Summary
Bu protokol, tek bir hücre çözünürlükte in vivo olarak, gerçek zamanlı olarak çok-etkileşimlerin uzatılmış zaman atlamalı görüntüleme gerçekleştirmek için multiphoton mikroskobu kullanımını tarif eder.
Introduction
primer meme tümörü tümör hücrelerinin yayılması makrofajlar ve endotel hücreleri dahil olmak üzere stromal hücreler sadece tümör hücrelerini içerir, ancak ana bilgisayar gösterilmiştir. Bundan başka, tümör damar sistemi artan geçirgenliği 1 anormaldir. Bu durumda, tümör hücreleri, makrofajlar ve endotelial hücreler, primer tümör mikro-vasküler geçirgenliği ve tümör hücre intravasation aracılık etkileşim belirleyen anlaşılması metastaz için önemlidir. damar geçirgenliği, tümör hücre intravazasyonunda ve tümör mikroçevresinde çok hücreli etkileşimler altında yatan sinyal mekanizmasının kinetik anlama anti-kanser tedavilerinin geliştirilmesine ve yönetiminde önemli bilgiler sağlayabilir.
In vivo olarak tümör damar geçirgenliğini incelemek birincil yöntemi Evans Mavi 2, yüksek molekül ağırlıklı dekstranlar (155 kDa) halinde ekstravasküler boyalar ölçülmesi olmuşturBoyanın enjeksiyonundan sonra sabit bir zaman noktalarında 3 ve florofor ya da (albümin dahil) Radyoaktif-konjüge proteinler 4. Mikroskopi Gelişmeler, hayvan modelleri ve floresan boyalar intravital mikroskobiyle 5 boyunca hücresel süreçleri ve canlı hayvan vasküler geçirgenliğin görselleştirme sağlamıştır.
Birkaç kez puan üzerinden statik görüntülerin, ya da kısa time-lapse dizilerinin satın alarak Canlı hayvan görüntüleme tümörün mikro 6,7 dinamik olayların anlaşılması için izin vermez. Nitekim, 24 saat boyunca statik bir görüntü elde etme tümör damar ancak damar geçirgenliği dinamikleri 6 gözlenmemiştir, sızdıran olduğunu göstermiştir. Böylece, 12 saate kadar uzatılmış sürekli time-lapse görüntüleme tümör mikroçevresinde dinamik olayların kinetik yakalar.
Bu protokol, uzun bir zaman atlamalı multiphot kullanımını tarif ederintravital mikroskopi tümör mikro-dinamik çok hücreli olayları incelemek için. tümör mikroçevresinde birden fazla hücre tipleri enjekte edilebilir boyalarla veya floresan proteinleri ifade transgenik hayvanlar kullanılarak etiketlenir. vasküler boyalar veya proteinler görüntüleme başladıktan sonra enjekte edilebilir bir kuyruk damarından sonda kullanılarak tümör mikro çok hücreli olayların kinetik veriler elde etmek için. canlı hücre görüntüleme için meme tümörü deri bir kapakla cerrahi hazırlık aracılığıyla maruz kalmaktadır. Görüntüler birden photomultiplier tüpler (PMT) dedektörleri 8 ile donatılmış bir multiphoton mikroskop kullanarak 12 saate kadar için edinilir. Uygun filtreleri kullanarak, bir çıkarma algoritması tümörün mikro aynı anda 9 5 floresan sinyalleri elde etmek 4 PMT dedektörleri sağlar. Yüksek çözünürlüklü multiphoton İntra vital mikroskopik daha iyi bir yol, tümörün mikro tümör stromanın etkileşimleri, tek bir hücre çözünürlüklü görüntü yakalar Uvasküler geçirgenlik ve tümör hücre intravasation 10-13 nderstanding. Spesifik olarak, bir tümör hücresi, bir makrofaj ve endotel hücre arasındaki etkileşimi bölgelerde seçici meydana genişletilmiş intravital görüntüleme ortaya yüksek derecede lokalize edilen, geçici vasküler geçirgenlik etkinlik 13 (metastaz, TMEM 14 tümör mikro-olarak tanımlanmıştır). Bundan başka, tümör hücre intravasation, sadece TMEM gerçekleşir ve uzamsal ve geçici olarak vasküler geçirgenliği 13 ile ilişkilidir. Bu olayların dinamiklerinin tek hücreli çözünürlükte tümör mikroçevresinde floresan işaretli hücrelerin uzun time-lapse multiphoton mikroskobu kullanımı ile mümkün olmuştur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
açıklanan tüm işlemler Tıp Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Albert Einstein College of tarafından önceden onay da dahil olmak üzere omurgalı hayvanların kullanımı için kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak yapılmalıdır.
1. Getirici floresanla işaretlenmiş tümörler ve tümör bağlantılı makrofajlar
- Gelişmiş yeşil floresan fare meme tümörü virüsü uzun terminal tekrarı, yani fluoresan muhabir [transgenik fareler polioma orta T antijenini (MMTV PyMT) tahrik kendiliğinden, yerli, genetik olarak fare meme kanseri modeli geçerek floresan etiketli tümör hücrelerinin oluşturmak protein (EGFP), geliştirilmiş mavi floresan proteinin (ECFP) ya da Dendra2] 8,9.
- PyMT hayvanlarda floresan etiket makrofajlar ile floresan [yani, MacGr myeloid- ve makrofaj spesifik floresan gazetecilere genetiği fare modelleri geçerek tümör hücrelerinin etiketlieen 15 veya MacBlue farenin CSF1R -GAL4VP16 / UAS ECFP 16].
- Seçenek olarak ise, floresan floresan etiketli PyMT tümör hücreleri (singeneik), insan meme kanseri hücre soyları ya da primer insan hastaya türevli tümörlerde (ksenogrefleri) 11,17 ortotopik transplantasyon ile tümörlerinin, etiketli oluşturur.
- İmplant floresan floresan etiketli tümör hücreleri ve miyeloid hücreler 13 hayvanlar oluşturmak için floresan protein etiketli miyeloid hücreler ile singeneik farelere PyMT tümör hücrelerini etiketli.
- başlangıç 2 saat önce floresan etiket makrofajlara insan hücre çizgileri ve hasta türetilmiş primer tümörlerin ksenograft tümör ağır birleşik bağışıklık eksikliği (SCID) farelere 10 mg damar içi (IV) kuyruk damarı / kg floresan 70 kDa dekstran 100 ul enjekte intravital görüntüleme.
2. Mikroskop Kurulum ve Görüntüleme Hazırlık
Not: Bu yordam set-up açıklarBir multiphoton mikroskop 8 intravital görüntüleme için.
- iki foton lazerler ve dedektörler de dahil olmak üzere tüm mikroskop ve lazer bileşenleri açın.
- sahne öncesi ısınmak için 30 ° C, ısıtma kutusunu açın. Bu adım, bir hayvan fizyolojik ısısını muhafaza etmek için kritiktir.
- ters bir mikroskop yerinde mikroskop sahnede ısmarlama sahne uç ile kullanım içindir. Özel uç görüntüleme için merkezi delikten geçen çapı "sahne ekleme uzayda ve 1 ile uyacak şekilde işlenmiş kalın alüminyum" 1/8 bir sayfadır.
- % 70 etanol ve kuru hava ile mikroskop sahne ve sahne parçasını silin.
- cam kapak ile optik temas sağlamak için 20X, 1.05 NA mikroskop objektif su büyük damla yerleştirin.
- mikroskop sahne uç üzerindeki görüntüleme portu üzerinden yer cam kapak (# 1.5 kalınlık). laboratuar bant ile yerde sabitleyin.
- 2 cm x 2 cm delik yumruk bir delik yumruk kullanınve esnek bir lastik pedi özel sahne eki delik ile uyumlu pad deliği mikroskop sahnede lastik pedi yerleştirin.
Görüntüleme sırasında Enjeksiyon için 3. Kuyruk Ven Kateterine hazırlanması ve Reaktifler
- polietilen (PE) tüp içinde 30 cm uzunluğunda kesilir.
- plastik montaj kopana kadar forseps kullanarak, ileri ve geri bir 31 G iğne metal iğne taşımak.
- forseps kullanarak, PE boru içine müstakil iğnenin künt ucunu.
- PE boru diğer ucunu bir 31 G iğne takın.
- steril fosfat tamponlu salin (PBS) ile 1 cc şırınga doldurun ve 31 G iğne takın ve PBS ile tüp ve iğne bütün havayı temizlemek. PBS hidrasyon ve kan ozmolarite 9,18 muhafaza etmek için kullanılır, bununla birlikte izotonik tuz da kullanılabilir.
- 3 mg, 200 ul 1 cc şırınga doldurmak / 155 kDa dekstran-tetrametilrodamin (TMR kg) Veya vasküler etiketleme için kuantum noktaları.
- Bu buz üzerinde 1 cc şırınga ve yerine vasküler endotelyal büyüme faktörü A (VEGFA 165) içindeki bir 165 amino asit izoformunu gibi diğer enjekte edilebilir proteinleri hazırlayın. 0.05 mg / ml'lik bir konsantrasyonda 0.2 mg / kg VEGFA 165 19 enjekte edilir.
Kalıcı Tail Ven Kateter 4. yerleştirilmesi
- Taşıyıcı gaz olarak O 2 ile% 5 izofluran ile bir indüksiyon odasını kullanarak anestezi altında hayvan yerleştirin.
- tam anestezi ve bir ayak tutam yanıt vermiyor kez ameliyat platforma fare aktarın.
- Cerrahi platforma Açık izofluran anestezi hattı, indüksiyon odasına anestezi hattını kapatın ve hayvanın burnu üzerine burun konisi yerleştirin. 2.5% 5 ile% den izofluran azaltın.
- anestezi sırasında kurumasını önlemek için fare gözleri oftalmik merhem sürün.
- ısıtma lambası altında hayvan ısıtınEk 2 dk kuyruk dolaşımını artırmak için sirkülasyon derin anestezi ile yavaşlatır olarak.
- % 70 etanol ile fare kuyruğu ven sterilize edin.
- hayvanın yan kuyruk damar içine Bölüm 3 inşa kateter 31 G iğne ucu yerleştirin ve 2-3 mm iğne itin.
- kuyruk damarından yerleştirilir kateter sağlanması, kan görmek şırınga geri çekin.
- kuyruk uzunluğu boyunca damar yer paralel iğne tutma iğne üzerine yerleştirilen laboratuvar bant 1 cm uzunluğu kullanın.
5. Cilt Kapak Cerrahi Prosedür Meme Tümör Açığa
- ameliyat işlemine hayvan tümörü ve% 70 etanol ile ventral yüzeyi bez. Not: tarif edildiği gibi, bu işlem tam aseptik gerçekleştirilmez. enfeksiyon karıştırıcı bir faktör haline gelebilir uzun görüntüleme oturumları için, uygun aseptik teknik kullanılması tavsiye edilir.
- Steri kullanmaSteril makas ventral orta hat uzunluğu yaklaşık 1 cm boyunca bir cilt altı kesi yapmak ile le forseps, ventral cilt kaldırın. insizyon sırasında periton delinmesiyle kaçının.
- Yavaşça meme tümörü açığa çıkarmak üzere periton meme bezi ve tümör bağlama bağ dokusu kesti.
- yavaşça çıkarın ve tümör damar bütünlüğünü korumak ve kanama en aza indirirken tümörün maruz yüzeyinden fasya ve yağ kesip, makas ve forseps kullanma. Bu adım tümörün tümör mimarisi ve damar kaynağı sağlamada önemlidir.
Mikroskopi 6. Hayvan hazırlanması
- görüntüleme için mikroskop objektif üzerine sahne insert üzerine lamel üzerine yerleştirilir maruz tümör ile önceden ısıtılmış görüntüleme aşamasına hayvan aktarın. İğneyi çıkarmak için değil, böylece hayvan ile hafifçe kuyruk ven kateteri aktarmak için özen gösterin.
- Yeri inciHayvanın burnu üzerinden e anestezi burun konisi% 3 izofluran anestezi seti korumak için.
- Tümör kauçuk ped deliğe aittir ve cam lamel ile temas eder, böylece hayvan yerleştirin.
- yavaşça yerine tümör tutun ve görüntü alımı sırasında hareketi azaltmak için laboratuvar bant ile mikroskop sahneye bunları düzeltmek için iki lastik pedleri kullanmayın.
- hidratlı doku tutmak ve lamel ile optik temas sağlamak için PBS ile lastik pedi odasına doldurun.
- Bir pulse oksimetre probu ile hayvanın hayati belirtilerini izlemek başlayın. hayvan uyluk bir klip sensörünü takın. Seçenek olarak boyun çevresine uyacak şekilde yapılandırılmış bir yaka kullanılabilir.
- 30 ° C 20 korumak için hayvan üzerinde ısıtma kutusu yerleştirin.
- Yavaş yavaş anestezi korumak ve kan akışını korumak için 0.5-1% izofluran düzeyini azaltır.
7. Görüntü Alma ve Fluoresc Enjeksiyonent Boyalar ve Enjekte Proteinler
- Tümörün yüzeyinde floresan tümör hücreleri üzerinde mikroskop mercek odak kullanma.
- kan damarlarını akan alanları bularak ilgi alanı seçin. akan kan damarları ile ilgi alanının seçimi tümör damarsal değerlendirmek için kritik öneme sahiptir.
- ilgi bir bölge seçildikten sonra multiphoton görüntüleme moduna mikroskop geçin.
- z-serisi üst ve alt limitlerini ayarlayın. istediğiniz başlangıç konumuna hedefi taşımak için odak ayarlayıcısı kullanarak ve Z konumu "Üst" butonuna tıklayarak z serinin üst sınırını ayarlayın. ikinci harmonik üretimi (SHG) kanal tümör yüzeyindeki kolajen lif şebekesi görselleştirilmesi ve hiçbir hücre sadece kolajen lifleri görünür olduğunda gözlemleyerek z serisinin üst sınırını belirleyin.
- (Typica istenen görüntüleme derinliğe kadar objektif hareket ettirerek z serisinin alt sınırını ayarlayınLly 50-150 mikron) ve Z konumu tıklayarak "Alt" tuşuna basınız.
- adım büyüklüğü alanına istediğiniz değeri yazarak adım boyutunu ayarlayın. çözünürlük ve satın alma süre hususlara dayalı adım boyutunu belirlemek (genellikle 2 mikron yüksek çözünürlüklü 3 boyutlu rekonstrüksiyon için kullanılan ve 5 mikron aksi bir).
- Time-Lapse alanına istenilen hızlandırılmış zamanı Time-Lapse paneline geçiş ve girerek time-lapse aralığını ayarlayın. Optimal zamansal çözünürlük için sürekli görüntüleme için 0 sn için zaman aralığını ayarlayabilirsiniz. Not: Uzun time-lapse görüntüleme için objektif daldırma sıvı doldurmak için satın almalar arasında 10 sn zaman aralığını ayarlamak için tavsiye edilir.
- görüntüleme için parametreler belirlenmiştir edildikten sonra, yavaş yavaş 155 kDa dekstran-TMR enjekte edilir.
- Kuyruk ven kateteri PBS ile şırınga çıkarın ve li içine herhangi bir kabarcıklar tanıtmak için 155 kDa dekstran-TMR özen içeren şırınga ile değiştirinne.
- Yavaş yavaş 200 ul maksimum hacmi ile, fare içine 155 kDa dekstran-TMR enjekte ve şırınga PBS içeren şırınga değiştirin. KRİTİK ADIM: yavaş yavaş enjeksiyon yapın ve ven dışında çözüm almamak için önlem alın.
- Kayıt butonuna tıklayarak daha sonra bunları bastırmak için Z-Stack ve Time-Lapse düğmeleriyle tarafından Z-yığın time-lapse görüntüleme edinilmesini başlatın.
- Diğer floresan dekstranlar, örneğin, 10 kDa dekstran-floresin izotiyosiyanat (FITC), veya proteinler, örneğin, VEGFA 165, önceden hazırlanmış ise, 0 = en az bir başlangıç için görüntü elde başladıktan sonra bunları enjekte edilir.
- Kuyruk ven kateteri PBS ile şırınga çıkarın ve hattına herhangi bir kabarcıklar tanıtmak için 10 kDa dekstran-FITC veya VEGFA 165 özen içeren şırınga ile değiştirin.
- Yavaşça kuyruk ven kateter yoluyla fare içine enjekte edilebilir enjekteve PBS ihtiva eden bir şırınga ile bir şırınga değiştirin.
- Her 30-45 dk, yavaş yavaş hayvanın hidrasyon korumak için PBS veya serum fizyolojik 50 ul enjekte edilir.
8. Ötenazi
- görüntü alımı bitiminde, hayvan euthanize.
- % 5 izofluran artırın.
- nefes ve sahne hayvan kaldırmak çözüldükten sonra 30 saniye kadar% 5 izofluran altında hayvan tutun.
- tam ötenazi sağlamak için servikal dislokasyon gerçekleştirin.
9. Görüntü İşleme
- her zaman bir noktada her kanal için 16 bit TIFF dosyalar görüntüleri kazanmak ve sırayla kaydedin.
- Spektral örtüşme (yani, GFP ve OBP), xy sürüklenme ortadan kaldırılması ve ImageJ 9 kurulan yöntemler kullanılarak time-lapse dizilerinden film nesil ayrılmasını gerçekleştirin. Yüksek çözünürlüklü görüntüler 13 3D yüzey rekonstrüksiyon gerçekleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Genişletilmiş zaman atlamalı intravital mikroskopi tümör mikroçevresinde çok hücreli süreçlerin tek bir hücre çözünürlükte görüntüleme sağlıyor. floresan etiketleme tümör hücreleri, makrofajlar, vasküler alan, ikinci harmonik oluşumu sinyali kullanılarak kolajen lif şebekesi görselleştirerek, tümörün mikro birden fazla bölme aynı zamanda görüntüleme sırasında izlenir. Dendra2 (Şekil 1A) ile etiketlenmiş meme tümörü hücreleri, MMTV PyMT-Dendra2 farelerde yapıldığı gibi floresan proteinleri ile etiketlenmiş tümör hücreleri, transgenik farelerde oluşturulabilir. ECFP ile etiketlenmiş makrofajlar olan CSF1R -GAL4VP16 / UAS ECFP fareleri Bu transgenik fareler, kapısı tarafından tümör hücreleri ve makrofajlar hem MMTV PyMT farelerde etiketlenir. Tümör hücrelerinin ve makrofajların Çift etiketli stratejisi ile, iki hücre türleri doğrudan etkileşim (Şekil 1A, gerçek zamanlı olarak görselleştirilebilir). Buna ek olarak, GFP ile transduse insan göğüs kanseri hücre hatları veya hasta türevli tümör hücreleri, tümör hücreleri etiketlemek için kullanılabilir. Makrofajlar fagositik makrofajlar (Şekil 1B) birikir floresan etiketli 70 kDa dekstran kullanılarak etiketlenebilir. Bu yöntemler, tümör hücre makrofaj akış motilite, damar geçirgenliği ve tümör hücre intravazasyonunda gibi dinamik çok hücreli olayların çalışma terfi var. Tümör vasküler geçirgenlikte değişiklikleri görselleştirmek için bir floresan etiketli yüksek molekül ağırlıklı dekstran (155 kDa veya daha 9,13,21,22 tavsiye edilir) ya da kuantum noktaları vasküler boşluk (Şekil 1) etiketlemek için kullanılır. 155 kDa dekstran ya da kuantum nokta da hali hazırda interendothelial boşluk 23 içinden difüze olmayan yeterince büyüktür.
Sürekli yüksek çözünürlüklü görüntüleme vasküler geçirgenlik olaylar ve yakalama kolaylaştırırTMEM (Şekil 2 ve film 1) en dekstran ekstravazasyon ve klirens kinetiği ölçümü. Vasküler boşluk kolayca (Şekil 2 '0 gibi) time-lapse dizisinin başlangıcında 155 kDa dekstran ile tanımlanır beri ekstravasküler floresan dekstran time-lapse dizisi her karesinde belirlenebilir. 2 ve Sinema Şekil 155 kDa dekstran-TMR bir MMTV PyMT-Dendra2 bir kuyruk ven kateter aracılığı ile enjekte 1 ekstravazasyonu göstermek; CSF1R-OBP fare. Dendra2 etiketli tümör hücreleri (yeşil) ve CFP etiketli makrofajlar (mavi), canlı hayvanlarda TMEM tanımlamak için kullanılır. Vasküler geçirgenliğin yerinde TMEM yapısı beyaz kutu içinde gösterilmiştir. damar uzay vasküler geçirgenlik olaylar sırasında damarsal ve damar içeriğinin ekstravazasyon akan görselleştirmek için 155 kDa dekstran-TMR (kırmızı) ile etiketlenir. 155 kDa dekstran TMR ekstravazasyon pikŞekil 2 29 've 34' arasında görülür. Ekstravasküler dekstran 155 kDa dekstran-TMR kanalı sadece gösteren üst panellerde beyaz ok at ve alt panellerde kırmızı ok görülüyor. 155 kDa dekstran-TMR dokudan temizler ve Şekil 2'de '97 de görüldüğü gibi ekstravasküler TMR sinyalinde azalma olarak görülmektedir. ImageJ ekstravasküler dekstran time-lapse dizisinin derleme sayısal sonra.
tümörün mikro spontan olaylar gözlemleyerek yanı sıra, tespit olayların altında yatan moleküler mekanizmayı incelemek önemlidir. Ek vasküler boyalar veya vasküler geçirgenliği düzenleyen sinyalizasyon olaylar içgörü sağlayabilir damar geçirgenliğini ikna etmek proteinleri enjekte. Şekil 3 10 kDa dekstran-FITC (yeşil) ve 155 kDa dekstran-TMR (kırmızı) ekstravazasyonunda farkı gösterir.Yüksek molekül ağırlıklı 155 kDa dekstran-TMR time-lapse görüntüleme başlamadan hemen önce uygulanır. Beş Z-yığınlarının 10 kDa dekstran-FITC enjekte edilmeden önce bir temel kurmak için time-lapse dizisi olarak elde edilir. 5. kazanılmasından sonra görüntü elde etme kesmeden 10 kDa dekstran-FITC kuyruk ven kateter aracılığıyla verilir Z-yığın. 155 kDa dekstran-TMR vasküler boşluk (Şekil 3, 0 've 6') sınırlı kalır ise dekstran-FITC hemen ekstravazasyonu ile damarsal giren görüldü edilir. 10 kDa dekstran-FITC ile tamamen kan kabından extravasates ve damar (56 've Film 2 de görüldüğü gibi, Şekil 3) 155 kDa dekstran TMR ayrılan dokulardan temizlenir. Enjeksiyondan önce bir zaman noktası kullanılarak, 10 kDa dekstran FITC ekstravazasyon kinetiği hali hazırda 155 kDa dekstran TMR 13 ile karşılaştırılabilir. 10 kDa dextr hemen ekstravazasyonenjeksiyondan sonra bir-FITC damarsal 155 kDa dekstran-TMR tutulması ve spontan vasküler geçirgenlik olaylardan 13 önemli ölçüde farklı olduğunu. Ek deney kontrol endotel veya VEGFA 165 aracılı geçirgenliği 13 ile mekanik bozulma yoluyla vasküler geçirgenliği başlatma dahil olmak üzere gerçekleştirilebilir. Spontan geçirgenliği etkinlikleri 155 kDa dekstran TMR ekstravazasyonu kinetiği 10 kDa dekstran, ve tümör mikro-vasküler geçirgenliği etkinlikleri yer etkinliklerle sinyalleri anlama vasküler geçirgenliği indüklemek vasıtalarıyla karşılaştırılabilir.
Tümör mikroçevresinde hücreleri ve damarsal etiketlemek için Şekil 1. Stratejileri. (A) Dendra2 etiketli tümör hücreleri ile Transgenik MMTV PyMT fare (MMTV-icre / CAGCAT-Dendra2 / MMTV PyMT) ve CFP ile etiketlenmiş makrofajlar (CSF1R -GAL4VP16 / UAS ECFP). Tümör damar kuyruk ven kateteri tarafından yönetilen 155 kDa dekstran-TMR ile etiketlenmiş. (B) kuyruk ven kateteri kullanılarak kuantum nokta ile etiketlenmiş 70 kDa dekstran-Texas Kırmızı ile işaretlenmiş makrofajlar ve damarsal ile TN1-GFP hasta kaynaklı xenograft tümörler. Ölçek çubuğu, 50 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. geçici vasküler geçirgenliği görselleştirme. Tmem 155 kDa dekstran-TMR (kırmızı) ekstravazasyon ve tümör hücre intravazasyonunda (A) intravital mikroskopi (IVM) time-lapse (beyaz kutu). Dendra2 (yeşil, TC) ECFP makrofajların (mavi, E) ve blo ile etiketlenmiş tümör hücreleri155 kDa dekstran-TMR (kırmızı, BV) ile od gemiler. Kan damarı geçirgenlik siteleri (beyaz ok başı). (B) İzole 155 kDa dekstran-TMR kanalı. Kırmızı oklar dekstran ekstravazasyon (beyaz) işaretleyin. Ölçek çubuğu, 50 mikron. Film 1 time-lapse mikroskobu Film. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3. görselleştirme birden floresan etiketli dekstranlar. 155 kDa'lık bir dekstran-TMR (kırmızı) ve 10 kDa dekstran-FITC (yeşil) ekstravazasyonu farkının IVM hızlandırılmış. Makrofajlar ECFP (mavi) ve mavi (SHG) kolajen ile etiketlenmiş. damarsal kırmızı 155 kDa dekstran-TMR bindirme ve yeşil 10 kDa dekstran-FITC sarıdır. Yeşil 10 kDa dekstran-FITC tepe hızlı akmasını 6 dakika yer almaktadır. scale bar, 50 mikron. Film 2 time-lapse mikroskobu Film. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Zaman atlamalı IVM spontan geçici vasküler geçirgenliği görselleştirme Film 1. Dendra2 (MMTV icre / CAGCAT ile etiketlenmiş tümör hücreleri ile transgenik bir MMTV PyMT farede görsel geçici kan damarı geçirgenliğinin (Şekil 2'de görüldüğü gibi) zaman atlamalı mikroskopi -Dendra2 / MMTV PyMT) ve CFP (CSF1R -GAL4VP16 / UAS ECFP) ile etiketlenmiş makrofajlar. 155 kDa dekstran-TMR ekstravazasyon (sol panelde kırmızı, beyaz sağ panel) ekstravazasyon tümör kan damarının şube noktada görülmektedir. Pkira Bu videoyu görmek için buraya tıklayın. (Indirmek için sağ tıklatın.)
Zaman atlamalı IVM birden floresan etiketli dekstranlar ekstravazasyonunu görselleştirme Film 2. Transjenik bir 155 kDa dekstran TMR (kırmızı) ve 10 kDa dekstran-FITC (yeşil) ekstravazasyonu (Şekil 3'te görüldüğü gibi) zaman atlamalı mikroskopi CFP (CSF1R -GAL4VP16 / UAS-ECFP) ile etiketlenmiş makrofajlar ile MMTV PyMT fare. kollajen SHG mavi etiketli. Yeşil 10 kDa dekstran-FITC hızla extravasates ve kan damarları ve doku temizler ederken Kırmızı 155 kDa dekstran-TMR time-lapse süresince tümör damar kalır. Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız. (Indirmek için sağ tıklatın.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
tümör mikroçevresinde kendiliğinden meydana gelen hücresel etkileşimler, tümör hücre hareketliliği ve intravasation değişikliklere yol açabilir. Canlı tümör dokusunun yüksek çözünürlüklü intravital görüntüleme son derece geçici 10,13,24 olabilir çok hücreli dinamikleri görselleştirme izin verir. Tümörün mikro süreçlerin moleküler mekanizmaları hakkında gerekli bilgi verebilir ayrık zamanlı noktaları ile elde edilen in vivo deneylerde veya time-lapse görüntüleri uç noktası. Intravital görüntüleme çalışmaları ilaç tedavisi 25-30 anjiyogenez, tümör hücre göçü ve cevaba yeni anlayışlar üreten, birkaç gün içinde meydana gelen tümör mikro-süreçleri incelemek için kullanılmıştır. Ancak bu analizler nedeniyle süreçlerin zaman ölçeğine tümör mikroçevresinde geçici olayların kinetik yakalamak olmayabilir 7,31 çalışılmaktadır. sürekli süreçler birden fazla geçici olayları ayırt önemli bir reklamdırintravital mikroskopi en avantajlı.
Bu protokol açıklanan intravital görüntüleme tekniği birden fazla hücre soylarının ve yapıların floresan etiketleme tümör mikro-hücresel dinamikleri doğrudan görüntülenmesine olanak tanıyan. Multiphoton mikroskopi rutin 24 gerçekleştirilen 300 mikron derinlikleri ile tek foton konfokal mikroskopi üzerinde görüntüleme daha derin izin verir. 50 Z-yığınlarının kazanılması - 2 mikron adımlarla 100 mikron onlar tümör mikroçevresinde birbirlerine 13 ve vasküler yapıların doğru uzanan olarak hücreler yapmak çıkıntılar da dahil olmak üzere hücresel etkileşimlerin 3 boyutlu rekonstrüksiyon oluşturmak için yeterince yüksek çözünürlüğe sahiptir. Time-lapse görüntü dizilerinden Filmler ve 3D rekonstrüksiyon enjektabl boyalar, damar geçirgenliği floresan sinyal yoğunluğu değişiklikleri kullanarak, hücresel hareketlilik (hız ve yön) ölçülmesi için izin ve.
sp yakalamak içinontaneous hücresel olaylar tek sırayla yakalanmış olan bireysel görüntülerin sayısı olayın kinetik yakalar görüntü elde oranında izin vermek için optimize edilmiş olmalıdır, ama bu da sırasında herhangi bir bireysel olay yakalama olasılığını artırmak için yeterli fiziksel alanı kapsayan tek bir time-lapse dizisi. dikkate alınması gereken uzamsal görüntüleme parametreleri şunlardır; Z-yığınında dilim sayısı, elde edilen Z-yığınlar ve Z-yığını bireysel dilimler arasındaki eksenel mesafe ile görüş alanlarının sayısı. Bu nedenle, görüntü toplama başlamadan önce bu parametreleri ayarı protokolde kritik bir adımdır. multiphoton mikroskop kullanılarak, z-serisi 30 kare (500 mm x 500 mm) elde edilmesi yaklaşık 60 saniyedir. Gözlenen tümör hücre intravazasyonunda süresi intravazasyonunda 3D rekonstrüksiyon için çeşitli Z-yığınlarının yakalayan dakika 13 mertebesinde olabilir, çünkü bir Z-yığının alma süresi t sınırlı60 sn o. Bu nedenle, bir Z-yığın içerisine 30 dilim görünüşünün tek bir alan elde edildi. Hücrelerin 3D rekonstrüksiyon istenilen beri Dahası, Z-dilimleri arasındaki eksenel adım 2 mikron olarak belirlenmiştir. Bu 3D rekonstrüksiyon için izin vermek için hücre birimlerde yeterli bilgi sağlar. Bu parametreler, çalışılan canlı etkinlikleri kinetiğine göre kullanılan mikroskop ve görüntüleme yazılımının optimize edilmelidir.
mikroskop sahne ve kuyruk ven iv kateter lastik pedi modifikasyonu hem görüntüleme süresinde önemli bir artış sağladı. cam lamel üzerinde XY sürüklenme en aza indirirken lastik pedi formları iyi tümörün muhafaza hidrasyon için izin vermek. PBS verilmesi ile ısıtma odası kombinasyonu hidrasyonuna ve hayvanların fizyolojik sıcaklığı korur. vasküler perfüzyon ve kan akışını korumak kombine Bu koşullar tümör vas hücresel olayların uzun görüntüleme için izin vermek içinvasküler geçirgenlik ve tümör hücre intravasation içeren nçl.
Bu tekniğin bir sınırlaması, tümör mikro-hücreleri görselleştirmek için kullanılabilir floresan etiketler sayısıdır. Floresan proteini ihtiva eden ek hücre tipleri (örneğin, endotel hücreleri, fibroblastlar ve perisitler) transgenik fareler oluşturarak zor ve zaman alıcı olabilir. Bununla birlikte, gelecekteki muhtemel uygulamalar implante tümör hücreleri ve makrofajlar 70 kDa dekstran etiketi ile stromal hücre tiplerinin floresan protein etiketleme bir arada kullanılması olabilir. transgenik fareler, bu etiketleme stratejilerinin bir arada kullanarak ve geçerek hücresel etiketlerin yeni kombinasyonlar tümör mikro-hücresel hareketi ve olayları değerlendirmek için oluşturulabilir.
immünofloresan boyama dayalı son nokta deneyleri aksine, yüksek çözünürlüklü intravital mikroskopi spontan ve geçici görselleştirme izintümör mikroçevresinde olaylar. Burada açıklanan Intravital görüntüleme yöntemidir yeni olaylar ve statik görüntülerden deşifre edilemez tümör mikro hücresel etkileşimleri ortaya koymaktadır. etkileşim hücreleri türleri ve süreçleri ve bu olayların kinetikleri üzerinde yeni bilgileri ile hipotez bu etkileşimleri sürücü sinyal yollarını araştırmak için oluşturulabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu araştırma ödül sayısı (ASH, W81XWH-13-1-0010) kapsamında Savunma Bakanlığı Meme Kanseri Araştırma Programı, NIH CA100324, PPG CA100324 ve Entegre Görüntüleme Programı tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 155 kDa dextran-tetramethylrhodamine isothiocyanate | Sigma Aldrich | T1287 | reconstitute at 20 mg/ml in 1x PBS |
| 70 kDa dextran-Texas Red | Life Technologies | D-1830 | reconstitute at 10 mg/ml in 1x PBS |
| 10 kDa dextran-fluorescein isothyocyanate | Sigma Aldrich | FD10S | reconstitute at 20 mg/ml in 1x PBS |
| Qdot 705 ITK Amino (PEG) Quantum Dots | Life Technologies | Q21561MP | Dilute 25 μl in 175 μl of 1x PBS for injection |
| MMTV-PyMT mice | Jackson Laboratory | 2374 | |
| Csf1r-ECFP mice (Csf1r-Gal4/VP16,UAS-ECFP) | Jackson Laboratory | 26051 | |
| Csf1r-EGFP mice | Jackson Laboratory | 18549 | |
| 1x PBS | Life Technologies | ||
| Isoethesia (isoflurane) | Henry Schein Animal Health | 50033 | 250 ml |
| Oxygen | AirTech | ||
| 1 ml syringe, tuberculin slip tip | BD | 309659 | |
| 30 G x 1 (0.3 mm x 25 mm) needle | BD | 305128 | |
| Polyethylene micro medical tubing | Scientific Commodities Inc | BB31695-PE/1 | 0.28 mm I.D. x 0.64 mm O.D. |
| Microscope coverglass | Corning | 2980-225 | thickness 1.5, 22 x 50 mm |
| PhysioSuite MouseSTAT pulse oximeter, software and sensors | Kent Scientific | ||
| Laboratory tape | Fisher Scientific | 159015R | |
| soft rubber pad | McMaster-Carr | 8514K62 | Ultra-Soft Polyurethane Film, 3/16” Thick, 12" x 12", 40 Oo Durometer, Plain Back |
| hard rubber pad | McMaster-Carr | 8568K615 | High-Strength Neoprene Rubber Sheet 1/4" Thick, 12" x 12", 50 A Durometer |
| Microscope | Olympus | The microscope is a custom built two laser multiphoton microscope based on an Olympus IX-71 stand utilizing a 20X 1.05NA objective lens. | |
| 7-Punch set | McMaster-Carr | 3429A12 | 1/4" to 1" Hole Diameter, for Hammer-Driven Hole Punch |
References
- Gerlowski, L. E., Jain, R. K. Microvascular permeability of normal and neoplastic tissues. Microvasc Res. 31 (3), 288-305 (1986).
- Wang, H. -L., Lai, T. W. Optimization of Evans blue quantitation in limited rat tissue samples. Sci Rep. 4, (2014).
- Dvorak, H. F. Rous-Whipple Award Lecture. How tumors make bad blood vessels and stroma. Am J Pathol. 162 (6), 1747-1757 (2003).
- Nagy, J. A., et al. Permeability properties of tumor surrogate blood vessels induced by VEGF-A. Lab Invest. 86 (8), 767-780 (2006).
- Egawa, G., et al. Intravital analysis of vascular permeability in mice using two-photon microscopy. Sci Rep. 3, (2013).
- Yuan, F., et al. Vascular permeability in a human tumor xenograft: molecular size dependence and cutoff size. Cancer Res. 55 (17), 3752-3756 (1995).
- Dellian, M., Yuan, F., Trubetskoy, V. S., Torchilin, V. P., Jain, R. K. Vascular permeability in a human tumour xenograft: molecular charge dependence. Br J Cancer. 82 (9), 1513-1518 (2000).
- Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nat Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
- Entenberg, D., et al. Imaging tumor cell movement in vivo. Curr Protoc Cell Biol. Chapter. 19, (2013).
- Patsialou, A., et al. Intravital multiphoton imaging reveals multicellular streaming as a crucial component of in vivo. cell migration in human breast tumors. Intravital. 2 (2), e25294 (2013).
- Gligorijevic, B., Bergman, A., Condeelis, J. Multiparametric classification links tumor microenvironments with tumor cell phenotype. PLoS Biol. 12 (11), e1001995 (2014).
- Roussos, E. T., et al. Mena invasive (MenaINV) promotes multicellular streaming motility and transendothelial migration in a mouse model of breast cancer. J Cell Sci. 13, 2120-2131 (2011).
- Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA). Cancer Discov. 5 (9), 932-943 (2015).
- Robinson, B. D., et al. Tumor microenvironment of metastasis in human breast carcinoma: a potential prognostic marker linked to hematogenous dissemination. Clin Cancer Res. 15, 2433-2441 (2009).
- Sasmono, R. T., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
- Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. J Leukcocyte Biol. 83 (2), 430-433 (2008).
- Liu, H., et al. Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (42), 18115-18120 (2010).
- Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. J Vis Exp. (73), (2013).
- Weis, S., Cui, J., Barnes, L., Cheresh, D. Endothelial barrier disruption by VEGF-mediated Src activity potentiates tumor cell extravasation and metastasis. J Cell Biol. 167 (2), 223-229 (2004).
- Wyckoff, J., Gligorijevic, B., Entenberg, D., Segall, J., Condeelis, J.
- Lathia, J. D., et al. Direct in vivo. evidence for tumor propagation by glioblastoma cancer stem cells. PLoS One. 6 (9), e24807 (2011).
- Nakasone, E. S., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).
- Dreher, M. R., et al. Tumor vascular permeability, accumulation, and penetration of macromolecular drug carriers. J Natl Cancer Inst. 98 (5), 335-344 (2006).
- Wyckoff, J. B., et al. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Res. 67 (6), 2649-2656 (2007).
- Chittajallu, D. R., et al. In vivo. cell-cycle profiling in xenograft tumors by quantitative intravital microscopy. Nat Methods. 12 (6), 577-585 (2015).
- Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nat Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
- Yano, S., et al. Spatial-temporal FUCCI imaging of each cell in a tumor demonstrates locational dependence of cell cycle dynamics and chemoresponsiveness. Cell Cycle. 13 (13), 2110-2119 (2014).
- Yang, M., Jiang, P., Hoffman, R. M. Whole-body subcellular multicolor imaging of tumor-host interaction and drug response in real time. Cancer Res. 67 (11), 5195-5200 (2007).
- Manning, C. S., et al. Intravital imaging reveals conversion between distinct tumor vascular morphologies and localized vascular response to Sunitinib. Intravital. 2 (1), 24790 (2013).
- Alexander, S., Koehl, G. E., Hirschberg, M., Geissler, E. K., Friedl, P. Dynamic imaging of cancer growth and invasion: a modified skin-fold chamber model. Histochem Cell Biol. 130 (6), 1147-1154 (2008).
- Brown, E. B., et al. In vivo. measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy. Nat Med. 7 (7), 864-868 (2001).
