Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Multiphotonen - Mikroskopie ausgedehnte Zeitraffer-Bildgebung von mehrzelligen Interaktionen in Echtzeit durchzuführen, in vivo auf Einzelzellauflösung.
Introduction
Verbreitung von Tumorzellen von der primären Mammatumor wurde nicht nur Tumorzellen gezeigt einzubeziehen, aber Host stromalen Zellen, einschließlich Makrophagen und Endothelzellen. Darüber hinaus ist Tumorgefäße mit einer erhöhten Permeabilität 1 abnormal. Somit bestimmen, wie Tumorzellen, Makrophagen und endothelialen Zellen in Wechselwirkung treten Gefäßpermeabilität und Tumorzell intravasation in dem primären Tumor-Mikroumgebung zu vermitteln, ist wichtig für das Verständnis der Metastasierung. die Kinetik der vaskulären Permeabilität, Tumorzelle intravasation und dem darunterliegenden Signalisierungsmechanismus von mehrzelligen Interaktionen im Tumormikroumgebung zu verstehen, können wichtige Informationen bei der Entwicklung und Verabreichung von Antikrebstherapien bereitzustellen.
Die primäre Mittel der Tumor vaskuläre Permeabilität in vivo zu studieren die Messung von extravaskulärem Farbstoffe wie Evans - Blau 2, hochmolekulare Dextrane (155 kDa) wurde3 und Fluorophor oder Radiotracer-konjugierte Proteine (einschließlich Albumin) 4 in festen Zeitpunkten nach der Injektion des Farbstoffes. Fortschritte in der Mikroskopie, Tiermodelle und Fluoreszenzfarbstoffe haben die Visualisierung von zellulären Prozessen und vaskuläre Permeabilität in lebenden Tieren durch Intravitalmikroskopie 5 aktiviert.
Live - Tierbildgebung mit dem Erwerb von statischen Bildern oder kurzen Zeitraffer-Sequenzen über mehrere Zeitpunkte nicht für das Verständnis von dynamischen Ereignissen im Tumormikromilieu 6,7 erlauben. Tatsächlich statische Bildaufnahme über den Verlauf von 24 Stunden gezeigt , dass Tumorgefäße undicht jedoch die Dynamik der vaskulären Permeabilität wurde 6 nicht beobachtet. So fängt längere kontinuierliche Zeitraffer-Bildgebung bis zu 12 Stunden, um die Kinetik der dynamischen Ereignissen im Tumormikromilieu.
Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von erweiterten Zeitraffer multiphotauf Intravitalmikroskopie dynamische vielzelligen Ereignisse in der Tumor-Mikroumgebung zu studieren. Mehrere Zelltypen in der Tumor-Mikroumgebung mit injizierbaren Farbstoffen markiert oder mit transgenen Tieren exprimieren fluoreszierende Proteine verwenden. einen Schwanzvenenkatheter Gefäß Farbstoffe oder Proteine verwendet, kann nach dem Start der Bildgebung injiziert werden kinetischen Daten von mehrzelligen Ereignisse im Tumormikromilieu zu erwerben. Für Live-Cell-Imaging wird die Brusttumor durch die chirurgische Vorbereitung einer Hautlappen ausgesetzt. Bilder werden für bis zu 12 Stunden erworben 8 eine Multiphotonen - Mikroskop ausgestattet mit mehreren Photovervielfacherröhren (PMT) Detektoren. Durch die Verwendung von geeigneten Filtern ermöglicht eine Subtraktion Algorithmus 4 PMT Detektoren 5 Fluoreszenzsignale im Tumormikromilieu zu erwerben gleichzeitig 9. Hochauflösende Multiintravitalmikroskopie erfasst einzelne Zelle auflösende Bildgebung von Tumor-Stroma-Interaktionen im Tumormikromilieu, zu einem besseren führenden uERSTÄNDIGUNG der vaskulären Permeabilität und Tumorzell intravasation 10-13. Insbesondere offenbart verlängerte intravitalAbbildungs stark lokalisierten, transient Gefäßpermeabilität Ereignisse , die selektiv an den Stellen der Interaktion zwischen einer Tumorzelle, einem Makrophagen und einer Endothelzelle (definiert als der Tumor - Mikroumgebung der Metastasierung, TMEM 14) 13 auftreten. Weiterhin tritt Tumorzelle intravasation nur an TMEM und räumlich und zeitlich mit Gefäßpermeabilität 13 korreliert. Einzelne Zell Auflösung der Dynamik dieser Ereignisse wurde möglich durch die Verwendung erweiterter Zeitraffer-Multiphotonen-Mikroskopie von fluoreszenzmarkierten Zellen im Tumormikromilieu.
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Protocol
Alle beschriebenen Verfahren müssen mit den Richtlinien und Vorschriften für den Einsatz von Wirbeltieren, einschließlich der vorherigen Zustimmung des Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care und Use Committee entsprechend durchgeführt werden.
1. Erstellen von fluoreszenzmarkierten Tumoren und Tumor-assoziierten Makrophagen
- Generieren Sie fluoreszenzmarkierten Tumorzellen durch die spontane, autochthonen, gentechnisch veränderte Maus Brustkrebsmodell Kreuzung , wo die Maus - Mammatumorvirus long terminal repeat den Polyoma Mitte - T - Antigen (MMTV-PyMT) mit transgenen Mäusen mit fluoreszierenden Reporter - Laufwerke [dh Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP), verbesserte cyan fluoreszierende Protein (ECFP) oder Dendra2] 8,9.
- Fluoreszenz Etikett Makrophagen in PyMT Tiere mit fluoreszenzTumorZellen gekennzeichnet durch mit myeloid- und Makrophagen spezifischen fluoreszierenden Reporter gentechnisch veränderter Mausmodelle Kreuzung [dh MacGreen 15 oder MacBlue Mäuse CSF1R -GAL4VP16 / UAS-ECFP 16].
- Alternativ erzeugen fluoreszenz Tumoren durch orthotope Transplantation von fluoreszenzmarkierten PyMT Tumorzellen (syngene), humane Brustkrebszelllinien oder primären humanen Patienten stammt Tumoren (Xenotransplantate) 11,17 bezeichnet.
- Implantat fluoreszenz PyMT Tumorzellen in syngene Mäuse , die mit fluoreszierendem Protein-markiertem myeloischen Zellen markiert Tiere mit fluoreszierend markierten Tumorzellen und myeloiden Zellen 13 zu erzeugen.
- Injizieren von 100 & mgr; l von 10 mg / kg fluoreszierendes 70 kDa Dextran durch intravenöse (iv) Schwanzvene in severe combined immunodeficiency (SCID) -Mäusen mit Xenotransplantattumoren von menschlichen Zelllinien oder Patienten stammenden primären Tumoren fluoreszenz Etikett Makrophagen 2 h vor Beginn von intravital Bildgebung.
2. Mikroskopaufbau und Imaging Vorbereitung
Hinweis: Dieses Verfahren beschreibt den Aufbaufür intravital Bildgebung auf einem Multi Mikroskop 8.
- Schalten Sie alle Mikroskop und Laser-Komponenten, einschließlich Zwei-Photonen-Laser und Detektoren.
- Schalten Sie den Heizkasten auf 30 ° C auf die Bühne Vorwärmung. Dieser Schritt ist entscheidend für die physiologische Temperatur des Tieres gehalten wird.
- Für den Einsatz auf einem inversen Mikroskop Ort der maßgefertigte Tischeinsatz auf dem Mikroskoptisch. Der Brauch Einsatz ist ein Blatt von 1/8 "dicken Aluminium gefräst in der Tischeinlage Raum zu passen und mit einem Durchmesser von 1" Durchgangsloch in der Mitte für die Bildgebung.
- Wischen Sie den Mikroskoptisch und Tischeinsatz mit 70% Ethanol und Luft trocknen lassen.
- Platzieren Sie einen großen Tropfen Wasser auf dem 20X, 1,05 NA Mikroskopobjektiv optischen Kontakt mit dem Deckglas zu halten.
- Platz Deckglas (# 1.5 Dicke) über den Imaging-Port auf dem Mikroskoptisch Einsatz. Sichern Sie an Ort und Stelle mit Labor Band.
- Verwenden Sie einen Locher eine 2 cm x 2 cm großes Loch zu stanzenin einer flexiblen Gummiauflage und legen Sie die Gummiauflage auf dem Mikroskoptisch mit dem Loch in der Unterlage mit dem Loch in der benutzerdefinierten Stufe Einsatz ausgerichtet ist.
3. Herstellung von Schwanzvenenkatheter und Reagenzien für die Injektion während der Bildgebung
- Schneiden Sie ein 30 cm Länge von Polyethylen (PE) Rohr.
- Mit einer Pinzette, bewegen Sie die Metallnadel einer 31 G-Nadel hin und her, bis er aus der Kunststoff-Fittings bricht.
- Mit einer Pinzette, legen Sie das stumpfe Ende der abgelösten Nadel in den PE-Schlauch.
- Legen Sie eine 31 G-Nadel in das andere Ende des PE-Schlauch.
- Füllen Sie eine 1-ml-Spritze mit steriler phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und legen Sie sie in den 31 G-Nadel und spülen Sie alle Luft aus dem Schlauch und Nadel mit PBS. PBS für die Aufrechterhaltung der Hydratation verwendet wird und Blut Osmolarität 9,18 jedoch isotonischer Kochsalzlösung kann auch verwendet werden.
- Füllen Sie eine 1-ml-Spritze mit 200 ul 3 mg / kg 155 kDa Dextran-Tetramethylrhodamin (TMR) Oder Quantenpunkte für die vaskuläre Kennzeichnung.
- Bereiten andere injizierbare Proteine wie beispielsweise eine 165 Aminosäure - Isoform des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors A (VEGFA 165) in einer 1 cc Spritze und auf Eis stellen . Injizieren von 0,2 mg / kg VEGFA 165 19 bei einer Konzentration von 0,05 mg / ml.
4. Einsetzen des Verweil Schwanz Venenkatheter
- Legen Sie das Tier unter Narkose unter Verwendung eines Induktionskammer mit 5% Isofluran mit O 2 als Trägergas.
- Übertragen Sie die Maus auf die chirurgische Plattform, sobald es vollständig betäubt und reagiert nicht auf einer Zehe Prise.
- Offene Isoflurananästhesie Linie auf die chirurgische Plattform, schließen Sie die Anästhesie Leitung an die Induktionskammer und legen Sie den Nasenkegel über das Tier Schnauze. Reduzieren Sie die Isofluran von 5% auf 2,5%.
- Anwenden Augensalbe für die Augen der Maus Trockenheit während der Anästhesie zu verhindern.
- Erhitzen Sie das Tier unter der Heizlampefür weitere 2 min Zirkulation in den Schwanz zu erhöhen, wie verlangsamt Zirkulation mit tiefer Narkose.
- Sterilisieren Sie die Maus Schwanzvene mit 70% Ethanol.
- Legen Sie die Spitze des 31 G-Nadel aus dem in Abschnitt 3 in die seitliche Schwanzvene des Tieres konstruiert Katheter und drücken Sie die Nadel in 2-3 mm.
- Ziehen Sie die Spritze Blut zu sehen, zurück, um den Katheter gewährleistet in die Schwanzvene gelegt wird.
- Verwenden, um eine 1 cm Länge lab Band über der Nadel angeordnet, um die Nadel an Ort und Stelle parallel zu der Vene entlang der Länge des Schwanzes zu halten.
5. Hautlappen chirurgischen Eingriff Expose die Brusttumor
- Mit dem Tier auf der chirurgischen Plattform Tupfer des Tumors und der ventralen Oberfläche mit 70% Ethanol. Anmerkung: Wie beschrieben, ist dieses Verfahren nicht vollständig aseptischen Bedingungen durchgeführt. Für lange Imaging-Sitzungen, wo Infektion ein Störfaktor werden kann, wird empfohlen, eine aseptische Technik zu verwenden.
- Mit sterile Zange, heben Sie die Bauchhaut und mit einer sterilen Schere eine subkutane Schnitt entlang der ventralen Mittellinie ca. 1 cm Länge. Vermeiden Sie das Peritoneum während der Einschnitt Punktierung.
- Vorsichtig schneiden das Bindegewebe der Brustdrüse und Tumor entfernt vom Peritoneum Anbringen der Brusttumor zu belichten.
- Mit einer Schere und Pinzette vorsichtig entfernen und die Faszien und Fett von der freiliegenden Oberfläche des Tumors unter Beibehaltung der Integrität der Gefäßversorgung des Tumors und die Minimierung von Blutungen wegschneiden. Dieser Schritt ist entscheidend, um die Tumor-Architektur und Gefäßversorgung des Tumors zu halten.
6. Vorbereitung der Tiere für die Mikroskopie
- Übertragen Sie das Tier auf die vorgewärmten Abbildungsstufe mit dem auf dem Deckglas platziert ausgesetzt Tumor auf der Bühne Einsatz über das Mikroskopobjektiv für die Bildgebung. Achten Sie darauf, die Schwanzvene Katheter sanft mit dem Tier zu übertragen, um nicht die Nadel zu entfernen.
- Platz the Anästhesie Bugspitze über die Schnauze des Tieres Anästhesie Satz auf 3% Isofluran aufrecht zu erhalten.
- Positionieren Sie das Tier so, dass der Tumor in das Loch des Gummikissen ruht und in Kontakt mit dem Deckglas.
- Verwenden Sie zwei Gummi-Pads, um sanft den Tumor in Position zu halten und fixieren Sie diese mit Labor Band an den Mikroskoptisch Bewegung während der Bildaufnahme zu reduzieren.
- Füllen der Kammer aus dem Gummikissen mit PBS, das Gewebe zu halten hydratisiert und optischem Kontakt mit dem Deckglas erhalten.
- Starten Sie das Tier die Überwachung der Vitalfunktionen mit einem Pulsoximeter Sonde. Bringen Sie einen Clip Sensor an den Oberschenkel des Tieres. Alternativ kann eine Manschette, die verwendet werden, um den Hals zu passen kann konfiguriert ist.
- Legen Sie die Heizkasten über das Tier zu halten bei 30 ° C 20.
- reduzieren Sie langsam das Niveau von Isofluran auf 0,5-1% Narkose zu halten und den Blutfluss aufrechtzuerhalten.
7. Bildaufnahme und Injektion von Fluorescent Farbstoffe und injizierbare Proteine
- Verwendung des Mikroskop-Okular Fokus auf den fluoreszierenden Tumorzellen auf der Oberfläche des Tumors.
- Wählen Sie einen Bereich von Interesse durch Bereiche mit fließenden Blutgefäße zu finden. Die Auswahl eines Bereichs von Interesse mit fließenden Blutgefäße ist entscheidend für die Tumorgefäße zu bewerten.
- Sobald eine Region von Interesse ausgewählt wurde Schalten Sie das Mikroskop in Multibildgebungsmodus.
- Den oberen und unteren Grenzen einer z-Serie. Stellen Sie die obere Grenze der z-Serie durch die Schärfeneinstellvorrichtung mit dem Ziel auf den gewünschten Startposition zu bewegen und auf die Z-Position "Oben" Taste. Bestimmen die Obergrenze der z-Reihe durch die Kollagenfaser-Netzwerk an der Oberfläche des Tumors in der Erzeugung der zweiten Harmonischen (SHG) -Kanal Visualisierung und Beobachtung, wenn keine Zellen, aber nur Kollagenfasern sichtbar sind.
- Stellen Sie die Untergrenze der z-Reihe durch das Ziel auf den gewünschten Abbildungstiefe bewegt (typically 50-150 & mgr; m) und dann auf die Z-Position "Unten" -Taste.
- Stellen Sie die Schrittgröße um den gewünschten Wert in die Schrittgröße Feld eingeben. Bestimmen Schrittgröße basierend auf Überlegungen zur Auflösung und Aufnahmezeit (in der Regel 2 & mgr; m für die hochauflösende 3D-Rekonstruktion verwendet und 5 um auf andere Weise).
- Stellen Sie den Zeitraffer-Intervall auf die Time-Lapse-Panel durch Umschalten und Eingabe der gewünschten Ablaufzeit in die Time-Lapse-Feld. Für eine optimale zeitliche Auflösung das Zeitintervall für die kontinuierliche Bildgebung auf 0 sec. Hinweis: Für lange Zeitraffer-Bildgebung ist es empfehlenswert, das Zeitintervall zwischen den Aufnahmen zu 10 Sekunden bis zum Ziel gesetzt, Tauchflüssigkeit aufzufüllen.
- Nachdem die Parameter für die Abbildung bestimmt worden sind, injizieren langsam 155 kDa-Dextran-TMR.
- Entfernen Sie die Spritze mit PBS in die Schwanzvene Katheter und ersetzen mit der Spritze, die 155 kDa Dextran-TMR kümmert sich keine Blasen in den li vorstellenne.
- injizieren Sie langsam 155 kDa Dextran-TMR in die Maus, mit einem maximalen Volumen von 200 & mgr; l, und ersetzen Sie die Spritze mit der Spritze PBS enthält. Kritischste Schritt: Führen Sie die Injektion langsam und Vorkehrungen treffen, um zu vermeiden Lösung außerhalb der Vene zu bekommen.
- Starten Sie den Erwerb der Z-Stack-Zeitraffer-Bildgebung durch einen Klick auf den Z-Stapel und Zeitraffer-Tasten, sie zu drücken und dann auf die Aufnahmetaste klicken.
- Wenn andere fluoreszierende Dextrane, dh 10 kDa - Dextran-Fluorescein - Isothiocyanat (FITC), oder Proteine, dh VEGFA 165 haben im Voraus vorbereitet worden ist , injizieren sie nach dem Beginn der Bildaufnahme für at = 0 min Start.
- Entfernen Sie die Spritze mit PBS in die Schwanzvene Katheter und ersetzen mit der Spritze , die 10 kDa Dextran-FITC oder VEGFA 165 kümmert sich keine Blasen in die Leitung einzuführen.
- injizieren Sie langsam injizierbaren in die Maus über die Schwanzvene Katheterund ersetzen Sie die Spritze mit einer Spritze mit PBS.
- Alle 30-45 min, injizieren langsam 50 ul PBS oder Kochsalzlösung Hydratation des Tieres zu halten.
8. Euthanasie
- Bei Beendigung der Bildaufnahme, euthanize das Tier.
- Erhöhen Sie die Isofluran bis 5%.
- Halten Sie das Tier unter 5% Isofluran bis 30 Sekunden, nachdem er aufhört, das Tier von der Bühne zu atmen und zu entfernen.
- Führen Sie Zervikaldislokation vollständige Euthanasie zu gewährleisten.
9. Bildverarbeitung
- Erwerben Sie Bilder in 16-Bit-TIFF-Dateien für jeden einzelnen Kanal zu jedem Zeitpunkt und sparen nacheinander.
- Führen Trennung der spektralen Überlappung (dh GFP und GFP), die Abschaffung der xy Drift und die Erzeugung von Filmen von Zeitraffer-Sequenzen unter Verwendung von etablierten Verfahren in ImageJ 9. Führen Sie 3D - Oberflächenrekonstruktionen von hochauflösenden Bildern 13.
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Representative Results
Erweiterte Zeitraffer-Mikroskopie ermöglicht einzelne intravital Zellauflösende Bildgebung von mehrzelligen Prozesse im Tumormikromilieu. Durch fluoreszenz Markierung von Tumorzellen, Makrophagen, den vaskulären Raum und Visualisieren des Kollagenfasernetzwerk der zweiten Harmonischen Erzeugungssignal, mehrere Kompartimente in der Tumor-Mikroumgebung verwendet werden gleichzeitig während der Bildgebung verfolgt. Tumorzellen mit fluoreszierenden Proteinen markiert können in transgenen Mäusen erzeugt werden , wie in MMTV-PyMT-Dendra2 Mäusen mit Brusttumorzellen , markiert mit Dendra2 (1A) durchgeführt worden ist . Durch die Kreuzung dieser transgenen Mäuse mit CSF1R -GAL4VP16 / UAS-ECFP Mäuse, die Makrophagen , markiert mit ECFP, beide Tumorzellen und Makrophagen haben , werden in den MMTV-PyMT Mäusen markiert. Mit dem Doppelmarkierungsstrategie von Tumorzellen und Makrophagen, die die direkte Interaktion der beiden Zelltypen können in Echtzeit (Figur 1A sichtbar gemacht werden). Zusätzlich mit GFP transduziert menschlichen Brustkrebszelllinien oder Patienten stammende Tumorzellen kann zur Markierung von Tumorzellen verwendet werden. Makrophagen können etikettierenden fluoreszierend markiertes Dextran unter Verwendung von 70 kDa , die in den phagozytierenden Makrophagen akkumuliert (1B). Diese Methoden haben die Untersuchung von dynamischen vielzelligen Ereignisse wie Tumorzellen-Makrophagen-streaming Motilität, vaskulären Permeabilität und Tumorzell intravasation gefördert. Zu visualisieren Veränderungen in Tumorgefäßdurchlässigkeit, ein fluoreszierend markiertes Dextran mit hohem Molekulargewicht (155 kDa oder höher empfohlen 9,13,21,22) oder Quantenpunkten verwendet , um den vaskulären Raum zu etikettieren (Abbildung 1). 155 kDa Dextran oder Quantenpunkte sind groß genug , dass sie nicht ohne weiteres durch die interendothelialen Räume 23 diffundieren.
Kontinuierliche hochauflösende Bildgebung erleichtert die Erfassung von vaskulären Permeabilität Ereignisse und dieQuantifizierung der Kinetik von Dextran Extravasation und Clearance bei TMEM (Abbildung 2 und Film 1). Da der Gefäßraum leicht durch das 155 kDa - Dextran bei der Einleitung der Zeitraffersequenz (wie in 0 'von Figur 2) extravasalen fluoreszierenden Dextran definiert ist , kann in jedem Rahmen des Zeitablaufsequenz quantifiziert werden, Fig . 2 und Film 1 zeigen die Extravasation von 155 kDa Dextran-TMR durch eine Schwanzvene Katheter in ein MMTV-PyMT-Dendra2 injiziert; CSF1R-GFP - Maus. Dendra2-markierten Tumorzellen (grün) und GFP-markierten Makrophagen (Cyan) verwendet TMEM in lebenden Tieren zu identifizieren. Der TMEM Struktur an der Stelle der vaskulären Permeabilität in einem weißen Feld skizziert. Der Gefäßraum ist mit 155 kDa Dextran-TMR (rot) markiert sichtbar zu machen Gefäße und Extravasation von Gefäßinhalte bei Veranstaltungen der vaskulären Permeabilität fließt. Die Spitze von 155 kDa Dextran-TMR Extravasationin Abbildung 2 ist zwischen 29 'und 34' gesehen. Extravasalen Dextran ist an der weißen Pfeilspitze in den oberen Platten und an der roten Pfeilspitze in den unteren Platten, gesehen nur den Kanal des 155 kDa-Dextran-TMR zeigt. Die 155 kDa Dextran-TMR löscht aus dem Gewebe und wird als eine Abnahme der extravaskulärem TMR Signal gesehen , wie in Abbildung 2 bei 97 'gesehen. Nach dem Übersetzen der Zeitraffer-Sequenz in ImageJ extravaskulärem Dextran quantifiziert.
Neben spontanen Ereignissen in der Tumor-Mikroumgebung zu beobachten, ist es wichtig, die zugrundeliegenden molekularen Mechanismus der identifizierten Phänomene zu untersuchen. Injizieren zusätzliche vaskuläre Farbstoffe oder Proteine Gefäßpermeabilität zu induzieren können Einblick in die Signalisierungsereignisse liefern Gefäßpermeabilität Regulieren dar. 3 zeigt den Unterschied in der Extravasation von 10 kDa - Dextran-FITC (grün) und 155 kDa - Dextran-TMR (rot).Mit hohem Molekulargewicht 155 kDa Dextran-TMR wird unmittelbar vor Beginn der Zeitraffer-Bildgebung verabreicht. Fünf Z-Stapel werden im Zeitraffer-Sequenz erworben eine Basislinie zu setzen, bevor 10 kDa Dextran-FITC injiziert wird. Nach dem Erwerb des 5. Z-Stack die 10 kDa Dextran-FITC durch die Schwanzvene Katheter ohne Unterbrechung Bildaufnahme verabreicht wird. Das Dextran-FITC wird das Gefäßsystem mit sofortiger Extravasation gesehen eintritt , während das 155 kDa Dextran-TMR auf den vaskulären Raum beschränkt bleibt (Abbildung 3, 0 'und 6'). Das 10 kDa - Dextran-FITC Extravasate vollständig aus dem Blutgefäß und löscht aus dem Gewebe des 155 kDa - Dextran-TMR in dem Blutgefäß (Abbildung 3 , wie gesehen bei 56 'und Film 2) zu verlassen. Mit einem Zeitpunkt von vor der Injektion, die Kinetik von 10 kDa Dextran-FITC Extravasation leicht im Vergleich zu 155 kDa Dextran-TMR 13 werden kann. Die unmittelbare Extravasation von 10 kDa dextran-FITC nach Injektion signifikant unterschiedlich von der Retention von 155 kDa - Dextran-TMR in das Gefäßsystem und die spontane Gefäßpermeabilität Ereignisse 13. Weitere experimentelle Kontrollen können vaskuläre Permeabilität durch die mechanische Zerstörung des Endothels oder durch VEGFA 165 vermittelter Permeabilität 13 durchgeführt werden , einschließlich Induktion. Die Kinetik der Extravasation von 155 kDa-Dextran-TMR spontaner Permeabilität Ereignisse können zu 10 kDa Dextran verglichen werden, und andere Mittel der vaskulären Permeabilität induzieren die Ereignisse und Signale in Gefäßpermeabilität Ereignisse in der Tumor-Mikroumgebung beteiligt sind, zu verstehen.
Abbildung 1. Strategien für die Zellen und die Gefäße im Tumormikromilieu Beschriftung. (A) Transgene MMTV-PyMT Maus mit Tumorzellen markiert mit Dendra2 (MMTV-ICRE / CAGCAT-Dendra2 / MMTV-PyMT) und markierten Makrophagen , die mit GFP (CSF1R -GAL4VP16 / UAS-ECFP). Tumorgefäße mit 155 kDa Dextran-TMR durch Schwanzvenenkatheter verabreicht markiert. (B) TN1-GFP - Patienten stamm Xenotransplantattumoren mit markierten Makrophagen mit 70 kDa Dextran-Texas - Rot und markierte Gefäße mit Quantenpunkten den Schwanz Venenkatheter verwendet wird . Maßstabsbalken, 50 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Visualizing vorübergehende vaskulären Permeabilität. (A) Intravitalmikroskopie (IVM) Zeitraffer von 155 kDa Dextran-TMR (rot) Extravasation und Tumorzelle intravasation bei TMEM (weißer Kasten). Die Tumorzellen markiert mit Dendra2 (grün, TC), Makrophagen mit ECFP (Cyan, M) und blood Schiffe mit 155 kDa Dextran-TMR (rot, BV). Blutgefäßdurchlässigkeit Stellen (weißer Pfeil). (B) Isolierte 155 kDa Dextran-TMR - Kanal. Rote Pfeile markieren Dextran Extravasation (weiß). Maßstabsbalken, 50 & mgr; m. Film von Zeitraffer-Mikroskopie in Film 1. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Visualizing mehrere fluoreszenzmarkierte Dextrane. IVM Zeitraffer der Unterschied in Extravasation von 155 kDa Dextran-TMR (rot) und 10 kDa Dextran-FITC (grün). Makrophagen sind mit ECFP (cyan) und Kollagen in blau (SHG) markiert. Die Überlagerung der roten 155 kDa Dextran-TMR und grün 10 kDa Dextran-FITC in den Gefäßen ist gelb. Schnelle Extravasation von grün 10 kDa Dextran-FITC Spitze ist 6 min. Scale Bar, 50 & mgr; m. Film von Zeitraffer-Mikroskopie in Movie 2. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Film 1. Visualizing spontane vorübergehende Gefäßpermeabilität mit Zeitraffer IVM. Zeitraffer-Mikroskopie von transienten Blutgefäßdurchlässigkeit in einer transgenen MMTV-PyMT Maus mit Tumorzellen , markiert mit Dendra2 (MMTV-ICRE / CAGCAT sichtbar gemacht (wie in Abbildung 2 zu sehen) -Dendra2 / MMTV-PyMT) und Makrophagen , markiert mit GFP (CSF1R -GAL4VP16 / UAS-ECFP). Extravasation von 155 kDa Dextran-TMR Extravasation (rot im linken Bereich, weiß rechts) ist an der Verzweigungsstelle des Tumorblutgefäße beobachtet. Pleasen hier klicken um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum Download bereit.)
Film 2. Visualizing Extravasation von mehreren fluoreszierend markierten Dextranen durch Zeitraffer IVM. Zeitraffer-Mikroskopie von Extravasation von 155 kDa Dextran-TMR (rot) und 10 kDa Dextran-FITC (grün) in einem transgenen (wie in Abbildung 3 zu sehen) MMTV-PyMT Maus mit markierten Makrophagen , die mit GFP (CSF1R -GAL4VP16 / UAS-ECFP). SHG von Kollagen ist blau markiert. Red 155 kDa Dextran-TMR bleibt in der Gefäßversorgung des Tumors für die Dauer der Zeitraffer , während die grüne 10 kDa Dextran-FITC schnell Extravasate und löscht aus den Blutgefäßen und Gewebe. Bitte hier klicken , um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum Download bereit .)
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Discussion
Zelluläre Interaktionen, die sich spontan in der Tumor-Mikroumgebung auftreten können, auf Veränderungen in der Tumorzellbeweglichkeit und intravasation führen. Hochauflösende intravital Bildgebung von lebenden Tumorgewebe ermöglicht die Visualisierung von mehrzelligen Dynamik , die hochtransienten 10,13,24 sein kann. End-Punkt in - vivo - Tests oder Zeitraffer-Bilder mit diskreten Zeitpunkten erworben wesentlichen Informationen über die molekularen Mechanismen von Prozessen in der Tumor - Mikroumgebung zur Verfügung stellen kann. Intravital Imaging - Studien wurden zu untersuchen Prozesse im Tumormikromilieu verwendet , die über mehrere Tage stattfinden, die Generierung neuer Erkenntnisse auf die Angiogenese, Tumorzellmigration und das Ansprechen auf medikamentöse Behandlung 25-30. Allerdings könnten diese Assays nicht die Kinetik der transiente Ereignisse in der Tumor - Mikroumgebung erfassen aufgrund der Zeitskala der Prozesse 7,31 untersucht. mehrere transiente Ereignisse von konstanten Prozesse Erkennungsmerkmal ist eine bedeutende AnzeigeVorteil der Intravitalmikroskopie.
Die intravitalAbbildungsTechnik in diesem Protokoll beschrieben ermöglicht die direkte Sichtbarmachung zellulärer Dynamik im Tumormikroumgebung durch Fluoreszenzmarkierung von mehreren Zelllinien und Strukturen. Multiphotonenmikroskopie ermöglicht eine größere Tiefe der Bildgebung über Einzelphotonen konfokaler Mikroskopie mit einer Tiefe von 300 um routinemäßig 24 durchgeführt. Erwerb von Z-Stapeln von 50 bis 100 & mgr; m mit 2 & mgr; m Schritten ist von ausreichend hoher Auflösung 3D - Rekonstruktion von zellulären Interaktionen zu erzeugen, einschließlich Vorsprünge , die Zellen machen , wie sie aufeinander zu 13 und Gefäßstrukturen in der Tumor - Mikroumgebung erweitern. Filme und 3D-Rekonstruktionen von Zeitrafferbildsequenzen ermöglichen die Quantifizierung der zellulären Motilität (Geschwindigkeit und Richtungsabhängigkeit), und Veränderungen in der Fluoreszenzsignalintensität von injizierbaren Farbstoffen, Gefäßdurchlässigkeit.
Um sp zu erfassenontaneous zelluläre Ereignisse die Anzahl der einzelnen Bilder in einer einzigen Sequenz erfasst muss für eine Rate der Bildaufnahme zu ermöglichen, optimiert werden, dass die Kinetik des Ereignisses erfasst, aber das gilt auch für eine ausreichende physische Raum, um die Wahrscheinlichkeit der Erfassung jedes einzelnen Ereignisses zu erhöhen während eine einzige Zeitraffersequenz. Die räumlichen Bildparameter, die berücksichtigt werden müssen, gehören; die Anzahl der Scheiben in einer Z-Stapel, die Anzahl der Sichtfelder mit Z-Stapel erfaßt und der axiale Abstand zwischen den einzelnen Scheiben in einer Z-Stapel. Daher Einstellung dieser Parameter vor der Bildaufnahme beginnt, ist ein wichtiger Schritt im Protokoll. Mit dem Multi Mikroskop, den Erwerb von 30 Frames (500 & mgr; m × 500 & mgr; m) in einer z-Serie beträgt ca. 60 sec. Da die Dauer von intravasation beobachteten Tumorzelle in der Größenordnung von Minuten 13 sein kann, mehrere Z-Stacks für die 3D - Rekonstruktion von intravasation Erfassung wurde die Akquisitionszeit eines Z-Stack begrenzt to 60 Sek. eine einzelne Sichtfeld daher mit bis zu 30 Scheiben in eine Z-Stapel wurde erworben. Darüber hinaus wurde seit 3D-Rekonstruktion von Zellen der axialen Stufe zwischen Z-Scheiben gewünscht, wurde auf 2 & mgr; m eingestellt. Dies ermöglicht eine ausreichende Informationen über Zellvolumina für die 3D-Rekonstruktion zu ermöglichen. Diese Parameter müssen für jedes Mikroskop und Bildbearbeitungssoftware basierend auf der Kinetik der Live-Veranstaltungen genutzt optimiert werden untersucht.
Die Modifizierung des Gummikissens auf dem Mikroskoptisch und die Schwanzvene iv Katheter haben sowohl für eine signifikante Erhöhung der Abbildungszeit erlaubt. Die Gummiunterlage bildet eine gut aufrechterhalten Hydratation des Tumors zu ermöglichen, während XY Drift auf dem Deckglas minimieren. Die Kombination der Heizkammer mit der Verabreichung von PBS hält Hydratation und physiologischer Temperatur von Tieren. Diese Bedingungen kombiniert Gefäßperfusion halten und die Durchblutung für erweiterte Bildgebung von zellulären Ereignissen ermöglichen an den Tumor vasculature einschließlich vaskuläre Permeabilität und Tumorzelle intravasation.
Eine Einschränkung dieser Technik ist die Anzahl der fluoreszierenden Markierungen, die verwendet werden können, Zellen in der Tumor-Mikroumgebung zu visualisieren. Transgene Mäuse zu erzeugen mit zusätzlichen Zelltypen (dh, Endothelzellen, Fibroblasten oder Perizyten) fluoreszierendes Protein enthält , kann schwierig und zeitraubend sein. Doch künftig mögliche Anwendungen könnte eine Kombination aus fluoreszierenden Protein Markierung von Stroma-Zelltypen mit implantierten Tumorzellen und 70 kDa Dextran Markierung von Makrophagen zu nutzen. Durch die Verwendung einer Kombination dieser Markierungsstrategien und der Kreuzung von transgenen Mäusen neue Kombinationen von zellulären Etiketten erzeugt werden, um zelluläre Bewegung und Ereignisse in der Tumor-Mikroumgebung zu bewerten.
Anders als Endpunkt Experimente basieren auf Immunfluoreszenzanfärbung ermöglicht hochauflösende Intravitalmikroskopie die Visualisierung von spontanen und transienteEreignisse im Tumormikromilieu. Die intravital Bildgebung hier beschriebene Verfahren zeigt neue Ereignisse und zellulären Interaktionen im Tumormikromilieu, die nicht von statischen Bildern entschlüsselt werden kann. Mit neuartigen Informationen zu den interagierenden Zellen Arten oder Prozessen, und die Kinetik dieser Ereignisse können Hypothesen generiert werden, um die Signalwege zu untersuchen, die diese Interaktionen fahren.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch das Department of Defense Breast Cancer Research Program unter Verleihungsnummer (ASH, W81XWH-13-1-0010), NIH CA100324, PPG CA100324 und dem Integrated Imaging-Programm unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 155 kDa dextran-tetramethylrhodamine isothiocyanate | Sigma Aldrich | T1287 | reconstitute at 20 mg/ml in 1x PBS |
| 70 kDa dextran-Texas Red | Life Technologies | D-1830 | reconstitute at 10 mg/ml in 1x PBS |
| 10 kDa dextran-fluorescein isothyocyanate | Sigma Aldrich | FD10S | reconstitute at 20 mg/ml in 1x PBS |
| Qdot 705 ITK Amino (PEG) Quantum Dots | Life Technologies | Q21561MP | Dilute 25 μl in 175 μl of 1x PBS for injection |
| MMTV-PyMT mice | Jackson Laboratory | 2374 | |
| Csf1r-ECFP mice (Csf1r-Gal4/VP16,UAS-ECFP) | Jackson Laboratory | 26051 | |
| Csf1r-EGFP mice | Jackson Laboratory | 18549 | |
| 1x PBS | Life Technologies | ||
| Isoethesia (isoflurane) | Henry Schein Animal Health | 50033 | 250 ml |
| Oxygen | AirTech | ||
| 1 ml syringe, tuberculin slip tip | BD | 309659 | |
| 30 G x 1 (0.3 mm x 25 mm) needle | BD | 305128 | |
| Polyethylene micro medical tubing | Scientific Commodities Inc | BB31695-PE/1 | 0.28 mm I.D. x 0.64 mm O.D. |
| Microscope coverglass | Corning | 2980-225 | thickness 1.5, 22 x 50 mm |
| PhysioSuite MouseSTAT pulse oximeter, software and sensors | Kent Scientific | ||
| Laboratory tape | Fisher Scientific | 159015R | |
| soft rubber pad | McMaster-Carr | 8514K62 | Ultra-Soft Polyurethane Film, 3/16” Thick, 12" x 12", 40 Oo Durometer, Plain Back |
| hard rubber pad | McMaster-Carr | 8568K615 | High-Strength Neoprene Rubber Sheet 1/4" Thick, 12" x 12", 50 A Durometer |
| Microscope | Olympus | The microscope is a custom built two laser multiphoton microscope based on an Olympus IX-71 stand utilizing a 20X 1.05NA objective lens. | |
| 7-Punch set | McMaster-Carr | 3429A12 | 1/4" to 1" Hole Diameter, for Hammer-Driven Hole Punch |
References
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