Bilaminar Co-kultur Primary Rat Kortikal neuroner og glia

Summary

Her giver vi en protokol til dyrkning rotte cortical neuroner i overværelse af en glial feeder lag. De dyrkede neuroner etablere polaritet og skabe synapser, og kan adskilles fra den glia til brug i forskellige applikationer, såsom elektrofysiologi, calcium imaging, celle overlevelse assays, immuncytokemi, og RNA / DNA / protein isolation.

Abstract

Denne video vil guide dig gennem processen med dyrkning rotte kortikale neuroner i overværelse af en glial feeder lag, et system kendt som en bilaminar eller co-kultur model. Dette system er velegnet til en lang række eksperimentelle behov, der kræver enten et glas eller plastik vækst substrat og kan også bruges til dyrkning af andre typer af neuroner.

Rotte kortikale neuroner fra slutningen af fosterstadiet (E17) er belagt på glas dækglas eller vævskultur retter står over for en feeder lag af glia dyrket på fade eller plast dækglas (kendt som Thermanox), hhv. Valget mellem de to konfigurationer afhænger af den specifikke eksperimentelle anvendte teknik, som kan kræve, eller ej, er, at neuroner dyrket på glas (fx calcium imaging versus Western blot). Den glial feeder lag, en astroglia-beriget sekundære kultur blandet glia, er adskilt tilberedt fra cortex af nyfødte rotteunger (P2-4) forud for den neuronaledissektion.

En stor fordel ved denne kultur systemet i forhold til en kultur af neuroner kun støtte fra neuronale vækst, overlevelse og differentiering leveret af trofiske faktorer, der udskilles fra glial feeder lag, som mere præcist ligner hjernen miljø in vivo. Endvidere kan den fælles kultur, der bruges til at studere neuronal-glial interaktioner ^1.

Samtidig er glia forurening i den neuronale lag forebygges med forskellige midler (low density kultur, tilsætning af mitotiske hæmmere, mangel på serum og brug af optimerede kultur middel), der fører til en næsten ren neuronale lag, der kan sammenlignes med andre etablerede metode ^{1 -3.} Neuroner let kan adskilles fra glial lag på ethvert tidspunkt under kultur og anvendes til forskellige eksperimentelle applikationer lige fra elektrofysiologi ^4, cellulær og molekylær biologi ^5-8, biokemi ^5, billedbehandling og microscopy ^4,6,7,9,10. Den primære neuroner udvide axoner og dendritter til at danne funktionelle synapser ^11, en ​​proces, der ikke er observeret i neuronale cellelinjer, selv om nogle cellelinier gøre forlænge processer.

En detaljeret protokol med dyrkning rotte hippocampus neuroner ved hjælp af denne co-kultur-system er blevet beskrevet tidligere ^4,12,13. Her har vi detalje en modificeret protokol velegnet til kortikale neuroner. Da ca 20x10 ⁶ celler inddrives fra hver rotte foster, denne metode er især nyttig for eksperimenter, der kræver et stort antal neuroner (men ikke bekymret over en meget homogen neuronal befolkning). Udarbejdelsen af ​​neuroner og glia skal planlægges i en tid-specifik måde. Vi vil give trin-for-trin-protokol til dyrkning rotte cortex neuroner samt dyrkning af gliaceller at støtte neuroner.

Protocol

1. Glia Dissektion (~ 2 uger før plating neuroner)

1. Som forberedelse til dissektion sted sterile værktøjer i 70% ethanol, tilsættes 4 mL koldt dissektion medium til 60 mm retter (en parabol pr hjernen), og placer 2,5% trypsin og DNase på is til at tø op (se detaljer om kirurgiske redskaber i tabel VI ).
2. Brug store saks til at halshugge på 2-4 dage gamle unger og sted hoveder i en 100 mm steril fad.
3. Brug medium saks til at gøre en midterlinjen skære gennem huden og trække sig tilbage i huden for at eksponere kraniet. Brug krum saks til at gøre en midterlinjen snit og to laterale snit gennem kraniet, uden at beskadige hjernen væv nedenunder. Fjern det øverste kraniet at eksponere hjernen.
4. Uddrag hjernen og læg den i sin egen 60 mm skål indeholdende 4 ml koldt dissektion medium (se tabel I for sammensætning). Sæt fadet under et stereomikroskop (Leica ZOOM 2000, zoom-kontrol: 70-30) og brug No.5 pincet til at adskille halvkugler, fjern midthjernen, og skræl oFF meninges.
5. Saml alle dissekerede hjernebark i en frisk 60 mm skål med koldt dissektion medium, og mos væv med krum saks.
6. Overfør hakket væv til en steril 15 ml tube. Bring volumen til 4,5 ml med koldt dissektion medium og tilsæt 500 μL på 2,5% trypsin. Wrap røret i Parafilm og flyde det i en 37 ° C vandbad i 15 minutter, blandes ved at vende hver 5 minutter.

   (Bemærk: her beskriver vi den protokol, vi generelt følger, når du bruger op til 5 hjerner, hvis flere unger der anvendes, kan mængderne skal justeres passende)

7. Overfør væv til en ny 15 ml rør, minimere mængden af ​​trypsin-holdige dissektion medium fremføres. Bring volumen til 4.8mL med frisk dissektion medium og der tilsættes 200 μL DNase at nå frem til en endelig koncentration på 60 ug / ml (stamopløsning: 3 mg af DNase og 5 mg MgSO4 i 2 ml dissektion medium). Triturate forsigtigt ~ 20 gange med en steril 5 ml pipettete, hvorefter der tilsættes 10 mL glia plating medium (se tabel II for sammensætning).
8. Tillad store stykker væv at bosætte sig i 4-5 minutter, derefter overføre de øverste 80% af cellesuspensionen til en 50mL rør. Gentag væv trituration med yderligere 2-3 ml af glia plating medium (og bruge en mindre pipette hvis det er nødvendigt), igen, tillader vævet at bosætte sig, og tilføje de øverste 80% til den foregående samling. Bring det samlede volumen til 20 ml med glia plating medium og centrifuger i 15 minutter ved 280 g (eller 1300 rpm i en IEC Centra CL2 centrifuge).
9. Aspirer supernatanten og resuspender cellepelleten i glia plating medium (ca. bruge 5-7 mL afhængigt af antallet af anvendte unger), derefter tilføje yderligere plating medium for at have 10 mL for hver dissekeret hjernen. Bland godt og plade 10 ml af cellesuspensionen i hver 75 cm ² kolbe (dvs. en hjerne per flaske).
10. Flyt kultur kolber til en inkubator indstillet til 37 ° C (5 til 10% CO2 i forhold til natrium bicarbonate indhold af mediet). Skift dyrkningsmedium efter 24-48 timer, derefter hver 3-4 dage.

2. Sekundær glia (48 timer før plating neuroner)

1. Forbered thermanox dækglas (hvis neuroner vil blive belagt på fade) ved at tilføje 3 små dråber smeltet paraplast voks rundt omkredsen af ​​hver vaskes og autoklaveres thermanox. Celler vil blive belagt på denne side af thermanox. Vores thermanox er håndlavede genanvendelige ~ 60 mm skær skåret af plast (se tabel VI af reagenser) med ~ 50 2 mm huller boret igennem, selv om kommercielt tilgængelige kultur vel indstik kan anvendes i stedet.
2. Vask den primære glia med PBS to gange, energisk ryster hver kolbe for at fjerne eventuelle separate celler. Hver kolbe med sammenflydende primære glia vil give cirka 10 millioner astroglia, derfor har vi regelmæssigt bruger 2-4 kolber per eksperiment.
3. Frigør de celler med 0,05% tryspin-EDTA (1 mL10X 0,5% trypsin-EDTA-stamopløsning fortyndes i 9 mL PBS). Combine cellerne fra 2 kolber i en 50 ml koniske rør og tilføje en lige stor del af glia plating medium (se tabel II af reagenser). Centrifugeres i 15 minutter ved 280 g. Aspirer supernatanten og opløse glia pellet i et par mL glia plating medium.
4. Tælle celler ved hjælp af en hematocytometer og fortyndes cellesuspensionen efter behov (~ 1x10 ⁶ celler / ml); plade cellerne enten på 60mm retter (hvis neuroner vil blive belagt på dækglas), eller på thermanox dækglas (hvis neuroner vil blive belagt på 60 mm retter). Cellerne skal være belagt med 500.000 celler pr parabol eller thermanox hjælp glia plating medium. I tilfælde af thermanox dækglas, plade 600 μL af celler i en dråbevis måde, så efter 2 timer flip thermanox og dykke celler i glia plating medium.
5. Hvis forberede 60 mm tallerkener af sekundære glia for neuronal dækglas, skift medium til N2.1 aftenen før neuronale dissektion.

3. Neuronale Dissektionog Kultur

1. Forbered glas dækglas (15 mm i diameter) ved at tilføje 3 små dråber smeltet paraplast voks rundt omkredsen af ​​hver sterilt dækglas, med henblik på at fysisk adskille cellelag og forhindre cell skrabning. Celler vil blive belagt på denne side af dækglasset.
2. Coat plader eller dækglas med 0,5 mg / ml polylysine (enten poly-L-lysin eller poly-D-lysin opløst i borat buffer, jf. tabel VI) til 2 timer eller natten over. Vask med sterilt vand 2-3 gange og lad det tørre helt. Bemærk: dækglas er placeret i en hydrofob petriskål at undgå at spilde / spredning af løsninger i belægning med poly-lysin eller celle plating, som let kan opstå, hvis dækglas er placeret i vævskultur retter.
3. Forbered dig på den neuronale dissektion som for glia dissektion (trin 1,1). Aflive en 17-dages gravide rotter, spray pelsen med 70% ethanol, og skar medialt gennem huden til at afsløre i livmoderen. Fjern alle fostre og placere dem i ensterile 100 mm fad.
4. Hurtigt dissekere fri og halshugge hver foster, placere hvert hoved i sin egen 60 mm skål med koldt dissektion medium (4 ml). Vi normalt dissekere 4-5 fostre per eksperiment, som omkring 20 millioner neuroner er afledt fra hver E17 foster. Hvis flere fostre der er behov for, sørge for, at hele proceduren (fra trin fra 3,4 til 3,12) ikke vare mere end 9-10 minutter.
5. Ved hjælp af et stereomikroskop og No.1/No.5 pincet isolere den cerebrale cortex ved at trække åbne huden og kraniet, udvinding af hjernen, der adskiller halvkugler, og fjerne midthjernen og meninges.
6. Saml alle dissekeret cortex i en frisk 60 mm skål med koldt dissektion medium, og mos væv med krum saks i ~ 1 mm stykker.
7. Overfør hakket væv til en steril 15 ml tube. Bring volumen til 4,5 ml med koldt dissektion medium og tilsæt 500 μL på 2,5% trypsin. Wrap røret i Parafilm og flyde det i en 36 ° C vandbad i 15 MinuTES, blanding ved at vende hver 5 minutter.
8. Overfør væv til en ny 15 ml rør, minimere mængden af ​​trypsin-holdige dissektion medium fremføres. Bring til 4,8 mL med frisk dissektion medium og der tilsættes 200 μL DNase at nå frem til en endelig koncentration på 60 ug / ml. Triturate cirka 10 gange med en steril 5 eller 2 mL pipette, gentage dette trin som nødvendigt ved hjælp af en brand-poleret (kold) Pasteur pipette til at adskille det meste af vævet. Så kan de resterende stykker af væv (generelt er meget få, om nogen) at slå sig ned i 4-5 minutter.
9. Fjern det øverste encellede suspension mens bag afregnes stykker af væv, og anbring denne løsning i et nyt rør med en tilsvarende mængde neuron plating medium (se tabel III). Bland det godt, men forsigtigt, så tælle cellerne; plade på 15 mm dækglas (35.000 celler hver i 200 μL) eller 60 mm retter (1x10 ⁶ celler hver i 3 ml) efter behov. Overfør celler til inkubator (36,5 ° C, 5-10% CO2).
10. Efter 3-4 timer kombie neuron lag og den sekundære glia som følger. For neuroner på 60 mm opvask, vask celler med varme DMEM, ændre medium til 4ml af serum frit medium (N2, se tabel IV), og tilføje en thermanox med glia til hver plade (gliaceller skal vende de neuroner). For neuronal dækglas, overførsel fra 3 til 5 dækglas på hver 60 mm fad af sekundære glia, med de neuroner nedad.
11. 24 timer efter plating de neuroner, tilføjer 10 ìm af cytosin-β-D-arabinofuranoside til hver ret, for at forhindre glia spredning. Vi udarbejder 4 mm stamopløsninger fortyndes 1:10 med N2 medium, og tilsættes 25 ul / ml fortyndet opløsning til hvert fad.
12. Celler er generelt bruges til forsøg efter 7-10 dage i kultur, selv om det nøjagtige tidspunkt afhænger af den ønskede differentiering scenen, de har været dyrket i op til 4 uger uden et signifikant fald i overlevelse. Efter den første uge, anbefales det, at halvdelen volumen af ​​medier udskiftes hver uge.

Et par timer efter neuroner er fastgjort til underlaget, begynder de at udvide lamelliopodia. Processer fortsat aflang (Fig. 2A) og polariserer over flere dage i kultur, og udvidet axoner og dendritter er klart synlige (Fig. 2B, MAP2 farvning). Som neuroner modne dendritiske dorne bliver mere omfattende, og de ​​udvikler synaptiske kontakter; ca 2-3 uger efter plating mange dendritiske Torner er synlige (Figur 2C) ^11.

Figur 1. Flow diagram af proceduren for dyrkning rotte cortex neuroner sammen med en glial feeder lag (sekundært glia). Først 11 dage før neuronal dissektion, er en primær glia kultur fremstillet af neonatale rotter (P2-4). Når cellerne er sammenflydende (ca. ni dage efter plating den primære glia og to dage før den neuronale dissektion), astrocytes er mechanically adskilt fra oligodendrocyte precursor celler og mikroglia og belagt enten på fade eller thermanox (sekundære glia). Neuroner fås derefter fra cortex af E17 embryoner og belagt enten på dækglas eller retter (belagt med poly-lysin). Fire timer efter plettering, er den neuronale lag føjes til den sekundære glia.

Figur 2 Eksempler på kulturer på forskellige stadier (fx 5 timer, 12 DIV, 21 DIV).. Tallene er repræsentative billeder af kortikale neuroner på dækglas på forskellige tidspunkter. Efter neuroner vedhæfte til underlaget neuroner begynde at udvide lamelliopodia. Fase kontrast billede viser et par udvidet neurites fem timer efter plating (A). Billedet i midten (B, fra Cook et al. 2010, med tilladelse) viser 12 DIV kortikale neuroner faste og immunostained med neuronale dendritiske markør MAP2. Hoechst farvning blev brugt som counterstaiNing. Som neuroner modne dendritiske Torner også blevet synlige (C). Skala barer: A, B = 25 μm; C = 10 ìm.

Discussion

Denne protokol giver en metode til dyrkning rotte primære kortikale neuroner i overværelse af glia celler, samtidig med at de neuroner til at være let isoleret i eksperimentel analyse. Den glia støtte udviklingen af ​​en sund neuronal fænotype, samtidig med modulerende neuronale reaktioner på eksperimentelle behandlinger i en fysiologisk relevant måde. Derudover ved passaging den primære glia før kultivering med neuroner denne celle population bliver selektivt beriget med astrocytes, hvilket forhindrer inflammatoriske microglial stimulation. For visse typer af eksperimenter, kan dog forskellige andele af gliaceller ønske, og dermed yderligere glia kulturer kan udføres for at optimere denne cellulære sammensætning. Denne protokol kan også tilpasses til dyrkning neuroner stammer fra andre områder af hjernen, som hippocampus, der passer specielt eksperimentelle krav

Større problemer af denne teknik omfatter forebyggelse af bakteriel contfaring og forebyggelse glial spredning i neuronale lag. Dette system omfatter ikke antibiotiske midler, således sterile teknikker er særligt kritiske i alle faser. Glial spredning forhindres ved tilsætning af anti-mitotisk agent cytosin arabinofuranoside, den lave densitet plating og serum-fri kultur medium; efter denne protokol astrocytter skulle komponere ikke mere end 3-5% af celler i neuronale lag ^1,4 og mindre end 1% mikroglia bør opdages. Immunopanning eller andre teknikker kan bruges til at fjerne selv dette lave glia forurening ^4.

Denne teknik kan også ændres for co-dyrkning enhver sort af vedhængende celletyper, når isolere en enkelt type analyse er ønskelig. For eksempel blev dette system med succes tilpasset til at analysere effekten af osteoblaster på Ca ^{2 +} signalering i knogle-metastatisk cancer celler ^14.