Summary
Une méthode est décrite pour la préparation des cellules photoréceptrices de vie simple de différentes espèces de vertébrés pour l'imagerie de fluorescence. La méthode peut être utilisée pour l'image de la fluorescence des fluorophores endogènes, tels que le NADH ou la vitamine A, ou celle de manière exogène ajouté des colorants fluorescents sensibles à Ca
Abstract
Dans la rétine des vertébrés, phototransduction, la conversion de la lumière en un signal électrique, est effectué par la tige et le cône cellules photoréceptrices 1-4. Rod photorécepteurs sont responsables de la vision dans la pénombre, des cônes de lumière. Phototransduction prend place dans le segment externe de la cellule de photorécepteur, un compartiment spécialisé qui contient une forte concentration de pigment visuel, le détecteur de lumière primaire. Le pigment visuel est composé d'un chromophore, 11 - cis rétinal, attaché à une protéine, l'opsine. Un photon absorbé par le pigment visuel isomérise le chromophore de 11 - cis-trans. Cette photoisomérisation provoque un changement conformationnel dans le pigment visuel qui déclenche une cascade de réactions aboutissant à un changement dans le potentiel de membrane, et entraînant la transduction du stimulus lumineux en un signal électrique. La reprise de la cellule de la stimulation lumineuse implique la désactivation des intermédiaires activés par la lumière, et le rétablissement du potentiel de membrane. Ca 2 + module l'activité de plusieurs enzymes impliquées dans la phototransduction, et sa concentration est réduite lors de la stimulation lumineuse. De cette façon, le Ca 2 + joue un rôle important dans le rétablissement de la cellule de la stimulation lumineuse et son adaptation à la lumière de fond.
Une autre partie essentielle du processus de récupération est la régénération du pigment visuel qui a été détruit pendant la lumière de détection par le photoisomérisation de ses 11 - chromophore cis-trans 5-7. Cette régénération commence par la libération de tous les trans-rétinienne par le pigment photoactivé, laissant derrière lui l'opsine apo-protéines. Les libérés tout-trans rétinal est rapidement réduit dans une réaction en utilisant le NADPH au rétinol tout trans, et se combine avec l'opsine 11 frais - rétinien cis introduits dans le segment externe pour réformer le pigment visuel. Tous les trans-rétinol est alors transférée hors du segment externe et dans les cellules voisines par la protéine porteuse rétinoïdes Interphotoreceptor spécialisés de reliure (IRBP).
L'imagerie de fluorescence des cellules photoréceptrices unique peut être utilisée pour étudier leur physiologie et biologie cellulaire. Ca 2 + sensibles colorants fluorescents peuvent être utilisés pour examiner en détail l'interaction entre les segments externes Ca 2 + et les changements réponse à la lumière de 8 à 12 ainsi que le rôle du segment intérieur de Ca 2 + magasins dans l'homéostasie du Ca 2 + 13,14 . Les colorants fluorescents peuvent également être utilisés pour mesurer la concentration en Mg 2 + 15, le pH et comme traceurs de compartiments aqueux et la membrane 16. Enfin, la fluorescence intrinsèque des tout-trans rétinol (vitamine A) peuvent être utilisés pour suivre la cinétique de sa formation et l'élimination des cellules photoréceptrices seule 17-19.
Protocol
1. Préparation de Sylgard couverts vaisselle, chambres expérimentales, et les lames de rasoir
- 35 mm Falcon boîtes de Pétri recouvert d'élastomère Sylgard sont nécessaires pour le bon à découper une rétine isolée d'obtenir des cellules photoréceptrices unique. L'élastomère est préparé selon les instructions du fournisseur et une petite quantité est versé dans chaque plat pour couvrir le fond avec une couche. Remplacer le plat couvre après le revêtement et les stocker. Dans quelques jours, «l'élastomère durcit et les plats sont prêts.
- Photorécepteurs isolés besoin de coller au fond de la chambre expérimentale de sorte qu'ils sont immobilisés au cours d'une expérience d'imagerie. Ce résultat est obtenu par revêtement au fond des chambres de poly-L-lysine ou la poly-L-ornithine. Ajouter 200 ul de solution à 0,01% soit un par chambre, et couvrent les chambres avec une serviette en papier pour les protéger de la poussière. Après que la solution a séché, laver les chambres avec de l'eau distillée et conserver dans une boîte fermée. Utiliser dans les 2 semaines.
- Pour nettoyer les chambres à la fin d'une expérience, les laver avec de l'éthanol à 100% pour enlever l'huile de l'objectif à immersion et les débris cellulaires. Pour enlever les débris cellulaires, l'utilisation du coton-tige et frottez soigneusement le fond de la chambre. Ensuite, lavez à l'eau distillée et laisser sécher avant les chambres à un nouveau revêtement.
- Couper les lames de rasoir à double tranchant en petits morceaux (8 d'une lame) avec un cutter en métal.
2. Préparation des solutions
- La composition des solutions dépend de l'espèce. Pour les amphibiens, les années Ringer a (en mmol / L): 110 NaCl, KCl 2,5, 1,6 MgCl 2, 1 CaCl 2, 5 HEPES, pH = 7,55. Le pH doit être ajusté à la valeur finale avec NaOH. Pour les mammifères, la sonnerie des a (en mmol / L): 130 NaCl, 5 KCl, MgCl 2 0,5, CaCl 2 2, 25 hemisodium-HEPES, pH = 7,40. La solution de Ringer peut être gardé bien fermé à température ambiante pendant quelques mois.
- Solution de glucose Stock, 1 mol / L, conservés à -20 ° C pour éviter la prolifération bactérienne.
- Le jour de l'expérience, ajouter à la solution de glucose à l'Ringer à une concentration finale de 5 mmol / L. A la fin de la journée, jetez la sonnerie de qui contient du glucose, car il pourrait se développer des bactéries.
3. Isolement des rétines
- Pour l'excision correcte d'une rétine, il est important que l'animal soit adaptés à l'obscurité pendant au moins 2-3 heures avant le sacrifice. Les animaux doivent être adaptés à l'obscurité dans un récipient approprié ventilé dans la chambre noire.
- Remplir deux boîtes de Pétri de 35 mm à mi-chemin avec une solution de Ringer.
- Sacrifier l'animal sous une lumière rouge sombre et de supprimer les yeux. Par la suite, toutes les procédures sont menées sous la lumière infrarouge en utilisant un microscope à dissection ou une caméra avec un moniteur vidéo.
- Retirez tout tissu restant en dehors de la surface de l'œil. Couper et enlever la partie antérieure, puis transférer l'œilleton dans l'une des boîtes de Pétri remplie de Ringer.
- Enlever le vitré et la rétine séparer soigneusement du reste de l'œilleton par pincement ou couper les pièces jointes. Soulevez doucement la rétine et de la séparer totalement de l'œilleton.
- Transférer la rétine pour le deuxième plat de Pétri avec une pipette en plastique. Gardez le plat contenant de la rétine dans une boîte étanche à la lumière.
4. Isolement des cellules photoréceptrices seule
- Toutes les procédures sont menées sous la lumière infrarouge. Coupez un petit morceau de la rétine et le transférer avec une pipette en plastique pour un plat Sylgard-couvert. Le volume de la solution contenant le morceau rétine devrait être d'environ 250 uL.
- Prenez un petit morceau de lame de rasoir, avec le support de lame - le bord de la lame doit être à environ 45 ° au titulaire. Aplatir le morceau de la rétine sur la couche Sylgard et en utilisant la lame hachez le morceau de la rétine finement tout en la gardant collé à la couche Sylgard.
- Transférer 200 ul de la solution contenant les cellules à une chambre expérimentale - laisser aucun morceau restant de la rétine dans le plat Sylgard-couvert. Gardez la chambre avec les cellules isolées dans une boîte étanche à la lumière.
- Attendez 10 min pour les cellules de s'installer, puis ajouter 2-3 ml de Ringer. A ce stade, les cellules isolées peuvent être chargées avec un colorant fluorescent particulière (par exemple Fura-2) selon le protocole de chargement colorant.
- Les cellules peuvent maintenant être prises pour la platine du microscope pour des expériences.
5. L'imagerie par fluorescence
- Transfert de la chambre à l'étape du microscope à épifluorescence. Perfusion solution Ajuster, sondes de température, éclairage infrarouge, etc
- Fermez les rideaux et commencer à expérimenter. Allumez la lumière infrarouge dans la cage de microscope, se concentrer sur le fond de la chambre expérimentale, et déplacer la scène à la recherche de cellules.
6. Résultat Représentants:
Fig. 1 montre la morphologie de la tige isolés saine et des cônes photorécepteurs obtenus avec ce protocole d'une salamandre (Ambystoma tigrinum) rétine. Salamandre cellules ont été largement utilisés pour des études d'imagerie par fluorescence seule cellule en raison de leur grande taille et leur capacité à survivre pendant plusieurs heures après l'isolement de la rétine. En outre, à partir d'une rétine de salamandre, on peut obtenir régulièrement la tige et des cônes photorécepteurs.
Un critère important pour la santé des cellules est la présence d'un ellipsoïde intacte (Fig. 1), la partie de la cellule où les mitochondries sont concentrés. Lorsque les cellules sont considérées dans l'optique DAPI, cette concentration des mitochondries donne un signal fort de fluorescence (Fig. 2) en raison de la présence de NADH. Absence d'un ellipsoïde intacte est un signe d'une cellule endommagée, généralement impropres à l'expérimentation. Fig. 3 montre une salamandre endommagé tige des photorécepteurs, avec un corps cellulaire gonflé et un noyau de condensation. Ces cellules d'affichage beaucoup plus faible fluorescence sous l'optique DAPI, mais vu sous l'optique FITC montrent un signal DCP forte dans la région de l'ellipsoïde (provenant de nucléotides flavine oxydée et flavoprotéines). Un autre critère pour la santé des photorécepteurs isolés, c'est leur capacité à générer des tout-trans rétinol (vitamine A) dans leurs segments externes lors de la stimulation par la lumière. La génération de la vitamine A exige des quantités importantes de NADPH, qui dépend d'une machinerie métabolique intacte. Figures 4 et 5 montrent la formation de la vitamine A dans les segments externes des photorécepteurs grenouille intact et la tige de la souris, respectivement.
Figure 1. Healthy seule photorécepteurs tige et le cône. Les cellules ont été isolées à partir d'une rétine salamandre tigrée. Phototransduction prend place dans le segment externe et de l'ellipsoïde est très dense avec des mitochondries. Les bâtonnets sont responsables de la vision faible lumière, les cônes pour la vision de la lumière.
Figure 2. Fluorescence de la vie de salamandre tige et le cône. Ce sont adaptés à l'obscurité des cellules, montrant la fluorescence du NADH forts dans leur ellipsoïdes respectifs et pas de vitamine A par fluorescence significative dans leurs segments externes. La capture de l'image de fluorescence représente leur première exposition à la lumière visible après la période d'adaptation à l'obscurité.
Figure 3. Damaged salamandre tige photorécepteur. Le corps de la cellule gonflée et le noyau condensé sont révélateurs de dommages. La cellule est oxydé et il est minime signal de NADH (optique DAPI), mais le signal beaucoup plus fort DCP (FITC optique).
Figure 4. Grenouille tige avec du NADH et le rétinol. Ceci est un photorécepteur grenouille saine tige montrant la fluorescence du NADH forte dans la région de l'ellipsoïde. Avant exposition à la lumière de fluorescence est minime dans le segment externe. Après exposition à la lumière, il ya une augmentation significative de la fluorescence segment externe due à la formation de la vitamine A.
Figure 5. Souris tige avec le rétinol. Ceci est un photorécepteur de souris saines tige montrant la fluorescence significative segment externe, après exposition à la lumière due à la formation de la vitamine A. Les régions ellipsoïde de photorécepteurs tige de souris ne montrent pas un signal fort de fluorescence.
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Discussion
Si la santé des cellules isolées ne sont pas obtenus, le problème réside soit avec l'isolement ou la santé de la rétine ou avec son hachage. Généralement, après avoir enlevé le devant de l'œil et le corps vitré, la rétine ascenseurs facilement hors de l'épithélium pigmentaire. Si ce n'est pas, essayez de le retirer à partir de la périphérie de l'œilleton. S'il est encore difficile de séparer, une possibilité probable est que l'animal n'a pas été adaptés à l'obscurité pendant une période suffisante de temps, ou la lumière rouge est trop clair. Assurer un bon adaptation à l'obscurité pour l'animal, et baisser la lumière rouge. La présence de photorécepteurs de la rétine tige peut être facilement vérifié en vérifiant la couleur de la rétine isolée: couper un petit morceau de la rétine et le transférer dans un plat séparé de Petri, qui peuvent ensuite être visualisées sous un éclairage ambiante. Un morceau de tige contenant les photorécepteurs rétine a une couleur rouge vif (à cause de la rhodopsine) qui s'estompe rapidement. Un morceau incolores indiquerait l'absence de la rhodopsine, et donc des photorécepteurs tige. Cela pourrait être dû soit à une séparation inadéquate de la rétine de l'épithélium pigmentaire ou à une rétine malsain. Dans un tel cas, vous devez vous assurer de la santé des animaux et leur bonne adaptation sombre. Si une rétine saine est obtenue, mais pas les cellules saines isolé, alors le problème est probablement avec le hacher. Un hachage plus fin est crucial: si le découpage est trop grossière, ou de la rétine décollée devient, il en résulte la plupart du temps dans des pièces de la rétine au lieu de cellules isolées. Hacher Bons résultats généralement dans un «nuage» de cellules apparaissant dans la solution.
L'imagerie de fluorescence des cellules photorécepteurs seule cellule peut utiliser des fluorophores endogènes comme le NADH, FAD ou la vitamine A, ainsi que des colorants fluorescents sensibles à différents facteurs, de sonder un large éventail de processus physiologiques en temps réel. La méthode peut être appliquée à de nombreuses espèces différentes, y compris les amphibiens comme la salamandre (Ambystoma tigrinum) 17,18 et la grenouille (Rana pipiens) 20, les lézards (Gecko Gecko) 21, le poisson (le poisson-zèbre, Danio rerio) 11, et la souris (Mus musculus) 22. L'extension de la méthode à des cellules de souris permet l'étude des différents types d'animaux génétiquement modifiés.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Soutenu par IEN octroi EY014850.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dark room (100-150 ft2) | |||
| Red lights19 | Online stores | ||
| Infrared light sources andinfrared image viewers | FJW Optical Systems, Inc. | ||
| Dissecting microscope19 | Outfitted with infrared viewers | ||
| Epifluorescence microscope enclosed in a light-tight cage19 | |||
| Dissecting tools(scissors, forceps, blade holder) | Roboz Surgical Instruments Co. | ||
| Sylgard elastomer | Essex (Charlotte, NC) | Sylgard 184 elastomer kit | |
| Poly-L-ornithine (0.01%) | Sigma-Aldrich | P4957 | |
| Poly-L-lysine (0.1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | Dilute to 0.01% |
| Experimental chambers | Warner Instruments | D3512P | |
| Petri dishes, plastic pipettes | Fisher Scientific |
References
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