Summary
Se describe un método para la preparación de las células vivas único fotorreceptor de diferentes especies de vertebrados para imágenes de fluorescencia. El método se puede utilizar para la imagen de la fluorescencia de los fluoróforos endógenos, como el NADH o vitamina A, o el de la adición exógena de tintes fluorescentes sensibles a Ca
Abstract
En la retina de los vertebrados, fototransducción, la conversión de la luz en una señal eléctrica, se lleva a cabo por la barra y conos fotorreceptores 1-4. Fotorreceptores de los bastones son responsables de la visión con poca luz, los conos de luz brillante. Fototransducción tiene lugar en el segmento externo de las células fotorreceptoras, un compartimento especializado que contiene una alta concentración de pigmento visual, el detector de luz principal. El pigmento visual se compone de un cromóforo, 11 - cis retinal, unido a una proteína, la opsina. Un fotón absorbido por el pigmento visual isomeriza el cromóforo de 11 - cis-trans de todos. Este fotoisomerización produce un cambio conformacional en el pigmento visual que inicia una cascada de reacciones que culminaron en un cambio en el potencial de membrana, y provocar la transducción de los estímulos de luz en una señal eléctrica. La recuperación de la célula de la estimulación de la luz consiste en la desactivación de los intermediarios activados por la luz, y el restablecimiento del potencial de membrana. Ca 2 + modula la actividad de varias de las enzimas involucradas en la fototransducción, y su concentración se reduce a la estimulación de luz. De esta manera, Ca 2 + juega un papel importante en la recuperación de la célula de la estimulación de la luz y su adaptación a la luz de fondo.
Otra parte esencial del proceso de recuperación es la regeneración del pigmento visual que ha sido destruido durante la luz de la detección por el fotoisomerización de los 11 - cromóforo cis a trans-5.7. Esta regeneración se inicia con la liberación de todo-trans retinal por el pigmento fotoactivado, dejando atrás la opsina apo-proteína. La libertad a todos-trans retinal se reduce rápidamente en una reacción de la utilización de NADPH a todo-trans retinol y opsina se combina con el nuevo 11 - cis retinal trajo en el segmento externo de reforma del pigmento visual. Todo-trans retinol se transfiere fuera del segmento externo y en las células vecinas por la proteína portadora retinoides especializados Interphotoreceptor (IRBP).
Imágenes de fluorescencia de las células fotorreceptoras solo puede ser usado para estudiar la fisiología y la biología celular. Ca 2 + sensibles a tintes fluorescentes se pueden utilizar para examinar en detalle la interacción entre los segmentos externos de Ca 2 + y la respuesta a los cambios de luz 08/12, así como el papel de segmento interno Ca 2 + en la homeostasis del Ca 2 + 13,14 . Los tintes fluorescentes también se puede utilizar para medir la concentración de Mg 2 + 15, el pH, y como trazadores de humor acuoso y compartimentos de membrana 16. Finalmente, la fluorescencia intrínseca de todo-trans retinol (vitamina A) puede utilizarse para controlar la cinética de su formación y la eliminación de las células fotorreceptoras solo 17-19.
Protocol
1. Preparación de Sylgard cubiertos platos, cámaras experimentales, y hojas de afeitar
- Falcon 35 mm placas de Petri recubiertas con elastómero Sylgard son necesarios para la tala de un adecuado retina aislada para obtener células fotorreceptoras sola. El elastómero se prepara según las instrucciones del proveedor y una pequeña cantidad se vierte en cada plato para cubrir el fondo con una capa. Vuelva a colocar el plato cubre después del recubrimiento y almacenarlos. En unos pocos días "el elastómero se endurece y los platos están listos.
- Fotorreceptores aislados que atenerse a la parte inferior de la cámara experimental a fin de que se inmovilizan en el transcurso de un experimento de imágenes. Esto se logra mediante el recubrimiento de la parte inferior de las cámaras con poli-L-lisina o poli-L-ornitina. Añadir 200 l de 0,01% de solución de uno por cada cámara, y la cubierta de las cámaras con una toalla de papel para protegerlos del polvo. Después de que la solución se haya secado, lavado de las cavidades con agua destilada y almacenar en una caja cerrada. Su uso dentro de 2 semanas.
- Para la limpieza de las cámaras al final de un experimento, lávelos con etanol al 100% para eliminar el aceite de la lente de inmersión en aceite y restos celulares. Para eliminar los restos celulares, el uso bastoncillos de algodón y frote con cuidado la parte inferior de la cámara. A continuación, lavar con agua destilada y dejar que las cámaras de secar antes de volver a capa.
- Cortar hojas de doble filo navaja de afeitar en pedazos pequeños (8 a partir de una hoja) con un cortador de metal.
2. Preparación de soluciones
- La composición de las soluciones depende de la especie. Para los anfibios, el Ringer tiene (en mmol / L): 110 NaCl, 2,5 KCl, 1,6 MgCl 2, 1 CaCl 2, 5 HEPES, pH = 7,55. El pH debe ser ajustado al valor final con NaOH. Para los mamíferos, la de Ringer tiene (en mmol / L): 130 NaCl, 5 KCl, 0,5 MgCl2, CaCl2 2, 25 hemisodium-HEPES, pH = 7,40. La solución de Ringer se puede mantener bien tapado a temperatura ambiente durante unos meses.
- Stock de solución de glucosa, 1 mol / L, se mantiene a -20 ° C para evitar el crecimiento bacteriano.
- En el día del experimento, añadir la glucosa a la solución de Ringer a una concentración final de 5 mmol / L. Al final del día, deseche el Ringer que contiene glucosa, ya que podría crecer la bacteria.
3. El aislamiento de la retina
- Para la escisión correcta de la retina que es importante que el animal esté adaptada a la oscuridad durante al menos 2-3 horas antes del sacrificio. Los animales deben estar adaptados a la oscuridad en un recipiente adecuado con ventilación en el cuarto oscuro.
- Llenar dos cajas de Petri de 35 mm hasta la mitad con solución de Ringer.
- El sacrificio del animal en tenue luz roja y eliminar los ojos. Posteriormente, todos los procedimientos se realizan bajo la luz infrarroja usando un microscopio de disección o una cámara con un monitor de video.
- Remover el tejido sobrante de la superficie externa del ojo. Cortar y quitar la parte anterior, a continuación, transferir el ocular en una de las placas de Petri llenas de Ringer.
- Extraer el humor vítreo y la retina cuidadosamente separada del resto de la ojera por pellizcar o cortar los archivos adjuntos. Levante suavemente la retina y la separan por completo de la ojera.
- La transferencia de la retina a la segunda placa de Petri con una pipeta de transferencia de plástico. Mantenga el recipiente que contenga la retina en una caja a prueba de luz.
4. El aislamiento de las células fotorreceptoras sola
- Todos los procedimientos se realizan bajo la luz infrarroja. Corte un pedazo pequeño de la retina y la transferencia con una pipeta de plástico a un plato cubierto de Sylgard. El volumen de la solución que contiene la pieza de retina debe ser alrededor de 250 mL.
- Coge un trozo de hoja de afeitar con el soporte de la cuchilla - el borde de la hoja debe estar en ángulo de aproximadamente 45 a su titular. Aplanar la pieza de la retina en la capa de Sylgard y el uso de la hoja de cortar la pieza de la retina finamente mientras que lo mantiene pegado a la capa de Sylgard.
- Transferencia de 200 l de la solución que contiene las células a una cámara experimental - salir de cualquier parte restante de la retina en el plato Sylgard cubiertos. Mantenga la cámara con las células aisladas en una caja a prueba de luz.
- Espere 10 minutos para que las células de resolver, a continuación, agregar 2.3 mL de Ringer. En esta etapa, las células aisladas pueden ser cargados con un tinte fluorescente en particular (por ejemplo Fura-2) de acuerdo con el protocolo de carga de tintes.
- Ahora las células se pueden tomar para la platina del microscopio para realizar experimentos.
5. Fluorescencia de imagen
- La transferencia de la cámara a la platina del microscopio de epifluorescencia. Ajuste solución de perfusión, las sondas de temperatura, iluminación infrarroja, etc
- Cierre las cortinas y comenzar a experimentar. Encienda la luz infrarroja dentro de la jaula microscopio, se centran en la parte inferior de la cámara experimental, y mover el escenario en busca de las células.
6. Representante de Resultadoss:
Fig. 1 muestra la morfología de la barra saludable aislados y los conos obtenidos con este protocolo de una salamandra (Ambystoma tigrinum) retina. Las células de salamandra se han utilizado ampliamente para los estudios de una sola celda de imágenes de fluorescencia debido a su gran tamaño y su capacidad de sobrevivir durante varias horas después del aislamiento de la retina. Además, a partir de una retina una salamandra con regularidad puede obtener tanto en la barra y los conos.
Un criterio importante para la salud de las células es la presencia de un elipsoide intactos (Fig. 1), la parte de la célula donde se concentran las mitocondrias. Cuando las células son vistos bajo la óptica DAPI, esta concentración de mitocondrias da una fuerte señal de fluorescencia (Fig. 2) debido a la presencia de NADH. La falta de un elipsoide intacta es una señal de una célula dañada, por lo general no aptos para el experimento. Fig. 3 muestra una barra de fotorreceptores dañados salamandra, con un cuerpo celular hinchada y un núcleo de condensación. Estas células de visualización mucho más bajos de fluorescencia bajo la óptica DAPI, pero visto bajo la óptica FITC mostrar una señal fuerte FAD en la región del elipsoide (que se origina a partir de nucleótidos de flavina oxidado y flavoproteínas). Otro criterio para la salud de los fotorreceptores aislados es su capacidad de generar todo-trans retinol (vitamina A) en sus segmentos externos a la estimulación por la luz. La generación de la vitamina A requiere grandes cantidades de NADPH, que depende de una maquinaria metabólica intacto. Las figuras 4 y 5 muestran la formación de vitamina A en los segmentos externos de la rana intacta y los fotorreceptores de ratón varilla respectivamente.
Figura 1. Fotorreceptores sanos sola varilla y el cono. Las células fueron aisladas de una retina salamandra tigre. Fototransducción tiene lugar en el segmento externo y el elipsoide está densamente poblada por las mitocondrias. Los bastones son responsables de la visión tenue luz, los conos para la visión de luz brillante.
Figura 2. La fluorescencia de la vida salamandra varilla y el cono. Estos son adaptados a la oscuridad las células, que presentan una fluorescencia NADH fuerte en su elipsoides respectivos y no significativa de vitamina A de fluorescencia en sus segmentos externos. La captura de la imagen de fluorescencia representa su primera exposición a la luz visible después del período de adaptación a la oscuridad.
Figura 3. Dañado salamandra varilla de fotorreceptores. El cuerpo de la célula hinchada y el núcleo condensado son indicativos de daño. La célula se oxida y no hay un mínimo de señal de NADH (óptica DAPI), pero la señal más fuerte FAD (FITC óptica).
Figura 4. Rana de la barra con el NADH y el retinol. Esto es un fotorreceptor rana barra saludable que presentan una fluorescencia NADH fuerte en la región elipsoide. Luz antes de la exposición hay un mínimo de fluorescencia en el segmento externo. A raíz de exposición a la luz, hay un aumento significativo de la fluorescencia de los segmentos externos debido a la formación de vitamina A.
Figura 5. Ratón varilla con retinol. Esto es un fotorreceptor del ratón la barra saludable que presentan una fluorescencia significativa de los segmentos externos después de exposición a la luz debido a la formación de la vitamina A. Las regiones elipsoide de fotorreceptores de ratón no muestran una fuerte señal de fluorescencia.
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Discussion
Si las células sanas aisladas no se obtienen, el problema radica ya sea con el aislamiento o la salud de la retina o con su tala. Por lo general, después de retirar la parte frontal del ojo y el vítreo, la retina se despega con facilidad el epitelio pigmentario. Si no es así, trate de despegar a partir de la periferia de la ojera. Si todavía es difícil de separar, una posibilidad probable es que el animal no ha sido adaptada a la oscuridad por un período de tiempo adecuado, o la luz roja es demasiado brillante. Garantizar la adecuada adaptación a la oscuridad para que el animal, y atenuar la luz roja. La presencia de fotorreceptores de los bastones de la retina son fáciles de determinar, verificando el color de la retina aislada: cortar un pedazo pequeño de la retina y su transferencia a una caja de Petri por separado, que se pueden ver bajo luces de la habitación. Un pedazo de varilla que contiene los fotorreceptores retina tiene un color rojo brillante (debido a la rodopsina) que se desvanece rápidamente. Una pieza sin color que indican la ausencia de la rodopsina, y por lo tanto de fotorreceptores de los bastones. Esto podría deberse a la incorrecta separación de la retina del epitelio pigmentario de la retina o una malsana. En tal caso, debe garantizar la salud de los animales y su adaptación a la oscuridad adecuado. Si una retina saludable se obtiene, pero las células aisladas no es saludable, entonces el problema es más probable con la tala. A cortar bien es fundamental: si la tala es demasiado gruesa, o que la retina se despega, se produce sobre todo en piezas de la retina en lugar de células aisladas. Cortar buena por lo general resulta en una "nube" de las células que aparecen en la solución.
Imágenes de fluorescencia de células fotorreceptores solo puede utilizar fluoróforos endógena como NADH, FAD o la vitamina A, así como los tintes fluorescentes sensibles a diversos factores, para investigar una amplia gama de procesos fisiológicos en tiempo real. El método se puede aplicar a muchas especies diferentes, incluyendo anfibios como la salamandra (Ambystoma tigrinum) 17,18 y la rana (Rana pipiens) 20, lagartos (Gecko gecko) 21, el pescado (pez cebra, Danio rerio) 11, y el ratón (Mus musculus) 22. La extensión del método a las células de ratón permite el estudio de los diferentes tipos de animales modificados genéticamente.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Apoyado por NEI conceder EY014850.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dark room (100-150 ft2) | |||
| Red lights19 | Online stores | ||
| Infrared light sources andinfrared image viewers | FJW Optical Systems, Inc. | ||
| Dissecting microscope19 | Outfitted with infrared viewers | ||
| Epifluorescence microscope enclosed in a light-tight cage19 | |||
| Dissecting tools(scissors, forceps, blade holder) | Roboz Surgical Instruments Co. | ||
| Sylgard elastomer | Essex (Charlotte, NC) | Sylgard 184 elastomer kit | |
| Poly-L-ornithine (0.01%) | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Poly-L-lysine (0.1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | Dilute to 0.01% |
| Experimental chambers | Warner Instruments | D3512P | |
| Petri dishes, plastic pipettes | Fisher Scientific |
References
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