentella kammare så att de är immobiliserade under en avbildning experiment. Detta uppnås genom att täcka botten av kammare med poly-L-lysin eller poly-L-ornitin. Tillsätt 200 mikroliter på 0,01% lösning av antingen en per kammare, och täck kamrarna med en pappershandduk för att skydda dem från damm. När lösningen har torkat, tvätta kamrarna med destillerat vatten och förvara i en sluten låda. Använd inom 2 veckor.
- För att rengöra kamrarna i slutet av ett experiment, tvätta dem med 100% etanol för att ta bort olja från olje-immersion lins och cell skräp. För att ta bort cellfragment använder bomullspinne applikatorer och försiktigt skrubba botten av kammaren. Efteråt, skölj med destillerat vatten och låt kamrarna torka innan nytt beläggning.
- Klipp tveeggat rakblad i små bitar (8 från ett blad) med en metall fräs.
2. Beredning av lösningar
- Sammansättningen av lösningar beroende på art. För groddjur har Ringers (i mmol / L): 110 NaCl, 2,5 KCl, 1,6 MgCl 2, 1 CaCl 2, 5 HEPES, pH = 7,55. PH-värdet bör justeras till den slutliga värdet med NaOH. För däggdjur, har den Ringers (i mmol / L): 130 NaCl, 5 KCl, 0,5 MgCl 2, 2 CaCl 2, 25 hemisodium-HEPES, pH = 7,40. Den Ringers lösning kan förvaras väl tillsluten i rumstemperatur ett par månader.
- Stock glukoslösning, 1 mol / l, förvaras vid -20 ° C för att undvika bakterietillväxt.
- På dagen för försöket, lägga till glukos i Ringer-lösning till en slutlig koncentration på 5 mmol / L. Vid slutet av dagen, kassera Ringer som innehåller glukos eftersom det kan växa bakterier.
3. Isolering av näthinnor
- För rätt excision av en näthinnan är det viktigt att djuret vara mörk anpassade för minst 2-3 timmar innan offer. Djuren bör mörkt anpassas i ett ventilerat lämpligt kärl i det mörka rummet.
- Fyll två 35 mm petriskålar halvvägs med Ringers lösning.
- Sacrifice djuret vid dåliga rött ljus och ta bort ögonen. Därefter är alla procedurer utförs under infrarött ljus med hjälp av en dissekera mikroskop eller en kamera med en videomonitor.
- Ta bort alla överblivna vävnad från utsidan av ögat. Klipp ut och ta bort den främre delen, sedan överföra ögonmusslan till en av de petriskålar fyllda med Ringers.
- Ta bort glaskropp och noga skilja på näthinnan från resten av ögonmusslan genom att nypa av eller kapar några bilagor. Lyft försiktigt näthinnan och separera det helt från ögonmusslan.
- Överför näthinnan till den andra petriskål med en plast överföringspipett. Håll skålen innehåller näthinnan i en ljus-tight box.
4. Isolering av enstaka fotoreceptor celler
- Alla förfaranden genomförs under infrarött ljus. Skär en liten bit av näthinnan och överföra det med en plast pipett till en Sylgard-täckta skålen. Volymen av lösningen innehåller näthinnan bit bör vara ca 250 mikroliter.
- Ta en liten bit av rakblad med kniv hållare - kanten på bladet bör vara ca 45 ° vinkel till innehavaren. Platta till bit av näthinnan på Sylgard lagret och använder kniven hacka bit av näthinnan fint och samtidigt hålla den fastnat på Sylgard lagret.
- Överföring 200 mikroliter av lösningen innehåller celler till en experimentell kammare - lämna eventuell kvarvarande del av näthinnan i Sylgard-täckta skålen. Håll kammaren med isolerade celler i en ljus-tight box.
- Vänta 10 min för cellerna att bosätta sig, tillsätt sedan 2-3 ml Ringer. I detta skede kan de isolerade cellerna laddas med en viss fluorescerande färg (till exempel Fura-2) enligt den färgen lastning protokollet.
- Cellerna kan nu tas till mikroskop scen för experiment.
5. Fluorescens avbildning
- Överför kammaren till det stadium i epifluorescensmikroskop. Justera lösning perfusion, temperaturgivare, IR-belysning, mm
- Dra för gardinerna och börja experimentera. Slå på infrarött ljus inne i mikroskop buren, fokusera på botten av den experimentella avdelningen, och flytta scenen efter celler.
6. Representativt resultats:
Fig.. 1 visar morfologi av friska isolerad stav och fotoreceptorer konen erhålls med detta protokoll från en salamander (Ambystoma tigrinum) näthinnan. Salamander celler har använts i stor utsträckning för enskild cell fluorescens imaging studier på grund av deras storlek och deras förmåga att överleva i flera timmar efter isolering från näthinnan. Dessutom, från en salamander näthinnan kan man regelbundet få både spö och fotoreceptorer konen.
Ett viktigt kriterium för hälsan hos de celler som är förekomsten av en intakt ellipsoid (Fig. 1), den del av cellen där mitokondrierna är koncentrerade. När cellerna ses under DAPI optik, ger denna koncentration av mitokondrier en stark fluorescens-signal (bild 2) på grund av förekomst av NADH. Brist på ett intakt ellipsoid är ett tecken på en skadad cell, i allmänhet olämpliga för experiment. FIG. 3 visar en skadad salamander spö ljusmätare, med en svullen cell kropp och en kondenserad kärna. Dessa celler visar mycket lägre fluorescens i DAPI optik, men sedd i FITC-optik visar en stark FAD signal i ellipsoiden regionen (från oxiderade Flavin nukleotider och flavoproteins). Ett annat kriterium för hälsan hos isolerade fotoreceptorer är deras förmåga att generera all-trans-retinol (vitamin A) i sina yttre segment på stimulering av ljus. Den generation av vitamin A kräver stora mängder av NADPH, vilket beror på en intakt metabola maskiner. Figurerna 4 och 5 visar bildandet av A-vitamin i den yttre segmenten av intakt groda och mus fotoreceptorer spö respektive.
Figur 1. Friska enda spö och kon fotoreceptorer. Cellerna var isolerade från en tiger salamander näthinnan. Ljusöverledningen sker i det yttre segmentet och ellipsoiden är tätt packade med mitokondrier. Stänger ansvarar för svagt ljus syn, kottar för starkt ljus vision.
Figur 2. Fluorescens levande salamander tappar och stavar. Det är mörkt anpassas celler, visar en stark NADH fluorescens i sina respektive ellipsoider och ingen signifikant vitamin A fluorescens i sina yttre segment. Tillfångatagandet av fluorescens bilden representerar deras första exponering för synligt ljus efter den period av mörk-anpassning.
Figur 3. Skadade salamander spö ljusmätare. Den svullna cellen kroppen och den kondenserade kärnan är ett tecken på skador. Cellen oxideras och det finns minimala NADH signal (DAPI optik), men mycket starkare FAD signal (FITC optik).
Figur 4. Groda stav med NADH och retinol. Detta är en sund groda spö ljusmätare visar en stark NADH fluorescens i ellipsoiden regionen. Innan ljusexponering det är minimal fluorescens i det yttre segmentet. Efter ljusexponering, finns det en betydande ökning av det yttre segmentet fluorescens på grund av bildning av vitamin A.
Figur 5. Musen stav med retinol. Detta är en sund mus spö fotoreceptor uppvisar betydande yttre segmentet fluorescens efter ljusexponering på grund av bildning av vitamin A. ellipsoiden regioner fotoreceptorer mus spö som inte visar en stark fluorescens signal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Om friska isolerade celler inte erhålls ligger problemet antingen med isolering eller hälsa i näthinnan eller dess hackning. Vanligtvis, efter bort framsidan av ögat och glaskroppen, lyfter näthinnan lätt bort pigmentepitel. Om inte, försök att skala bort det från och periferi ögonmusslan. Om det är fortfarande svårt att separera, är en trolig möjlighet att djuret inte har mörk anpassade för en lämplig tid, eller det röda ljuset är för ljust. Säkerställa korrekt mörk-anpassning för djuret, och dämpa rött ljus. Förekomsten av staven fotoreceptorer i näthinnan kan enkelt konstateras genom att kontrollera färgen på den isolerade näthinnan: skära en liten bit av näthinnan och överföra den till en separat petriskål, som sedan kan ses i rummet ljus. En bit av näthinnan som innehåller spö fotoreceptorer har en klarröd färg (på grund av rhodopsin) som tonar snabbt. En färglös bit tyder på avsaknad av rhodopsin, och därmed spö fotoreceptorer. Detta kan antingen bero på felaktig separering av näthinnan från pigmentepitel eller till en ohälsosam näthinnan. I sådana fall bör du se till djurens hälsa och deras rätt mörka anpassning. Om en frisk näthinna har erhållits men inte friska isolerade celler, så problemet är förmodligen med hackning. En fin hacka är avgörande: Om hackning är för grovt eller näthinnan blir misslyckades, resulterar det oftast i bitar av näthinnan i stället för isolerade celler. Bra hugga resulterar normalt i ett "moln" av celler som finns i lösningen.
Fluorescens avbildning av enstaka fotoreceptorer celler kan använda endogena celler fluoroforer som NADH, FAD eller vitamin A, samt fluorescerande färger känsliga för olika faktorer, att undersöka ett brett spektrum av fysiologiska processer i realtid. Metoden kan tillämpas på många olika arter, däribland groddjur som salamandern (Ambystoma tigrinum) 17,18 och groda (Rana pipiens) 20, ödlor (Gecko gecko) 21, fisk (zebrafisk, Danio rerio) 11, och mus (Mus musculus) 22. Utvidgningen av den metod som musceller tillåter studier av olika typer av genetiskt modifierade djur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Med stöd av NEI bidrag EY014850.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dark room (100-150 ft2) | |||
| Red lights19 | Online stores | ||
| Infrared light sources andinfrared image viewers | FJW Optical Systems, Inc. | ||
| Dissecting microscope19 | Outfitted with infrared viewers | ||
| Epifluorescence microscope enclosed in a light-tight cage19 | |||
| Dissecting tools(scissors, forceps, blade holder) | Roboz Surgical Instruments Co. | ||
| Sylgard elastomer | Essex (Charlotte, NC) | Sylgard 184 elastomer kit | |
| Poly-L-ornithine (0.01%) | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Poly-L-lysine (0.1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | Dilute to 0.01% |
| Experimental chambers | Warner Instruments | D3512P | |
| Petri dishes, plastic pipettes | Fisher Scientific |
References
- Burns, M. E., Arshavsky, V. Y. Beyond Counting Photons: Trials and Trends in Vertebrate Visual Transduction. Neuron. 48, 387-401 (2005).
- Ebrey, T., Koutalos, Y.
- Fain, G. L., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Koutalos, Y.
- Palczewski, K.
- Saari, J. C. Biochemistry of Visual Pigment Regeneration: The Friedenwald Lecture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 41, 337-348 (2000).
- Lamb, T. D., Pugh, E. N. Dark Adaptation and the Retinoid Cycle of Vision. Prog Retin Eye Res. 23, 307-380 (2004).
- Imanishi, Y., Lodowski, K. H., Koutalos, Y. Two-Photon Microscopy: Shedding Light on the Chemistry of Vision. Biochemistry. 46, 9674-9684 (2007).
- Sampath, A. P., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Fain, G. L. Bleached Pigment Produces a Maintained Decrease in Outer Segment Ca2+ in Salamander Rods. J Gen Physiol. 111, 53-64 (1998).
- Sampath, A. P., Matthews, H. R., Cornwall, M. C., Bandarchi, J., Fain, G. L. Light-Dependent Changes in Outer Segment Free-Ca2+ Concentration in Salamander Cone Photoreceptors. J Gen Physiol. 113, 267-277 (1999).
- Woodruff, M. L., Sampath, A. P., Matthews, H. R., Krasnoperova, N. V., Lem, J., Fain, G. L. Measurement of Cytoplasmic Calcium Concentration in the Rods of Wild-Type and Transducin Knock-out Mice. J Physiol. 542, 843-854 (2002).
- Leung, Y. T., Fain, G. L., Matthews, H. R. Simultaneous Measurement of Current and Calcium in the Ultraviolet-Sensitive Cones of Zebrafish. J Physiol. 579, 15-27 (2007).
- Matthews, H. R., Fain, G. L. Laser Spot Confocal Technique to Measure Cytoplasmic Calcium Concentration in Photoreceptors. Methods Enzymol. 316, 146-163 (2000).
- Szikra, T., Cusato, K., Thoreson, W. B., Barabas, P., Bartoletti, T. M., Krizaj, D. Depletion of Calcium Stores Regulates Calcium Influx and Signal Transmission in Rod Photoreceptors. J Physiol. 586, 4859-4875 (2008).
- Krizaj, D., Copenhagen, D. R. Compartmentalization of Calcium Extrusion Mechanisms in the Outer and Inner Segments of Photoreceptors. Neuron. 21, 249-256 (1998).
- Chen, C., Nakatani, K., Koutalos, Y. Free Magnesium Concentration in Salamander Photoreceptor Outer Segments. J Physiol. 553, 125-135 (2003).
- Chen, C., Jiang, Y., Koutalos, Y. Dynamic Behavior of Rod Photoreceptor Disks. Biophys J. 83, 1403-1412 (2002).
- Tsina, E., Chen, C., Koutalos, Y., Ala-Laurila, P., Tsacopoulos, M., Wiggert, B., Crouch, R. K., Cornwall, M. C. Physiological and Microfluorometric Studies of Reduction and Clearance of Retinal in Bleached Rod Photoreceptors. J Gen Physiol. 124, 429-443 (2004).
- Ala-Laurila, P., Kolesnikov, A. V., Crouch, R. K., Tsina, E., Shukolyukov, S. A., Govardovskii, V. I., Koutalos, Y., Wiggert, B., Estevez, M. E., Cornwall, M. C. Visual Cycle: Dependence of Retinol Production and Removal on Photoproduct Decay and Cell Morphology. J Gen Physiol. 128, 153-169 (2006).
- Koutalos, Y., Cornwall, M. C. Microfluorometric Measurement of the Formation of All-Trans-Retinol in the Outer Segments of Single Isolated Vertebrate Photoreceptors. Methods Mol Biol. 652, 129-147 (2010).
- Wu, Q., Blakeley, L. R., Cornwall, M. C., Crouch, R. K., Wiggert, B. N., Koutalos, Y. Interphotoreceptor Retinoid-Binding Protein Is the Physiologically Relevant Carrier That Removes Retinol from Rod Photoreceptor Outer Segments. Biochemistry. 46, 8669-8679 (2007).
- Kolesnikov, A. V., Ala-Laurila, P., Shukolyukov, S. A., Crouch, R. K., Wiggert, B., Estevez, M. E., Govardovskii, V. I., Cornwall, M. C. Visual Cycle and Its Metabolic Support in Gecko Photoreceptors. Vision Res. 47, 363-374 (2007).
- Chen, C., Blakeley, L. R., Koutalos, Y. Formation of All-Trans Retinol after Visual Pigment Bleaching in Mouse Photoreceptors. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 3589-3595 (2009).
