Summary
Akute Hirn-Trauma ist eine schwere Verletzung, die keine angemessene Behandlung bis heute hat. Multiphotonen-Mikroskopie ermöglicht Studium in Längsrichtung den Prozess der akuten Hirntrauma Entwicklung und Untersuchung therapeutische Strategien bei Nagern. Zwei Modelle des akuten Hirn-Trauma untersucht mit in vivo Zwei-Photonen-Imaging von Gehirn werden in diesem Protokoll demonstriert.
Abstract
Obwohl akute Hirntrauma führt oft von Kopf Schäden in verschiedenen Unfällen und betrifft einen wesentlichen Anteil der Bevölkerung, gibt es keine wirksame Behandlung für die es noch nicht. Einschränkungen der derzeit verwendeten Tiermodelle behindern Verständnis der Pathologie-Mechanismus. Multiphotonen-Mikroskopie ermöglicht das Studium Zellen und Gewebe im intakten Tier Gehirne in Längsrichtung unter physiologischen und pathologischen Bedingungen. Hier beschreiben wir zwei Modellen der akuten Hirnverletzung untersucht mittels Zwei-Photonen-Bildgebung von Hirnzellverhalten bei posttraumatischen Zuständen. Eine ausgewählte Hirnregion ist mit einer scharfen Nadel, um ein Trauma einer kontrollierten Breite und Tiefe in das Hirnparenchym erzeugen verletzt. Unsere Methode verwendet stereotaktischen stechen mit einer Spritzennadel, die bei gleichzeitiger Anwendung Drogen kombiniert werden können. Wir schlagen vor, dass diese Methode kann als erweitertes Tool zur zellulären Mechanismen der pathophysiologischen Folgen eines akuten Traumas im Gehirn von Säugetieren zu untersuchen
Introduction
Akute Hirnverletzung ist eine bedeutende Problem der öffentlichen Gesundheit mit hoher Inzidenz von Verletzungen in Autounfälle, Stürze oder Überfällen und hohen Prävalenz von chronischen Folge Behinderung. Therapeutische Ansätze zur Behandlung von Hirnverletzungen bleiben völlig symptomatisch, wodurch die Effektivität der präklinischen, OP-und Intensivpflege Begrenzung. Das macht die sozialen und wirtschaftlichen Auswirkungen der Hirnschädigung besonders schwer. Aus einer Vielzahl von Gründen fehlgeschlagen meisten klinischen Studien zu einer Verbesserung der Erholung nach einer Hirnschädigung Verwendung neuer therapeutischer Ansätze zu demonstrieren.
Tiermodelle sind von entscheidender Bedeutung für die Entwicklung neuer therapeutischer Strategien für eine Phase, in der Wirksamkeit von Medikamenten bei Patienten mit Hirnverletzungen vorhergesagt werden. Derzeit mehreren etablierten Tiermodellen von Kopfverletzungen vorhanden sind, einschließlich gesteuert kortikalen Auswirkungen ein, Fluid-Percussion-Verletzung 2, dynamische Verformung kortikalen 3, Gewicht-Drop4, 5 und Foto Verletzungen. Eine Reihe von experimentellen Modelle wurden verwendet, um bestimmte morphologische, molekulare und Verhaltensaspekte von Kopftrauma-assoziierten Pathologie zu studieren. Allerdings ist kein einziges Tiermodell bei der Validierung neuer therapeutischer Strategien ganz erfolgreich. Entwicklung von zuverlässigen, reproduzierbaren und kontrollierten Tiermodell der Gehirnverletzung notwendig ist, um die komplexen pathologischen Prozessen zu beurteilen.
Die neuartige Kombination aus den neuesten mikroskopische Imaging-Technologien und genetisch kodierte Fluoreszenz Reporter bietet eine beispiellose Gelegenheit, um alle Phasen der Hirnschädigung, die primäre Verletzung sind, die Verbreitung der Primärverletzung, Sekundärschädigung und Regeneration zu untersuchen. Insbesondere ist in vivo Zweiphotonenmikroskopie eine eindeutige nicht-lineare optische Technologie, die Echtzeit-Visualisierung von zellulären und subzellulären Strukturen auch in tiefen kortikalen Schichten von Nagetier Gehirn ermöglicht. Verschiedene Arten von Zellen und orgaNelles können gleichzeitig durch die Kombination verschiedener Fluoreszenzmarker abgebildet werden. Mit diesem leistungsstarken Werkzeug können wir dynamische morphologische und funktionelle Veränderungen in lebenden Gehirn unter posttraumatischen Bedingungen zu visualisieren. Die Vorteile der in-vivo-Zwei-Photonen-Mikroskopie in das Studium Hirn-Verletzungen wurden vor kurzem von Kirov und Kollegen 6 demonstriert. Mit einem milden fokalen kortikalen Kontusion Modell zeigten diese Autoren, dass dendritische akuten Verletzung in der perikontusionelle Kortex wird durch den Rückgang der lokalen Blutfluss verknüpft. Außerdem zeigten sie, dass die metabolisch beeinträchtigt Kortex um die Quetschung Ort wird durch die Ausbreitung Depolarisation beschädigt. Diese Sekundärschaden betroffen synaptischen Schaltungen, so dass die Folgen von Schädel-Hirn-Verletzungen schwerer.
Hier schlagen wir vor, die Methode der stereotaktischen stechen mit einer Spritzennadel, die bei gleichzeitiger Anwendung topischer Arzneimittel kombiniert werden könnte, als eine fortgeschrittene Modell für lokale GehirnVerletzungen und als Werkzeug zur pathophysiologischen Folgen von akutem Trauma im Gehirn von Säugetieren in vivo zu studieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle hier vorgestellten Verfahren wurden nach den örtlichen Leitlinien für die Tierpflege (Die finnische Gesetz über Tierversuche 62/2006) durchgeführt. Tier Lizenz (ESAVI/2857/04.10.03/2012) wurde von örtlichen Behörde (ELÄINKOELAUTAKUNTA-ELLA) erhalten. Erwachsene Mäuse von 1-3 Monaten Alter, Gewicht 24-38 g, wurden in Einzelkäfigen in der zertifizierten Universität Tierhaltung gehalten und mit Futter und Wasser ad libitum zur Verfügung gestellt.
1. Brain Injury Imaging Durch eine Hirn Fenster
- Anästhesie Tiere und die Vorbereitung der Operationsfeld
- Betäuben Mäusen durch peritoneale Injektion einer Mischung aus Ketamin (Ketalar, 80 mg / kg) und Xylazin (Rompun, 10 mg / kg) in filtersterilisiert Phosphatpuffersalzlösung (PBS), pH 7,4 gelöst. Überprüfen Reflexe der Maus die regelmäßig (Schwanz-und Zehen Prise Sonde), um die Narkosetiefe zu überprüfen. Erhöhen Sie die Dosis gegebenenfalls, um die ordnungsgemäße Betäubung erhalten, sondern Overd vermeidenose.
- Aufrechterhaltung des Tieres bei 37,0 ° C mit einem Heizkissen bei chirurgischen Operation Bildgebungssitzung und der ersten Stunde nach dem Erwachen aus der Narkose.
- Um die Augen der Maus vor dem Austrocknen zu schützen, gelten Auge Schmiermittel.
- Verwalten Dexamethason (Rapidexon Tierarzt, 2 mg / kg) durch subkutane Injektion zu Entzündungen und Hirnödem reduzieren.
- Schmerzstill (zB Ketoprophene intraperitoneal) bis zu 30 Minuten vor oder unmittelbar nach der Operation. Wenn das Tier zeigt keine Schmerzen Symptome, wie Zurückhaltung zu bewegen, zu essen oder zu trinken, oder Gewichtsverlust, Speichelfluss, Piloerektion oder abnormale Atemgeräusche nach der Operation, wiederholen Sie die Injektion von Analgetikum.
- Rasieren Sie die Maus 'Kopf mit einem Schermaschine (siehe Materialien und Equipment). Vermeiden Sie Beschädigungen der Barthaare.
- Behandeln Sie die Haut auf dem Kopf der Maus mit 70% Ethanol-Lösung zur Reinigung der rasierten Bereich.
- Mit OP-Schere (siehe Materialien undEquipment) und Pinzetten (siehe Materialien und Equipment), schneiden Sie die Haut von der Mittellinie zwischen den Ohren an der Stirn.
- Vorsichtig abkratzen das Bindegewebe mit einer stumpfen Klinge mikro auf den Schädel befestigt.
- Schieben Haut Grenzen seitwärts und leicht in klanglicher Öffnungen des Schädels für Kopf und Haut Fixierung ziehen Ohr Bars.
- Reinigen Sie den Schädel mit sterilem PBS und Behandlung der Operationsstelle am Kopf der Maus die mit 0,5% Chlorhexidindigluconat, dann trocknen die Schädeloberfläche mit einer Kombination von sterilen Wattestäbchen und Druckluft.
- Zufügung der Verletzung stechen
- Positionieren Sie ein kleines Tier stereotaktischen Instrument mit einem Tierhalter (siehe Materialien und Equipment).
- Einstellen der Position des Binokular neben dem stereotaktischen Instrument auf der Oberfläche des Tierschädel konzentrieren.
- Mit einem Binokular, suchen Sie die Bregma Punkt auf dem Schädel.
- Identifizieren Sie die region von Interesse, wobei die stereotaktischen Koordinaten.
HINWEIS: Vermeiden Sie die Bereiche von Interesse, die direkt über oberflächliche Rindengefäße befinden. Zerstörung dieser kann stark auf die Trauma Progression. - Positionieren Sie den 30 G Nadel über der gewählten Region und markieren Sie die Zielseite durch Kratzen der Schädeloberfläche.
- Bohren Sie den Schädel mit allen möglichen Vorkehrungen, um unnötige Verbreiterung der betroffenen Knochenfläche zu vermeiden. Verwenden Sie einen High-Speed-chirurgische Bohrer (siehe Materialien und Equipment) unter dem Mikroskop. Stoppen bohren, wenn Flüssigkeit in das gebohrte Bereich angezeigt.
- Berühren Sie den unteren Rand der gebohrt und mit der Nadel.
- Tauchen die Nadel glatt in das Gehirn (Einfügungsgeschwindigkeit 5-10 mm / min), die der Tiefe von 0,5-2,0 mm entsprechend den Koordinaten der Schwanz an der Applikationsstelle.
- Entfernen Sie die Nadel sofort nach Erreichen der gewünschten Tiefe (Rückzugsrate von 5-10 mm / min) und wischen das Blut nach dem Stich mit einem kleinen Tampon erscheinen (see Materialien und Ausrüstung).
- Führen Sie die Mikroinjektion von 100 uM Sulforhodamin 101 oder eine andere Verbindung von Interesse in der Läsion unter Verwendung einer Mikropumpe (WPI) und 10 ul Hamilton-Spritze montieren mit Glaspipette.
HINWEIS: Bei der Herstellung der Glaspipette aus Borosilikatglas Kapillare, schärfen die Spitze zu einem Durchmesser von 10-20 um. - Infuse 250-1,500 nl der Injektionslösung mit einer Geschwindigkeit von 5.2 nl / sec.
HINWEIS: Lassen Sie die Pipette nach dem Ende der Infusion für mindestens 5 min in Hirnparenchym, entfernen Sie sie dann langsam und vorsichtig, um Lösung Abfluss zu verhindern.
- Kraniotomie für chronische Hirn Fenster
- Bohren Sie den Schädel sanft und vorsichtig, um einen Kreis Fenster um die verletzte Stelle zu machen. Verwenden Fenster Durchmesser von 3-3,5 mm.
- Einen Tropfen Cortex-Puffer (125 mM NaCl, 5 mM KCl, 10 mM Glucose, 10 mM HEPES, 2 mM CaCl 2 und 2 mM MgSO 4 in destilliertem H 2 O), um die wi deckenNDOW.
- Platzieren Sie einen runden Deckglas (# 1.5 Dicke) auf der Schädelfenster.
- Entfernen Sie den Überschuss der Kortex Puffer um das Deckglas.
- Seal die Ränder des Deckglases mit Polyacryl-Kleber (siehe Materialien und Equipment).
HINWEIS: Sicherstellen, dass der Klebstoff nicht an der oberen Oberfläche des Deckglases aufgebracht. Wenn das Deckglas mit Klebstoff verschmutzt, warten Sie, bis das Glas stabil auf den Schädel geklebt und der Kleber auf der Glasoberfläche trocken wird, dann vorsichtig die verunreinigenden Kleber mit einem Mikroklinge. - Warten Sie 5 Minuten, bis der Leim trocknen lassen.
- Mit den Ohr Bar Höhe schrauben, passen Sie die Kopfposition, so dass der Metallhalterung platziert werden können.
- Eine kleine Menge von Polyacryl-Kleber auf dem Ring der Stahlhalter (siehe Materialien und Equipment).
- Kleben Sie den Ring der Stahlhalter an der Deckglas mit der Metallhalterung Handgriff nach hinten gerichtet.
- Warten Sie 5 Minuten, bis der Leim trocknen lassen.
- Mix Zahnzement (siehe Materialien und Ausrüstung) mit Polyacryl-Kleber in einem 3,5 cm-Petrischale (oder analog) zu zähflüssig Bedingungen zu erreichen.
- Abdichtung der Ränder der Schädel Fenster mit dem Zement + Leim-Gemisch und der Abdeckung der freiliegenden Oberfläche des Schädels mit der gleichen Mischung auf die Haut Grenze.
- Warten Sie 15 min bis der Zement + Leim-Gemisch trocknen lassen und dann entfernen Ohr Bars.
- Führen Sie zwei-Photonen-Anregung mikroskopischen (TPEM)-Bildgebung für die Region von Interesse und einer Regelzone, wie es im Protokoll Nr. 3 beschrieben.
- Nach der Bebilderung ermöglichen das Tier aus der Narkose auf einem Heizkissen erholen und halten Sie sie in einem individuellen Käfig unter Beobachtung bis zur vollständigen Genesung. Nassfutter gegeben, um Kau-und Flüssigkeitszufuhr zu erleichtern.
2. Brain Injury Imaging Durch die ausgedünnten Schädel
- Anästhesierende Tiere und die Vorbereitung des Operationsfeldes
- Anesthetize die Maus und bereiten sie für die Trauma-Induktionwie in Schritt 1.1 beschrieben.
- Schädel Ausdünnung und Zufügung der Verletzung stechen
- Positionieren Sie ein kleines Tier stereotaktischen Instrument mit dem Tierhalter (siehe Materialien und Ausrüstung).
- Einstellen der Position eines Binokular neben dem stereotaktischen Instrument auf dem Tierschädel Oberfläche zu fokussieren.
- Suchen Sie die Bregma Punkt auf dem Schädel mit dem Binokular, identifizieren Sie den Bereich des Gehirns auf der Grundlage stereotaktischen Koordinaten abgebildet werden, und markieren Sie ihn durch Kratzen.
HINWEIS: Schädel Ausdünnung Position sollte nicht über oder in der Nähe Schädelnähte befinden, wie der Schädel Stabilität ist in diesen Gebieten gefährdet. Darüber hinaus sind große kortikale oder Hirnhautgefäße und Hirnhaut unterhalb der Schädelnähte liegt wahrscheinlich Bildartefakte verursachen. - Legen Sie die Metallhalterung mit Kleber über den Bereich von Interesse auf des Tieres Schädel beschichtet, mit leichtem Druck und 5 Minuten warten, bis die Metallhalterung ist fest mit dem Schädel geklebt. Mix Zahnzement (siehe Materialien und Ausrüstung) mit Polyacryl-Kleber in einem 3,5 cm-Petrischale (oder analog) zu zähflüssig Bedingungen zu erreichen.
- Verschließen Sie die Grenzen der Metallhalter mit dem Zement + Leim-Gemisch und decken die freigelegte Oberfläche des Schädels mit der gleichen Mischung bis auf die Haut Grenze.
- Warten Sie 15 min bis der Zement-und Leim-Gemisch trocknen lassen.
- Spülen des ausgedünnten Schädel-Region und den umgebenden Teilen des Metallhalters mehrere Male mit PBS, so dass die Reste der nicht polymerisierten Klebstoff weggewaschen.
HINWEIS: Es ist entscheidend, um eine stabile Befestigung der Schädel auf den Halter zu gewährleisten. Dies ermöglicht die Herstellung Stabilität während der Bildgebung. - Mit dem hohen Vergrößerungsmodus des binokularen Mikroskop, entfernen oberen Schichten der Schädelknochen mit einem Hochgeschwindigkeits-Mikrobohrer, einen ausgedünnten Schädel Bereich von ~ 0,5 bis 1,5 mm Durchmesser erstellen. Mit Druckluft beim Bohren der Knochenreste zu entfernen. Führen Sie die Bohrungen intermittently während der Durchforstung Verfahren, um reibungsbedingten Überhitzung zu vermeiden. Kühlen Sie den Bohrer mit der Lösung bei Raumtemperatur und Puffer regelmäßig gelten für den verdünnten Bereich, um Wärme zu absorbieren.
HINWEIS: Um Schäden an der Rinde zu vermeiden, nicht über große Regionen zu bohren (> 1,5 mm) bis auf eine dünne Schicht (<50 um).
HINWEIS: Das Nagetier Schädel Knochenstruktur besteht aus zwei dünnen Schichten von kompakten Knochen von einer dicken Schicht von spongiösen Knochen getrennt. Tiny Hohlräume der Spongiosa Form konzentrischer Kreise und Kanälchen, der Blutgefäße enthalten. Verwenden der Mikrobohrer, um sowohl die externe kompakten Knochenschicht und das meiste des schwammigen Schicht zu entfernen. Störung der Blutgefäße innerhalb des spongiösen Knochen kann zu Blutungen führen. Verwenden Hämostase Kollagenschwamm, diese Blutung zu stoppen. - Verwenden Erzeugung der zweiten Harmonischen (SHG)-Bildgebung zu untersuchen, ob die Mehrheit der spongiösen Knochen entfernt wurde. Seien Sie vorsichtig, um übermäßige Verdünnung zu vermeiden, stellen Sie sicher, dass die restlichen Knochen ist thFlimmern als 50 um in diesem Stadium der Herstellung.
- Geben Sie einen Tropfen warmen Puffer (35-37 ° C) auf der Oberseite des verdünnten Bereich. Verwenden Sie einen mikrochirurgischen Klinge oder Micro Finishing Bur weiter entfernen Knochenschichten und eine glatte Fläche von ~ 700 um im Durchmesser mit Knochendicke von ~ 20 um. In diesem Schritt ist es hilfreich, sich wiederholenden SHG Bildgebung durchführen und messen regelmäßig die Knochendicke.
- Führen TPEM Bildgebung für die Region von Interesse und einer Regelzone.
- Stellen Sie die Kopfposition mit den Ohr Bar Höhe Schrauben in einer Weise, die verdünnten Bereich ist streng horizontal angeordnet. Positionieren Sie die Nadel über dem ausgedünnten Region und stellen Sie sicher, dass es keine große Schiffe unter der Ziel-Website.
- Einen Läsion durch Eintauchen der Nadel in das Gehirn, um die Tiefe von 0,5-2,0 mm aus verdünnten Schädeloberfläche und entsprechend den Koordinaten der Schwanz an der Applikationsstelle.
- Entfernen Sie die Nadel und Blutungen unterdrücken nach t erscheinener akuten Hirnschädigung mit blutstillende Tampons (siehe Materialien und Ausrüstung). Warten Sie, bis Blutgerinnsel bilden und Gefäß Pulsation an der Verletzungsstelle anhält.
- Führen Sie die Mikroinjektion von 100 uM Sulforhodamin 101 oder eine andere Verbindung von Interesse in der Läsion, wie in Abschnitt 1.2.10 beschrieben.
- Führen TPEM Bildgebung, um die Schädigung Progression und Erholung zu überwachen, wie im Protokoll Nr. 3 beschrieben.
- Nach der Abbildung, lassen Sie das Tier das Bewusstsein aus der Narkose auf einem Heizkissen wieder zu erlangen. Das Tier nicht unbeaufsichtigt lassen und sie wieder in ihre Heimatkäfig erst nach vollständiger körperliche Erholung.
3. Imaging
- Legen Sie das Tier unter dem Mikroskop durch das Anbringen der Metallhalterung auf den speziell angefertigten Rahmen.
- Für die Bildgebung, verwenden Sie z. B. die FV1000MPE Zwei-Photonen-Mikroskop mit Mai Tai DeepSee Laser-und XLPLN 25X NA 1.05 Wasserimmersionsobjektiv für in vivo-Zwei-Photonen-optimiert sindImaging.
- Identifizieren Sie die Läsion unter dem Mikroskop mit Weitfeld-Fluoreszenz-Modus. Verwenden Sie lange Passfilter zu Hirngefäßsystem zu visualisieren, und wählen Sie die Kontrollzone nach dem beobachteten Muster der Blutgefäße.
- Um das Bild zu der Erzeugung der zweiten Harmonischen (SHG)-Signal, Abstimmung der Femtosekunden-Laser auf die 800 nm Wellenlänge und sammeln das emittierte Licht mit der 380-410 nm Bypass-Filter. Für Fluoreszenz-Imaging, verwenden Sie den Bandpassfilter (515-560 nm) emittiert Licht zu sammeln und die folgenden Wellenlängen verwendet werden, um die Fluoreszenz erregt: GFP-860 nm, 950 nm-YFP.
- Verwenden FluoView Software für Bildaufnahme.
- Shop-Koordinaten eines jeden ROI für nachfolgende wiederholende Bildgebung. Bild die gleiche ROIs im Laufe der Zeit und passen Koordinaten jedes Mal um das Bild zu Überschneidungen zu maximieren.
- Analysieren Sie Bilder mit der entsprechenden Software (zB. ImageJ). Rekonstruktionen hier vorgestellt wurden mit Imaris Software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
1) chronische Hirn Fenster und 2) Schädel Ausdünnung, für posttraumatische Gehirnbildgebung in transgenen Mäusen: Wir haben zwei Betriebsabläufe optimiert. Schematische Darstellung der Versuchspräparate ist in Fig. 1 dargestellt. Traumatische stechen durch Stahlnadel von 0,3 mm Außendurchmesser (30 G) an den Bohrbrunnen (Abbildung 1A) aufgebracht. Eine erfolgreiche Vorbereitung Schädelfenster ermöglicht die Abbildung in Tiefen bis zu 650 um unter der Pia-Oberfläche (Abbildung 1B), während Schädel Ausdünnung neigt dazu, eine Grenze von etwa 300 um (1C) zu verhängen, wie in der 3D-Rekonstruktion Thy1-YFP-Beweis H Maus kortikalen Pyramidenzellen.
Die Prick-Trauma Ergebnisse bei der Eliminierung von Dendriten und Zerstörung der Kapillare Netze in einer kontrollierten Volumen der Hirnrinde. Während der ersten zwei Tage, erhöht die Läsion Bereich und das Trauma induzierte Dendriten Blasenbildung und die Bildung von dendritischen Rückzugs bULBS in den Bereichen perilesion, wie unter Verwendung von in vivo-Multiphotonenmikroskopie (Fig. 2) beobachtet.
Wir führten Schädel Forst Bild Aktivierung und Migration von Mikroglia CX3CR1-EGFP Mäusen unmittelbar nach der Verletzung (Abbildung 3A). Die SHG-Imaging bietet ein wertvolles Werkzeug, um genau die Verletzungsstelle (3B) abzugrenzen. Extrazelluläre Matrix-Moleküle, die SHG-Signale zu erzeugen sind stark in Hirnparenchym an der Prick-Trauma bereichert. Zunächst werden feine Mikroprozesse abgerufen, dann Mikroglia-Zellen wandern an die Grenze der Verletzungsstelle (Abbildung 3A).
Um mögliche Verletzungen durch dünne Glaspipette Einführung und Lieferung von Farbstoff induzierte abzuschätzen, führen wir in vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie Experimente mit Sulforhodamin 101 Mikroinjektion in Thy1-YFP-H-Mäuse ohne Hirn-Trauma. In Fig. 4 gezeigten repräsentativen Bilder zeigen microinjection Website 3 Stunden nach der Injektion. Die Spur der Pipetteneinführungs in Hirnhäute durch SHG (4A) visualisiert erkennen. Astrozyten mit Sulforhodamin 101 durch die Injektion (Fig. 4B) eingeführt markiert. Dendriten YFP exprimieren unter Thy1-Promotor keine morphologischen Anzeichen von Verletzungen wie Bläschenbildung oder Einfahren Glühbirnen (Abbildung 4 C) zu demonstrieren.
Fig. 1 ist. Die Methode der akuten Hirnschädigung in Kombination mit Schädelfenster oder dünne Schädel Präparate in Kombination mit in vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie. A. Traumatische stechen durch Stahlnadel von 0,3 mm OD (30G), um das gebohrte angewendet. Die Nadel wird kurz in die Gehirn 0,5-2 mm Tiefe von der Boden der Vertiefung eingetaucht. B, C (C). D gezeigt. Hellfeld Blick auf die oberflächlichen Blutgefäße durch das Glasfenster unmittelbar nach dem akuten Hirnverletzung. E. Verdünnt Schädel vor der Verletzung Anwendung. Die gewählte Region von Interesse (weißer Rahmen) und der Schwanz an der Applikationsstelle (roter Kreis). Ein anderes Gebiet (roter Rahmen) des ausgedünnten Region sollte abgebildet werden, um mögliche Chirurgie-induzierte Artefakte zu überwachen.
Abbildung 2. Beispiel Längsmultiphotonen-Imaging von Gehirntrauma Entwicklung durch die ausgedünnten Schädel. Ein. Ump Blick auf die Verletzungsstelle durch YFP-markierten Dendriten der kortikalen Neuronen 20 min nach Trauma Zufügung, wie durch die ausgedünnten Schädel Vorbereitung abgebildet. B umgeben. Vergrößerte Ansicht des Gebiets in A skizziert. C. Der gleiche Bereich des Gehirns wie in B, reimaged 5 Tage nach Trauma. Mit roten Pfeilen - blebbing Dendrite ist mit weißen Pfeilen, dendritische Rückzug Glühbirnen gezeigt.
3. Beispiele von Überwachungs Entzündung und Glia-Aktivierung während der Entwicklung von Hirntrauma mit verschiedenen Markierungen für in vivo Bildgebung Multi zB fluoreszierende Proteine, Farbstoffe und Erzeugung der zweiten Harmonischen-Signals. Die Bilder wurden 3 h nach der Hirnverletzung erfasst.
Abbildung 4. Untersuchung von Gewebebelastung durch Injektionslösung über eine Glasmikropipette gemacht. A. Eine Spur (shown mit gestrichelten Linie) in SHG-Visualisierung von Hirnhäute 3 Stunden nach der Injektion. B. Astrozyten mit Sulphorhodamin gekennzeichnet durch die Injektion eingeführt. C. Dendriten YFP exprimieren unter Thy1-Promotors. D. Kombinierte Bild von A (SHG - grau), B (Astrozyten - rot), C (neuronalen Dendriten - gelb).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hirn-Trauma ist eine plötzliche, unvorhersehbare Ereignis. Hier, das Tiermodell, die ein Spektrum von in menschlichen Patienten nach einer Hirnschädigung wie Neurodegeneration, die Beseitigung von Dendriten, Gehirn-Ödem, Glia-Narben, Blutungen in der Hirnrinde verbunden mit Brenn Subarachnoidalblutung und erhöhte Durchlässigkeit der beobachteten pathologischen Veränderungen reproduziert beschreiben wir Blut-Hirn-Schranke. Um Primär-und Sekundär Pathogenese, sowie Rückgewinnung nach dem Trauma zu untersuchen, wurde diese Verletzung Modell mit Längs in vivo Visualisierung von feinen neuronale und gliale Strukturen kombiniert. Transgene Mauslinien wurden verwendet, die fluoreszierende Proteine Mikroglia (CX3CR1-EGFP) 9 Ausdruck in Neuronen (Thy1-YFP-H) 7, Astrozyten (GFAP-EGFP) 8, oder. Zusätzlich verwendeten wir Erzeugung der zweiten Harmonischen (SHG) Bildgebung und Astrozyten Beladung mit Sulfarhodamine 101 10.
Das hier beschriebene Modell rekapituliert penetration Art der Hirnverletzung. Daher ist eine Einschränkung der vorliegenden Modells ist, dass es keine Informationen über die Mechanismen von geschlossenen Kopfverletzung. Vor kurzem Schwert und Koautoren berichteten Multiphotonen-Imaging Ergebnisse auf das Zellverhalten in perikontusionelle Kortex 6. Unter Berücksichtigung, dass Kopfverletzungen geschlossen ist ein häufiger medizinische Fall wird der methodische Ansatz von den Autoren berichtet sehr vielversprechend zu den traditionellen Forschungsmethoden auf dem Gebiet der Auswirkungen Hirn-Trauma 11 zu ergänzen.
Wir haben sowohl die chronische Schädelfenster 12 und den Schädel Verdünnung 13 Vorbereitungen zur Zellverhalten unter posttraumatische Zustände in lebenden Gehirn zu studieren. Beide Verfahren haben bestimmte Vorteile und Einschränkungen. Somit stellt die chronische Hirn Fenster bessere Auflösung, verbesserten optischen Eindringtiefe in das Hirngewebe und Bequemlichkeit für mehrere Bilderzeugungseinheiten. Umgekehrt ist es weniger wahrscheinlich, um Entzündung zu induzieren th Schädel Ausdünnunge Abbildungsstelle, und, was vielleicht noch wichtiger ist, es erlaubt wiederholende Anwendungen von Arzneimitteln und Farbstoffen. Einige Beispiele von pharmakologischen Mitteln, um in dieser Art von Experimenten verwendet werden, sind in Tabelle 1 angegeben.
| Agent-Typ | Mittel injiziert | Bereichen der Biologie / Pharmazie Forschung |
| Anti-inflammatory | Cyclosporin A | Schädel-Hirn-Verletzung, Folgeschäden, Neurodegeneration |
| Toxine | Tetrodotoxin | TBI - Folgeschäden, excytotoxicity |
| Bicucullin | TBI - Folgeschäden, Chlorid-Homöostase | |
| Inhibitoren von Signalwegen | PD98059 (MAPKK Inhibitor) | Signalmechanismen der Entzündung, Folgeschäden, posttraumatische Zelltod, Neurodegeneration und Regeneration |
| SU6656 (Src-Familie-Kinase-Inhibitor) | ||
| Neurotrophen Faktoren | Brain-derived neurotrophic factor, BDNF | TBI - neuronale Überleben nach der Verletzung, Neuroprotektion in sekundären posttraumatischen Hirnschäden |
| Viren | lentiviralen Vektoren für die Proteinexpression | molekularen Mechanismen der posttraumatischen Neurodegeneration und Regeneration, Differenz Kennzeichnung von Zelltypen im Gehirn beschädigt für in-vivo-Bildgebung |
| Adenovirus-Vektoren für die Proteinexpression | ||
| Ca 2 +-Fluoreszenzindikatoren | Fluo-2, 4 | Signal-Mechanismen der posttraumatischen Entzündungs-, Zelltod, Zellmigration, axonale / dendritischen Regenerations |
Tabelle 1. Pharmakologische Mittel und Farbstoffe für die Injektion in kortikalen stechen Verletzungsmodell.
Eine breite Palette von biochemischen Ereignisse, die unter physiologischen und pathologischen Bedingungen sehr wichtig sind, können mit chemischen Inhibitoren, Fluoreszenzindikatoren und mutierten Protein über virale Konstrukte eingeführt sondiert werden. Vorteile für die Wahl bestimmten Zeitfenster durch den Schädel Ausdünnung Vorbereitung bereitgestellt werden, können für diese Studien sehr relevant sein.
In der vorliegenden Studie haben wir Erzeugung der zweiten Harmonischen Signal, um die Verletzungsstelle abzugrenzen. Alternativ könnten die Verletzungsstelle Grenzen durch eine schwach streu fluoreszierenden Farbstoff angezeigt werden, zum Beispiel eine hochmolekulare Dextran fluoreszierendes Konjugat (2 Millionen Dalton).
Kürzlich, Schaffer und Kollegen 14 haben eine chronische Herstellung verwendetwieder zu öffnenden Fenster mit Schädel für wiederkehr Lieferung von Fluoreszenzfarbstoffen auf Maus Kortex. Es ist wahrscheinlich, dass die Schädelfenster Wiedereröffnung kann sich nachteilig das Hirngewebe Transparenz beeinflussen. Darüber hinaus ist es schwierig, den Zeitverlauf der Wiederaufnahme-induzierte Entzündung, die das Bindegewebe Nachwachsen beeinflussen können vorherzusagen.
Ein wesentlicher Vorteil des verdünnten Schädel Herstellung ist die Möglichkeit, therapeutische Verbindungen (und andere Materialien erfordern topische Injektion in Hirngewebe) mehrere Male während der Progression des Traumas, ohne komplizierende Artefakte (z. B. ohne Hirn Fenster Wiederaufnahme) zu liefern.
Wenn sich wiederholende Verbindung Lieferung direkt an der Verletzungsstelle gewünscht wird, sollte man spezielle Mittel betrachten, um Schädel Austrocknung und bakteriellen Infektionen zu verhindern. So halten die betrieben Kopfbereich unter sterilen Bedingungen und Anwendung von Antibiotika (wie Enrofloxacin) empfohlen. Um die t erhaltenhinned Schädel Region vor dem Austrocknen, füllen Sie die Metallhalterung mit 1,5% igen und bedecken Sie es mit runden Deckglas. In den meisten Fällen wird es bei gleicher Transparenz oder verdünnt Schädel über den Zeitraum von bis zu 10 Tagen. Einige zusätzliche geboten, wenn mehrere Imaging-Sitzungen in der ausgedünnten Schädel Herstellung sind über einen längeren Zeitraum geplant werden. Unmittelbar vor jeder Bildgebungssitzung, entfernen Sie vorsichtig die neu gebildete Bindegewebe aus dem verdünnten Bereich mit einem mikrochirurgischen Klinge. Verwenden Sie die TPEM Bildgebung von SHG, die Bildqualität und Knochendicke Maßnahme zu überprüfen. Gewebeneuwachstum kann die Eindringtiefe und Bild Ursache Unschärfe begleitet von einer Erhöhung der Hintergrundfluoreszenz zu kompromittieren. Aktualisieren Sie die Schädel Verdünnung vorsichtig mit einem mikrochirurgischen Klinge, um hohe Abbildungsqualität wieder zu erlangen.
In den Fällen, die nicht den direkten Zugriff auf die verletzte Stelle benötigen, empfehlen wir für den verdünnten Bereich des Schädels mit einem Glas coverslip wie in der Papier-und Stahl auf polierten Schädel beschrieben verdünnt Vorbereitung von Kleinfeld und seine Kollegen 15. Dies kann mit der folgenden optionalen verfahren. Setzen Sie einen kleinen Tropfen Agarose (1,5%) auf dem ausgedünnten Schädel Region, warten, bis es ein Gel, entfernen Sie alle unnötigen Agarose, also lassen Sie es nur an der Verletzungsstelle. Agarose sollte die Verletzungsstelle vor äußeren Einflüssen zu schützen. Trocknen Sie die ausgedünnten Oberkopf mit Druckluft. Lassen Sie eine kleine Menge von Polyacryl-Kleber auf einem kleinen Stück # 0 Deckglas und legen Sie es auf dem ausgedünnten Schädel Region. Der Kleber verhindert, Polyacryl Knochen und Bindegewebe Nachwachsen, und hält so die ausgedünnten Schädel unter dem Fenster erhalten.
Eine Kombination dieser Verfahren ermöglicht das Studium akute und chronische posttraumatische Prozesse und liefert Medikamente topisch oder systemisch und direkt die Überwachung der Behandlungseffekte. Verwendung von Dual-oder Triple transgenen Mauslinien kann auch nützlich, parti seinders für die gleichzeitige Darstellung von mehreren posttraumatische Prozesse, wie Gliazellen Narbenbildung und neuronalen Zweig Nachwachsen. Wir erwarten, dass unsere Modelle von akuten Hirnschädigung untersucht mit Intravital Zwei-Photonen-Mikroskopie zu beweisen, fruchtbar für Medikamentenkandidaten Tests.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir sind zutiefst dankbar, dass Dr. Frank Kirchhoff für die Bereitstellung von GFAP-EGFP und CX3CR1-EGFP Mausstämme. Die Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem Zentrum für internationale Mobilität von Finnland, Tekes, der finnischen Graduate School of Neuroscience (FGSN) und der Akademie von Finnland unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2A-sa dumb Tweezers, 115 mm | XYtronic | XY-2A-SA | |
| 30 G ½ in needle | BD | REF 304000 | |
| Animal trimmer, shaving machine | Aesculap | Isis GT420 | |
| Binocular Microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Biological Temperature Controller with stainless steel heating pad | Supertech | TMP-5b | |
| Blunt microsurgical blade | BD | REF 374769 | |
| Borosilicate tube with filament | Sutter Instruments | BF120-69-10 | For glass pipette production |
| Carprofene | Pfizer | Rimadyl vet | |
| Chlorhexidine digluconate | Sigma | C9394 | |
| Dental cement | DrguDent, Dentsply | REF 640 200 271 | |
| Dexamethasone | FaunaPharma | Rapidexon vet | |
| Disposable drills | Meisinger | HP 310 104 001 001 008 | |
| Dulbeco’s PBS 10x | Sigma | D1408 | |
| Dumont #5 forceps, 110 mm | FST | 91150-20 | |
| Ealing microelectrode puller | Ealing | 50-2013 | Vertical puller for glass pipette production |
| Eye ointment | Novartis | Viscotears | |
| Foredom drill control | Foredom | FM3545 | |
| Foredom micromotor handpiece | Foredom | MH-145 | |
| Gas anesthesia platform for mice | Stoelting | 50264 | Assembled on stereotaxic instrument |
| Hemostasis Collagen Sponge | Avitene, Ultrafoam BARD | Ref 1050050 | |
| Imaris | Bitplane | ||
| Ketamine | Intervet | Ketaminol vet | |
| Mai Tai DeepSee laser | Spectra-Physics | ||
| Metal holder | Neurotar | ||
| Microdressing forceps, 105 mm | Aesculap | BD302R | |
| Microfil | WPI | MF34G-5 | Micro syringe filling capillaries |
| Mineral oil | Sigma | M8410 | |
| Multiphoton Laser Scanning Microscope | Olympus | FV1000MPE | |
| NanoFil Syringe 10 μl | WPI | NANOFIL | Hamilton syringe |
| Nonwoven swabs 5 x 5 | Molnlycke Health Care | Mesoft | Surgical tampons |
| Polyacrylic glue | Henkel | Loctite 401 | |
| Round glass coverslip | Electron Microscopy Sciences | ||
| 1.5 thickness | |||
| Small animal stereotaxic instrument | David Kopf Instruments | 900 | |
| Stoelting mouse and neonatal rat adaptor | Stoelting | 51625 | Assembled on stereotaxic instrument. |
| Student iris scissors, straight 11.5 cm | FST | 91460-11 | |
| Sulforhodamine 101 | Molecular Probes | S-359 | |
| UMP3 microsyringe pump and Micro 4 microsyringe pump controller | WPI | UMP3-1 | Microinjector and controller |
| Xylazine | Bayer Health Care | Rompun vet |
References
- Lighthall, J. W. Controlled cortical impact: A new experimental brain injury model. J. Neurotrauma. 5 (1), 1-15 (1988).
- Lindgren, S., Rinder, L.
- Shreiber, D. I., et al. Experimental investigation of cerebral contusion: histopathological and immunohistochemical evaluation of dynamic cortical deformation. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 58 (2), 153-164 (1999).
- Feeney, D. M., Boyeson, M. G., Linn, R. T., Murray, H. M., Dail, W. G. Responses to cortical injury: I. Methodology and local effects of contusions in the rat. Brain Res. 211 (1), 67-77 (1981).
- Bardehle, S., et al. Live imaging of astrocyte responses to acute injury reveals selective juxtavascular proliferation. Nat. Neurosci. 16 (5), 580-586 (2013).
- Sword, J., Masuda, T., Croom, D., Kirov, S. A. Evolution of neuronal and astroglial disruption in the peri-contusional cortex of mice revealed by in vivo two-photon imaging. Brain. 136 (5), 1446-1461 (2013).
- Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
- Nolte, C., et al. GFAP promoter-controlled EGFP-expressing transgenic mice: a tool to visualize astrocytes and astrogliosis in living brain tissue. Glia. 33 (1), 72-86 (2001).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol. Cell. Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F., Kerr, J. N. D., Helmchen, F. Sulforhodamine 101 as a specific marker of astroglia in the neocortex in vivo. Nat. Methods. 1 (1), 31-37 (2004).
- Carré, E., et al. Technical aspects of an impact acceleration traumatic brain injury rat model with potential suitability for both microdialysis and PtiO2 monitoring. J. Neurosci. Methods. 140, 23-28 (2004).
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat. Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nat. Protoc. 5, 201-208 (2010).
- Cianchetti, F. A., Kim, D. H., Dimiduk, S., Nishimura, N., Schaffer, C. B. Stimulus-evoked calcium transients in somatosensory cortex are temporarily inhibited by a nearby microhemorrhage. PloS one. 8 (5), (2013).
- Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A polished and reinforced thinned-skull window for long-term imaging of the mouse brain. J. Vis. Exp. 61, (2012).
