Summary
Detta protokoll beskriver användningen av multifotonmikroskop för att utföra förlängda tidsförlopp avbildning av flercelliga interaktioner i realtid, in vivo på en enda cell upplösning.
Introduction
Spridning av tumörceller från den primära brösttumör har visats involvera inte bara tumörceller, men värd stromala celler inkluderande makrofager och endotelceller. Dessutom är tumörvaskulatur onormalt med ökad permeabilitet en. Således är viktig för att förstå metastaser bestämma hur tumörceller, makrofager och endotelceller samverkar för att förmedla vaskulär permeabilitet och tumörcell intravasering i den primära tumören mikromiljö. Att förstå kinetiken för vaskulär permeabilitet, tumörcell intravasering och mekanismen för flercelliga interaktioner i tumören mikro underliggande signalering kan ge viktig information för att utveckla och administration av anti-cancerterapier.
Det primära sättet att studera tumör vaskulär permeabilitet in vivo har varit mätning av extravaskulära färgämnen som Evans blå 2, högmolekylära dextraner (155 kDa)3 och fluorofor eller radiotracer-konjugerad proteiner (inkluderande albumin) 4 vid fasta tidpunkter efter injektion av färgämnet. Framsteg inom mikroskopi, har djurmodeller och fluorescerande färgämnen möjlig visualisering av cellulära processer och vaskulär permeabilitet i levande djur genom intravital mikroskopi 5.
Levande djur avbildning med förvärvet av statiska bilder eller kort time-lapse-sekvenser under flera tidpunkter inte möjliggöra fullständig förståelse av dynamiska händelser i tumören mikro 6,7. Faktum är att statisk bildtagning under loppet av 24 timmar visade att tumörkärl är läckande, men dynamiken i vaskulär permeabilitet observerades inte sex. Således, förlängd kontinuerlig tidsförlopp avbildning upp till 12 timmar fångar kinetiken av dynamiska händelser i tumören mikromiljö.
Detta protokoll beskriver användningen av förlängda tidsförlopp multiphotpå intravital mikroskopi för att studera dynamiska flercelliga händelser i tumören mikromiljö. Flera celltyper i tumören mikro är märkta med injicerbara färgämnen eller genom att använda transgena djur som uttrycker fluorescerande proteiner. Med användning av en svansven kateter vaskulära färgämnen eller proteiner kan injiceras efter starten av bildbehandling för att förvärva kinetiska data av multicellulära händelser i tumörmikromiljön. För levande cell imaging brösttumör är exponerad genom den kirurgiska beredningen av en hud klaff. Bilder förvärvas för upp till 12 timmar med en multifotonmikroskop utrustad med flera fotomultiplikatorrör (PMT) detektorer 8. Genom att använda lämpliga filter, en subtraktion algoritm möjliggör 4 PMT detektorer för att förvärva 5 fluorescerande signaler i tumörens mikromiljö samtidigt 9. Högupplöst multifoton intravital mikroskopi fångar enda cell upplösning avbildning av tumör stroma interaktioner i tumören mikro, vilket leder till en bättre understanding av vaskulär permeabilitet och tumörcell intravasering 10-13. Specifikt förlängda intravital imaging avslöjade mycket lokal, övergående vaskulära permeabilitets-händelser som inträffar selektivt vid ställen för interaktion mellan en tumörcell, en makrofag och en endotelcell (definierad som tumörens mikro av Metastas, TMEM 14) 13. Dessutom sker tumörcell intravasering endast på TMEM och rumsligt och tidsmässigt korrelerade med vaskulär permeabilitet 13. Enda cell upplösning av dynamiken i dessa händelser möjliggjordes genom användning av förlängda tidsförlopp multifoton mikroskopi av fluorescerande celler i tumören mikromiljö.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden som beskrivs måste utföras i enlighet med de riktlinjer och regler för användning av ryggradsdjur, inklusive förhandsgodkännande av Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care och användning kommittén.
1. Generera fluorescerande Tumörer och tumörassocierade makrofager
- Generera fluorescensmärkta tumörceller genom att korsa den spontana, autoktona, gentekniskt mus bröstcancer modell där musbrösttumörvirus långa terminala upprepningen driver polyoma mitten-T-antigen (MMTV-pymt) med transgena möss med fluorescerande reportrar [dvs förbättrade grönt fluorescerande protein (EGFP), förstärkt cyan fluorescerande protein (ECFP) eller Dendra2] 8,9.
- Fluorescerande etikett makrofager i pymt djur med fluorescensmärkt tumörceller genom att korsa genetiskt modifierade musmodeller med myeloid- och macrophage- specifika fluorescerande reportrar [dvs MacGreen 15 eller MacBlue möss Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP 16].
- Alternativt genererar fluorescerande tumörer genom orthotopic transplantation av fluorescerande pymt tumörceller (syngena), humana bröstcancercellinjer eller primära human patient härledda tumörer (xenografter) 11,17.
- Implantatet fluorescerande pymt tumörceller i syngena möss med fluorescerande protein-märkta myeloidceller att generera djur med fluorescerande tumörceller och myeloidceller 13.
- Injicera 100 pl 10 mg / kg fluorescerande 70 kDa dextran genom intravenös (iv) svansvenen i svår kombinerad immunbrist (SCID) möss med xenograft tumörer i humana cellinjer eller patientgenererade primära tumörer till fluorescerande etikett makrofager två timmar före start av intravital avbildning.
2. Mikroskop Setup och Imaging Beredning
Obs! Den här proceduren beskriver uppställningenför intravital avbildning på en multifotonmikroskop 8.
- Slå på alla mikroskop och laser komponenter, inklusive två-photon laser och detektorer.
- Aktivera uppvärmning rutan till 30 ° C för att i förväg värma scenen. Detta steg är kritiskt för att bibehålla fysiologisk temperatur av djuret.
- För användning på ett inverterat mikroskop plats skräddarsydd skede insats på mikroskop scenen. Den anpassade insatsen är en skiva av 1/8 "tjock aluminium bearbetas för att passa in på scenen insatsutrymmet och med en 1" diameter genomgående hål i centrum för avbildning.
- Torka mikroskopställningen och stadium insats med 70% etanol och lufttorka.
- Placera en stor droppe vatten på 20X, 1,05 NA mikroskop mål att bibehålla optisk kontakt med täckglaset.
- Placera täckglaset (# 1.5 tjocklek) över bild porten på mikroskop scenen insatsen. Säkra på plats med lab tejp.
- Använd en hålslag att stansa en 2 cm x 2 cm håli en flexibel gummidyna och placera gummipackningen på mikroskop scenen med hålet i plattan i linje med hålet i den egna scenen insatsen.
3. Framställning av svansvenen kateter och reagenser för injektion under Imaging
- Skär en 30 cm längd av polyeten (PE) rör.
- Med hjälp av pincett, flytta metallnålen av en 31 G-nål och tillbaka tills den bryts bort av plast armaturer.
- Med hjälp av pincett, för in den trubbiga änden av den lösgjorda nålen i PE-slang.
- Infoga en 31 G nål i den andra änden av den PE-slang.
- Fyll en 1 cc spruta med steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och sätt in den i 31 G-nål och spola all luft ur slangen och nål med PBS. PBS används för att upprätthålla hydratisering och blod osmolaritet 9,18, kan dock isotonisk saltlösning också användas.
- Fyll en 1 cc spruta med 200 | il av 3 mg / kg 155 kDa dextran-tetrametylrodamin (TMR) Eller kvantprickar för vaskulär märkning.
- Förbered alla andra injicerbara proteiner, såsom en 165 aminosyraisoformen av vascular endothelial growth factor A (VEGFA 165) i en 1 cc spruta och placera på is. Injicera 0,2 mg / kg VEGFA 165 19 vid en koncentration av 0,05 mg / ml.
4. Införande av den inneboende Tail venkateter
- Placera djuret under anestesi med användning av en induktionskammare med 5% isofluran med O 2 som bärargas.
- Överför musen till den kirurgiska plattformen när den är helt bedövad och inte svarar på en tå nypa.
- Öppen isoflurananestesi linje till den kirurgiska plattformen, stäng anestesi linjen till induktionskammaren och placera noskonen över djurets nos. Minska isofluran från 5% till 2,5%.
- Applicera oftalmologiska salva för ögonen på musen för att förhindra torrhet under narkos.
- Värm djuret under värmelampaytterligare 2 minuter för att öka cirkulationen i svansen som cirkulationen saktar med djup anestesi.
- Sterilisera mussvansvenen med 70% etanol.
- In spetsen av 31 G nål från katetern konstruerad i avsnitt 3 i den laterala svansvenen av djuret och tryck nålen i 2-3 mm.
- Dra tillbaka på sprutan för att se blod, se till att katetern placeras i svansvenen.
- Använda en 1 cm längd av lab tejp placeras över nålen för att hålla nålen på plats parallellt med venen längs längden av svansen.
5. hudflik kirurgiskt ingrepp för att Exponera brösttumör
- Med djuret på den kirurgiska plattformen avtorkning av tumören och den ventrala ytan med 70% etanol. Obs: Som beskrivits, är detta förfarande inte utföras helt aseptiskt. För långa avbildning sessioner där infektion kan bli en confounding faktor, är det rekommenderat att använda rätt aseptisk teknik.
- med användning av Sterile pincett, lyft ventrala huden och med steril sax göra en subkutan snitt längs den ventrala mittlinjen ca 1 cm i längd. Undvik att punktera bukhinnan under snittet.
- skär försiktigt bindväv fästa bröstkörteln och tumör bort från bukhinnan att exponera brösttumör.
- Använda sax och pincett, försiktigt bort och skära bort fascia och fett från den exponerade ytan av tumören med bibehållen integritet tumörvaskulatur och minimera blödning. Detta steg är kritiskt för att upprätthålla tumör arkitektur och vaskulatur tillförsel av tumören.
6. Animal Förberedelse för mikroskopi
- Överför djuret till förvärmda avbildning scenen med den exponerade tumören placerad på täck på scenen insatsen över mikroskop målet för avbildning. Vara noga med att överföra svansvenen katetern försiktigt med djuret så att inte rubba nålen.
- place the anestesi noskon över djurets nos för att upprätthålla anestesi uppsättning till 3% isofluran.
- Placera djuret så att tumören vilar i hålet i gummidynan och gör kontakt med glastäckglas.
- Använd två gummikuddar för att försiktigt hålla tumören på plats och fäst dem till mikroskop scenen med lab tejp för att minska rörelse under bildtagning.
- Fylla kammaren från gummidynan med PBS för att hålla vävnaden hydratiserade och bibehålla optisk kontakt med täckglas.
- Börja övervaka djurets vitala med en pulsoximeter sond. Bifoga en klämsensor på låret av djuret. Alternativt kan en krage som är konfigurerad för att passa runt halsen kan användas.
- Placera uppvärmningslåda över djuret för att bibehålla 30 ° C 20.
- Sakta minska nivån av isofluran till 0,5-1% för att upprätthålla anestesi och upprätthålla blodflödet.
7. Image Acquisition och Injektion av fluorescerent-Färgämnen och Injicerbara Proteiner
- Användning av mikroskopet okularet fokus på de fluorescerande tumörceller på ytan av tumören.
- Välj ett område av intresse genom att hitta områden med flödande blodkärl. Valet av ett område av intresse med flödande blodkärl är avgörande för bedömningen av tumörvaskulatur.
- När ett område av intresse har valts växlar mikroskopet i multifotonbildläget.
- Ställa in de övre och nedre gränserna för en z-serien. Ställ den övre gränsen för z-serien med hjälp av fokusjusterings att flytta målet till önskad startplats och klicka på "Top" -knappen Z-position. Bestämma den övre gränsen för z-serien genom att visualisera fibernätet kollagen vid ytan av tumören i den andra övertonsgenerering (SHG) kanal och observera när inga celler men endast kollagenfibrer är synliga.
- Ställa in den nedre gränsen för z-serien genom att flytta målet till den önskade bilddjupet (typically 50-150 um) och klicka på Z-position "Bottom" -knappen.
- Ställ in stegstorleken genom att skriva önskat värde i stegstorlek fältet. Bestäm steg storlek baserat på överväganden för upplösning och förvärv tid (typiskt 2 pm används för högupplösta 3D-rekonstruktion och 5 pm på annat sätt).
- Ställ in time-lapse intervall genom att byta till Time-Lapse panelen och ange önskad förflutit gången i Time-Lapse fält. För optimal tidsupplösning ställa in tidsintervallet till 0 sek för kontinuerlig avbildning. Obs! För lång time-lapse avbildning är det rekommenderat att ställa in tidsintervallet till 10 sekunder mellan förvärv för att fylla målet nedsänkning vätska.
- När parametrarna för avbildning har bestämts, långsamt injicera 155 kDa dextran-TMR.
- Avlägsna sprutan med PBS i svansvenen katetern och ersätta med sprutan innehållande 155 kDa dextran-TMR noga med att inte införa några bubblor i line.
- Långsamt injicera 155 kDa dextran-TMR i musen, med en maximal volym av 200 l, och ersätta sprutan med spruta innehållande PBS. Kritiskt steg: Utför injektionen långsamt och vidta försiktighetsåtgärder för att undvika att få lösning utanför venen.
- Starta förvärvet av Z-stack tidsförlopp avbildning genom att klicka på Z-Stack och Time-lapse knappar att trycka dem och sedan klicka på inspelningsknappen.
- Om andra fluorescerande dextraner, det vill säga 10 kDa dextran-fluoresceinisotiocyanat (FITC), eller proteiner, dvs VEGFA 165, har upprättats i förväg injicera dem efter starten av bilden förvärvet under = 0 min start.
- Avlägsna sprutan med PBS i svansvenen katetern och ersätta med sprutan innehållande 10 kDa dextran-FITC eller VEGFA 165 noga med att inte införa några bubblor i linjen.
- Injicera långsamt injicerbara i musen genom svansvenen kateteroch ersätta sprutan med en spruta innehållande PBS.
- Varje 30-45 min, långsamt injicera 50 | il PBS eller saltlösning för att upprätthålla hydratiseringen av djuret.
8. Eutanasi
- Vid slutet av bildinhämtning, avliva djuret.
- Öka isofluran till 5%.
- Hålla djuret under 5% isofluran tills 30 sek efter det upphör att andas och ta bort djuret från scenen.
- Utföra halsdislokation att säkerställa fullständig eutanasi.
9. Bildbehandling
- Hämta bilder på 16-bitars TIFF-filer för varje enskild kanal vid varje tidpunkt och spara sekventiellt.
- Utför separation av spektral överlappning (dvs GFP och GFP), eliminering av xy drift och generering av filmer från tidsförlopp sekvenser med hjälp av etablerade metoder i ImageJ 9. Utför 3D-yta rekonstruktioner av högupplösta bilder 13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Förlängd tidsförlopp intravital mikroskopi möjliggör enda cell upplösning avbildning av flercelliga processer i tumören mikromiljö. Genom fluorescerande märkning tumörceller, makrofager, det vaskulära utrymmet och visualisera kollagenfibernätet med hjälp av andra harmoniska generationen signal, är flera fack i tumören mikro samtidigt spåras under avbildning. Tumörceller märkta med fluorescerande proteiner kan genereras i transgena möss, såsom har skett i MMTV-pymt-Dendra2 möss, med brösttumörceller märkta med Dendra2 (Figur 1A). Genom att korsa dessa transgena möss med Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP-möss, som har makrofager märkta med ECFP, är båda tumörceller och makrofager märkta i MMTV-pymt möss. Med den dubbla strategin av tumörceller och makrofager märkning, kan den direkta interaktionen av de två celltyper visualiseras i realtid (figur 1 A). Dessutom kan humana bröstcancercellinjer eller patienthärledda tumörceller transducerade med GFP användas för att märka tumörceller. Makrofager kan märkas med hjälp av fluorescerande 70 kDa dextran som ackumuleras i de fagocytiska makrofager (Figur 1B). Dessa metoder har främjat studiet av dynamiska flercelliga händelser såsom tumörcell makrofag streaming motilitet, vaskulär permeabilitet och tumörcell intravasering. Att visualisera förändringar i tumör vaskulär permeabilitet, en fluorescensmärkt med hög molekylvikt dextran (är 155 kDa eller högre rekommenderas 9,13,21,22) eller kvantprickar används för att märka det vaskulära rummet (Figur 1). 155 kDa dextran eller kvantprickar är tillräckligt stora att de inte enkelt diffunderar genom de interendothelial utrymmena 23.
Kontinuerlig hög upplösning avbildning underlättar avskiljning av vaskulär permeabilitet händelser ochkvantifiering av kinetiken dextran extravasering och avslut på TMEM (Figur 2 och Movie 1). Eftersom det vaskulära utrymmet lätt definieras av kDa dextran 155 vid inledningen av tidsförlopp sekvens (som i 0 "i figur 2) extravaskulära fluorescerande dextran kan kvantifieras i varje ram av time-lapse-sekvens. Figur 2 och film 1 visar extravasering av 155 kDa dextran-TMR injiceras genom en svansven kateter i en MMTV-pymt-Dendra2; Csf1r-GFP mus. Dendra2-märkta tumörceller (grön) och GFP-märkta makrofager (cyan) används för att identifiera TMEM med levande djur. Den TMEM struktur på platsen för vaskulär permeabilitet beskrivs i en vit ruta. Den vaskulära utrymmet är märkt med 155 kDa dextran-TMR (röd) för att visualisera flyter kärl och extravasation av vaskulära innehåll under händelserna i vaskulär permeabilitet. Toppen av 155 kDa dextran-TMR extravaseringi figur 2 ses mellan 29 'och 34'. Extravaskulära dextran ses på den vita pilen i övre panelerna och vid den röda pilen i de lägre panelerna visar endast kanalen av 155 kDa dextran-TMR. 155 kDa dextran-TMR rensar från vävnaden och ses som en minskning i det extravaskulära TMR signal som ses vid 97 'i figur 2. Efter sammanställningen av tidsförlopp sekvens i ImageJ extravaskulära dextran kvantifieras.
Förutom att följa spontana händelser i tumören mikro, är det viktigt att studera bakomliggande molekylära mekanismen av de identifierade fenomen. Injicera ytterligare vaskulära färgämnen eller proteiner för att inducera vaskulär permeabilitet kan ge insikt i de signaleringshändelser som reglerar vaskulär permeabilitet. Figur 3 visar skillnaden i extravasation av 10 kDa dextran-FITC (grön) och 155 kDa dextran-TMR (röd).Hög molekylvikt 155 kDa dextran-TMR administreras omedelbart innan time-lapse avbildning. Fem Z-stackar förvärvas i tidsförlopp sekvens för att ställa in en baslinje före 10 kDa dextran-FITC injiceras. Efter förvärvet av 5: e Z-stack 10 kDa dextran-FITC administreras genom svansvenen katetern utan att avbryta bildtagning. Dextran-FITC ses som kommer in i kärlsystemet med omedelbar extravasation under det att 155 kDa dextran-TMR förblir begränsat till det vaskulära utrymmet (figur 3, 0 'och 6'). Den 10 kDa dextran-FITC extravasates helt från blodkärlet och rensar från vävnaderna som lämnar 155 kDa dextran-TMR i blodkärlet (fig 3 såsom visas vid 56 'och Movie 2). Med hjälp av en tidpunkt från före injektion kan kinetiken för 10 kDa dextran-FITC extravasering lätt jämfört med 155 kDa dextran-TMR 13. Den omedelbara extravasation av 10 kDa dextren-FITC efter injektion skiljer sig mycket från lagring av 155 kDa dextran-TMR i kärlsystemet och de spontana vaskulär permeabilitet händelser 13. Ytterligare experimentella kontroller kan utföras, inklusive inducera vaskulär permeabilitet genom mekanisk sönderdelning av endotel eller genom VEGFA 165 förmedlad permeabilitet 13. Kinetik extravasering av 155 kDa dextran-TMR spontana genomtränglighet händelser kan jämföras med 10 kDa dextran, och andra medel för att inducera vaskulär permeabilitet att förstå de händelser och signaler som är involverade i vaskulär permeabilitet händelser i tumören mikromiljö.
Figur 1. Strategier för märkning av celler och kärl i tumören mikromiljö. (A) Transgena MMTV-pymt mus med tumörceller märkta med Dendra2 (MMTV-icre / CAGCAT-Dendra2 / MMTV-pymt) och makrofager märkta med GFP (Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP). Tumörvaskulatur är märkt med 155 kDa dextran-TMR administreras genom svansvenen kateter. (B) TN1-GFP patientgenererade xenograft tumörer med makrofager märkta med 70 kDa dextran-Texas Red och kärl märkta med kvantprickar som använder svansvenen kateter. Skala bar, 50 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Visualisering gående vaskulär permeabilitet. (A) Intravital mikroskopi (IVM) time-lapse av 155 kDa dextran-TMR (röd) extravasering och tumörcell intravasering på TMEM (vit ruta). Tumörceller märkta med Dendra2 (grön, TC), makrofager med ECFP (cyan, M) och blood fartyg med 155 kDa dextran-TMR (röd, BV). Blodkärlens permeabilitet platser (vit pil). (B) Isolerad 155 kDa dextran-TMR kanal. Röda pilar markerar dextran extravasering (vit). Skala bar, 50 um. Film av tidsförlopp mikroskopi i Movie 1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Visualisera flera fluorescerande dextraner. IVM tidsförlopp skillnad i extravasation av 155 kDa dextran-TMR (röd) och 10 kDa dextran-FITC (grön). Makrofager är märkta med ECFP (cyan) och kollagen i blått (SHG). Överlagring av röda 155 kDa dextran-TMR och grönt 10 kDa dextran-FITC i kärlsystemet är gul. Snabb extravasation av grönt 10 kDa dextran-FITC toppen är vid 6 min. Scale bar, 50 um. Film av tidsförlopp mikroskopi i filmen 2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Film 1. Visualisering spontan gående vaskulär permeabilitet med time-lapse IVM. Time-lapse mikroskopi (som visas i figur 2) övergående blodkärl permeabilitet visualiseras i en transgen MMTV-pymt mus med tumörceller märkta med Dendra2 (MMTV-icre / CAGCAT -Dendra2 / MMTV-pymt) och makrofager märkta med GFP (Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP). Extravasering av 155 kDa dextran-TMR extravasering (röd i vänstra panelen, vit högra panelen) observeras vid förgreningspunkten av tumören blodkärlet. Phyra Klicka här för att se filmen. (Högerklicka för att ladda ner.)
Film 2. Visualisera extravasering av flera fluorescerande dextraner av tidsförlopp IVM. Time-lapse mikroskopi (som visas i figur 3) av extravasation av 155 kDa dextran-TMR (röd) och 10 kDa dextran-FITC (grön) i en transgen MMTV-pymt mus med makrofager märkta med GFP (Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP). SHG av kollagen är märkt i blått. Red 155 kDa dextran-TMR kvar i tumörkärl under hela den tid som förflutit medan den gröna 10 kDa dextran-FITC extravasates snabbt och försvinner från blodkärlen och vävnaden. Klicka här för att se filmen. (Högerklicka för att ladda ner.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Cellulära interaktioner som förekommer spontant i tumören mikro kan leda till förändringar i tumörcellrörlighet och intravasering. Högupplöst intravital avbildning av levande tumörvävnad medger visualisering av flercelliga dynamik som kan vara mycket övergående 10,13,24. Slutpunkt in vivo eller time-lapse bilder som förvärvats med diskreta tidpunkter kan ge viktig information om molekylära mekanismer för processer i tumören mikromiljö. Intravital imaging studier har använts för att studera processer i tumören mikro som inträffar under flera dagar, vilket ger nya insikter om angiogenes, tumörcellmigrering och svar på läkemedelsbehandling 25-30. Däremot kan dessa analyser inte fånga kinetiken av övergående händelser i tumören mikro på grund av tidsskalan för de processer som studeras 7,31. Skilja flera transienta händelser från ständiga processer är en betydande annonsvantage av intravital mikroskopi.
Den intravital imaging teknik som beskrivs i detta protokoll gör det möjligt att direkt visualisering av cellulära dynamik i tumören mikro genom fluorescensmärkning av flera cellinjer och strukturer. Multifotonmikroskop medger större djup avbildning över en enda foton konfokalmikroskopi med djup på 300 um rutinmässigt 24. Förvärv av Z-stackar av 50-100 pm med 2 pm steg är av tillräckligt hög upplösning för att generera 3D-rekonstruktion av cellulära interaktioner, inklusive utsprång att celler gör när de sträcker sig mot varandra 13 och kärlstrukturer i tumören mikromiljö. Filmer och 3D-rekonstruktioner från tidsförlopp bildsekvenser möjliggöra kvantifiering av cellulära motilitet (hastighet och riktning) och, med hjälp av förändringar i fluorescenssignalintensiteten av injicerbara färgämnen, vaskulär permeabilitet.
För att fånga spontaneous cellulära händelser antalet enskilda bilder som tas med en enda sekvens måste optimeras för att medge en hastighet av bilden förvärvet som fångar kinetiken för händelsen, men som även täcker ett tillräckligt fysiskt utrymme för att öka sannolikheten för att fånga någon enskild händelse under en enda gång-lapse-sekvens. De rumsliga imaging parametrar som måste beaktas inkluderar; antalet skivor i en Z-stack, antalet synfält med Z-stackar som förvärvats och det axiella avståndet mellan de enskilda skivorna i en Z-stack. Därför ställa dessa parametrar innan bildtagning är ett kritiskt steg i protokollet. Med hjälp av multifotonmikroskop, är förvärvet av 30 bilder (500 pm x 500 pm) i en z-serien ca 60 sek. Eftersom varaktigheten av observerade tumörcell intravasering kan vara i storleksordningen minuter 13, fånga flera Z-stackar för 3D-rekonstruktion av intravasering fördes förvärvet tiden för en Z-stack begränsad to 60 sek. Därför förvärvades ett enda synfält med upp till 30 skivor i en Z-stack. Eftersom 3D-rekonstruktion av celler önskas, axiella steg mellan Z-skivor var satt till 2 pm. Detta gör det möjligt att tillräcklig information om cellvolymerna för att möjliggöra 3D-rekonstruktion. Dessa parametrar måste optimeras för varje mikroskop och bildbehandlingsprogram som används baserat på kinetiken av liveevenemang som studeras.
Modifieringen av gummidynan på mikroskop scenen och svansvenen iv kateter har både möjliggjorde en betydande ökning av avbildningstiden. Gummipackningen bildar en väl för att möjliggöra upprätthålls hydrering av tumören och samtidigt minimera XY drift på glaset täckglas. Kombinationen av uppvärmningskammaren med administreringen av PBS upprätthåller hydrering och fysiologisk temperatur av djur. Dessa villkor kombinerade upprätthålla vaskulär perfusion och blodflödet för att möjliggöra utökad avbildning av cellulära händelser vid tumör vasculature inklusive vaskulär permeabilitet och tumörcell intravasering.
En begränsning med denna teknik är antalet fluorescerande markörer som kan användas för att visualisera celler i tumören mikromiljö. Generering av transgena möss med ytterligare celltyper (dvs endotelceller, fibroblaster eller pericyter) innehållande fluorescerande protein kan vara svårt och tidskrävande. Emellertid skulle framtida potentiella tillämpningar använder en kombination av fluorescerande protein märkning av stromala celltyper med implanterade tumörceller och 70 kDa dextran märkning av makrofager. Genom att använda en kombination av dessa märkningsstrategier och korsar transgena möss kan genereras nya kombinationer av cellulära etiketter för att bedöma cellrörelse och händelser i tumören mikromiljö.
Till skillnad från slutpunkts experiment baserade på immunofluorescensinfärgning medger högupplösta intravital mikroskopi visualisering av spontan och övergåendehändelser i tumören mikromiljö. Den intravital avbildning förfarande som beskrivs här avslöjar nya händelser och cellulära interaktioner i tumören mikro som inte kan tydas från statiska bilder. Med ny information om de samverkande celltyper eller processer, samt kinetiken för dessa händelser, kan hypoteser genereras att undersöka signalvägar som driver dessa interaktioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Denna forskning stöddes av försvarsdepartementet Breast Cancer Research programmet under tilldelning nummer (ASH, W81XWH-13-1-0010), NIH CA100324, PPG CA100324, och den integrerade bildprogrammet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 155 kDa dextran-tetramethylrhodamine isothiocyanate | Sigma Aldrich | T1287 | reconstitute at 20 mg/ml in 1x PBS |
| 70 kDa dextran-Texas Red | Life Technologies | D-1830 | reconstitute at 10 mg/ml in 1x PBS |
| 10 kDa dextran-fluorescein isothyocyanate | Sigma Aldrich | FD10S | reconstitute at 20 mg/ml in 1x PBS |
| Qdot 705 ITK Amino (PEG) Quantum Dots | Life Technologies | Q21561MP | Dilute 25 μl in 175 μl of 1x PBS for injection |
| MMTV-PyMT mice | Jackson Laboratory | 2374 | |
| Csf1r-ECFP mice (Csf1r-Gal4/VP16,UAS-ECFP) | Jackson Laboratory | 26051 | |
| Csf1r-EGFP mice | Jackson Laboratory | 18549 | |
| 1x PBS | Life Technologies | ||
| Isoethesia (isoflurane) | Henry Schein Animal Health | 50033 | 250 ml |
| Oxygen | AirTech | ||
| 1 ml syringe, tuberculin slip tip | BD | 309659 | |
| 30 G x 1 (0.3 mm x 25 mm) needle | BD | 305128 | |
| Polyethylene micro medical tubing | Scientific Commodities Inc | BB31695-PE/1 | 0.28 mm I.D. x 0.64 mm O.D. |
| Microscope coverglass | Corning | 2980-225 | thickness 1.5, 22 x 50 mm |
| PhysioSuite MouseSTAT pulse oximeter, software and sensors | Kent Scientific | ||
| Laboratory tape | Fisher Scientific | 159015R | |
| soft rubber pad | McMaster-Carr | 8514K62 | Ultra-Soft Polyurethane Film, 3/16” Thick, 12" x 12", 40 Oo Durometer, Plain Back |
| hard rubber pad | McMaster-Carr | 8568K615 | High-Strength Neoprene Rubber Sheet 1/4" Thick, 12" x 12", 50 A Durometer |
| Microscope | Olympus | The microscope is a custom built two laser multiphoton microscope based on an Olympus IX-71 stand utilizing a 20X 1.05NA objective lens. | |
| 7-Punch set | McMaster-Carr | 3429A12 | 1/4" to 1" Hole Diameter, for Hammer-Driven Hole Punch |
References
- Gerlowski, L. E., Jain, R. K. Microvascular permeability of normal and neoplastic tissues. Microvasc Res. 31 (3), 288-305 (1986).
- Wang, H. -L., Lai, T. W. Optimization of Evans blue quantitation in limited rat tissue samples. Sci Rep. 4, (2014).
- Dvorak, H. F. Rous-Whipple Award Lecture. How tumors make bad blood vessels and stroma. Am J Pathol. 162 (6), 1747-1757 (2003).
- Nagy, J. A., et al. Permeability properties of tumor surrogate blood vessels induced by VEGF-A. Lab Invest. 86 (8), 767-780 (2006).
- Egawa, G., et al. Intravital analysis of vascular permeability in mice using two-photon microscopy. Sci Rep. 3, (2013).
- Yuan, F., et al. Vascular permeability in a human tumor xenograft: molecular size dependence and cutoff size. Cancer Res. 55 (17), 3752-3756 (1995).
- Dellian, M., Yuan, F., Trubetskoy, V. S., Torchilin, V. P., Jain, R. K. Vascular permeability in a human tumour xenograft: molecular charge dependence. Br J Cancer. 82 (9), 1513-1518 (2000).
- Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nat Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
- Entenberg, D., et al. Imaging tumor cell movement in vivo. Curr Protoc Cell Biol. Chapter. 19, (2013).
- Patsialou, A., et al. Intravital multiphoton imaging reveals multicellular streaming as a crucial component of in vivo. cell migration in human breast tumors. Intravital. 2 (2), e25294 (2013).
- Gligorijevic, B., Bergman, A., Condeelis, J. Multiparametric classification links tumor microenvironments with tumor cell phenotype. PLoS Biol. 12 (11), e1001995 (2014).
- Roussos, E. T., et al. Mena invasive (MenaINV) promotes multicellular streaming motility and transendothelial migration in a mouse model of breast cancer. J Cell Sci. 13, 2120-2131 (2011).
- Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA). Cancer Discov. 5 (9), 932-943 (2015).
- Robinson, B. D., et al. Tumor microenvironment of metastasis in human breast carcinoma: a potential prognostic marker linked to hematogenous dissemination. Clin Cancer Res. 15, 2433-2441 (2009).
- Sasmono, R. T., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
- Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. J Leukcocyte Biol. 83 (2), 430-433 (2008).
- Liu, H., et al. Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (42), 18115-18120 (2010).
- Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. J Vis Exp. (73), (2013).
- Weis, S., Cui, J., Barnes, L., Cheresh, D. Endothelial barrier disruption by VEGF-mediated Src activity potentiates tumor cell extravasation and metastasis. J Cell Biol. 167 (2), 223-229 (2004).
- Wyckoff, J., Gligorijevic, B., Entenberg, D., Segall, J., Condeelis, J.
- Lathia, J. D., et al. Direct in vivo. evidence for tumor propagation by glioblastoma cancer stem cells. PLoS One. 6 (9), e24807 (2011).
- Nakasone, E. S., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).
- Dreher, M. R., et al. Tumor vascular permeability, accumulation, and penetration of macromolecular drug carriers. J Natl Cancer Inst. 98 (5), 335-344 (2006).
- Wyckoff, J. B., et al. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Res. 67 (6), 2649-2656 (2007).
- Chittajallu, D. R., et al. In vivo. cell-cycle profiling in xenograft tumors by quantitative intravital microscopy. Nat Methods. 12 (6), 577-585 (2015).
- Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nat Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
- Yano, S., et al. Spatial-temporal FUCCI imaging of each cell in a tumor demonstrates locational dependence of cell cycle dynamics and chemoresponsiveness. Cell Cycle. 13 (13), 2110-2119 (2014).
- Yang, M., Jiang, P., Hoffman, R. M. Whole-body subcellular multicolor imaging of tumor-host interaction and drug response in real time. Cancer Res. 67 (11), 5195-5200 (2007).
- Manning, C. S., et al. Intravital imaging reveals conversion between distinct tumor vascular morphologies and localized vascular response to Sunitinib. Intravital. 2 (1), 24790 (2013).
- Alexander, S., Koehl, G. E., Hirschberg, M., Geissler, E. K., Friedl, P. Dynamic imaging of cancer growth and invasion: a modified skin-fold chamber model. Histochem Cell Biol. 130 (6), 1147-1154 (2008).
- Brown, E. B., et al. In vivo. measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy. Nat Med. 7 (7), 864-868 (2001).
