Summary
Этот протокол описывает использование многофотонной микроскопии для выполнения расширенного замедленную съемку многоклеточных взаимодействий в реальном масштабе времени, в естественных условиях в одном разрешении клеток.
Introduction
Распространение опухолевых клеток из первичной опухоли молочной железы было показано, включать не только опухолевые клетки, но у себя стромальных клеток, включая макрофаги и эндотелиальные клетки. Кроме того, сосудистую сеть опухоли является ненормальным с повышенной проницаемостью 1. Таким образом, определение того, как опухолевые клетки, макрофаги и эндотелиальные клетки взаимодействуют посредничать проницаемость сосудов и опухолевых клеток intravasation в микросреды первичной опухоли имеет важное значение для понимания метастазирования. Понимание кинетики проницаемости сосудов, опухолевых клеток intravasation и основной механизм передачи сигналов многоклеточных взаимодействий в микроокружение опухоли может предоставить важную информацию в разработке и введению анти-терапии рака.
Основным средством изучения опухолевой сосудистой проницаемости в естественных условиях было измерение экстраваскулярных красителей , таких как голубой Эванса 2, декстраны с высокой молекулярной массой (155 кДа)3 и флуорофор или радиоиндикаторные-конъюгированные белки ( в том числе альбумин) 4 в фиксированные моменты времени после инъекции красителя. Достижения в области микроскопии, животные модели и флуоресцентные красители позволили визуализации клеточных процессов и проницаемости сосудов в живых животных через прижизненной микроскопии 5.
Живое животное изображений с приобретением статических изображений или короткое время покадровой последовательностей в течение нескольких моментов времени не позволяет для полного понимания динамических событий в микроокружение опухоли 6,7. В самом деле, статическое получение изображений в течение 24 часов , показали , что опухоль сосудистая негерметичен, однако динамика проницаемости сосудов не наблюдалось 6. Таким образом, расширенное время непрерывной покадровой изображений до 12 часов захватывает кинетики динамических событий в микроокружение опухоли.
Этот протокол описывает использование расширенного покадровой multiphotна прижизненной микроскопии для изучения динамических многоклеточные событий в опухоли микроокружения. Несколько типов клеток в опухоли микроокружения помечены инъекционные красителей или с использованием трансгенных животных, экспрессирующие флуоресцентные белки. Использование вены катетер хвоста сосудистые красители или белки могут быть инъецированы после начала обработки изображений для получения кинетических данных многоклеточных событий в микроокружение опухоли. Для получения изображений живых клеток опухоли молочной подвергается через хирургической подготовки кожного лоскута. Изображения приобретаются на срок до 12 часов с использованием многофотонного микроскопа , оборудованного с несколькими фотоумножителей (ФЭУ) детекторов 8. При использовании соответствующих фильтров, алгоритм вычитания позволяет 4 детекторов PMT приобрести 5 флуоресцентные сигналы в опухоли микроокружения одновременно 9. Высокое разрешение многофотонная прижизненной микроскопии захватывает одного элемента разрешения визуализации опухоли стромы взаимодействий в микроокружение опухоли, что приводит к лучшему Understanding проницаемости сосудов и intravasation опухолевых клеток 10-13. В частности, расширенные прижизненной визуализации выявили высоколокализованной, транзиторные сосудистых событий , которые происходят проницаемости селективно на участках взаимодействия между опухолевой клетки, макрофаг и эндотелиальных клеток (определяемой как Опухоль микросреде метастаз, TMEM 14) 13. Кроме того, опухолевые клетки intravasation происходит только при TMEM и пространственно и временно коррелирует с проницаемостью сосудов 13. Одно разрешение клеток динамики этих событий стало возможным благодаря использованию расширенного покадровой многофотонной микроскопии флуоресцентно меченых клеток в опухоли микроокружения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры, описанные должны быть выполнены в соответствии с действующими нормами и правилами для использования позвоночных животных, в том числе предварительного одобрения колледжа Альберта Эйнштейна медицины Институциональные уходу и использованию животных комитета.
1. Создание флуоресцентно меченных Опухоли и ассоциированные с опухолью макрофаги
- Сформировать флуоресцентно меченных опухолевых клеток путем скрещивания спонтанное, автохтонное, методами генной инженерии молочной железы мышей модели рака , где вирус опухоли длинный концевой повтор молочной железы мышей приводит в движение полиома средний Т - антиген (MMTV-PyMT) с трансгенных мышей с флуоресцентными репортерами [то есть усиливается зеленый флуоресцентный белок (EGFP), усиливается бирюзового флуоресцентный белок (ECFP) или Dendra2] 8,9.
- Флуоресцентно макрофаги этикеток в PyMT животных с флуоресцентно меченных опухолевых клеток путем скрещивания генетически сконструированные модели мыши с myeloid- и macrophage- конкретных флуоресцентных репортеров [т.е. MacGrееп 15 или MacBlue мышей Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP 16].
- В качестве альтернативы, генерировать флуоресцентно меченных опухоли через ортотопической трансплантации флуоресцентно меченных опухолевых клеток PyMT (сингенных), линии клеток рака молочной железы человека или первичных производных больного человека опухолей (ксенотрансплантатов) 11,17.
- Имплантат флуоресцентно меченных PyMT выход опухолевых клеток в сингенных мышей с флуоресцентным белком-меченых миелоидных клеток генерировать животных с флуоресцентно меченый опухолевых клеток и миелоидных клеток 13.
- Вводят 100 мкл 10 мг / кг флуоресцентный 70 кДа декстрана путем внутривенной (IV) в хвостовую вену в тяжелый комбинированный иммунодефицит (SCID) мышей с ксенотрансплантатов опухолей клеточных линий человека или первичных опухолей пациентов, полученных на флуоресцентно макрофагов этикетки 2 ч до начала прижизненной визуализации.
2. Настройка микроскопа и обработки изображений Подготовка
Примечание: Эта процедура описывает настройкудля прижизненной визуализации на многофотонном микроскопа 8.
- Включите все микроскопа и лазерных компонентов, включая двухфотонными лазеров и детекторов.
- Включите поле нагрева до 30 ° С, чтобы предварительно нагреть почву. Этот шаг имеет решающее значение для поддержания физиологической температуры животного.
- Для использования на инвертированный микроскоп месте выполненный на заказ этап вставки на столик микроскопа. Обычай вставка представляет собой лист толщиной 1/8 "алюминий механической обработке, чтобы поместиться в стадии вставки пространства и с 1" диаметр сквозного отверстия в центре для работы с изображениями.
- Протереть столик микроскопа и этап вставки с 70% этанола и сухого воздуха.
- Поместите большой капли воды на объектив микроскопа 20X, 1,05 NA поддерживать оптический контакт с защитным стеклом.
- Место покровного стекла (# 1,5 толщина) через порт формирования изображения на столике микроскопа вставки. Закрепить на месте с помощью лабораторной лентой.
- Используйте дырокол пробить 2 см х 2 см отверстиев гибкой резиновой прокладки и поместите резиновую прокладку на столике микроскопа с отверстием в прокладке совмещено с отверстием в пользовательской стадии вставки.
3. Получение хвостовую вену катетером и реагенты для инъекций во время съемки
- Сокращение длины 30 см из полиэтилена (ПЭ) труб.
- Использование щипцов, переместите металлическую иглу 31 G иглу назад и вперед, пока она не обрывается пластиковой арматуры.
- Использование щипцов, вставьте тупой конец иглы в отдельных ПЭ труб.
- Вставка 31 G иглу в другой конец трубки PE.
- Заполните 1 куб шприц со стерильным фосфатным буферным раствором (PBS) и вставить его в 31 G иглы и промойте весь воздух из трубки и иглы с PBS. PBS , используется для поддержания гидратации и осмолярности крови 9,18, также могут быть использованы , однако изотонический солевой раствор.
- Заполните 1 куб шприц с 200 мкл 3 мг / кг 155 кДа декстрана-тетраметилродамин (TMR) Или квантовые точки для сосудистой маркировки.
- Приготовьте любые другие инъекционные белки , такие как 165 аминокислотного изоформы сосудистого фактора А роста эндотелия (VEGFA 165) в 1 куб.см шприцем и помещают на лед. Вводят 0,2 мг / кг VEGFA 165 19 при концентрации 0,05 мг / мл.
4. Размещение пребывающей в хвостовую вену Катетера
- Место животное под анестезией с использованием индукционной камере с 5% изофлуран с O 2 в качестве газа - носителя.
- Перенесите мышь к хирургическому платформе, когда он будет полностью под наркозом и не отвечает на носок крайнем случае.
- Открыть изофлуран анестезии линии хирургической платформы, закрыть анестезию линию к индукции камеры и поместите носовой конус над мордой животного. Снизить изофлуран от 5% до 2,5%.
- Применение глазной мази для глаз мыши, чтобы предотвратить сухость во время анестезии.
- Нагреть животное под нагревательной лампойеще в течение 2 мин, чтобы увеличить циркуляцию в хвосте, как циркуляция замедляется с глубокой анестезией.
- Стерилизовать хвостовую вену мыши с 70% этанола.
- Вставьте кончик 31 G иглы из катетера, выполненного в разделе 3 в боковую хвостовую вену животного и толкать иглу в 2-3 мм.
- Отступите на шприц, чтобы увидеть кровь, обеспечивая катетер помещают в хвостовую вену.
- С помощью 1 см длины лабораторной ленты размещены над иглой, чтобы удерживать иглу на месте параллельно с веной вдоль длины хвоста.
5. лоскут кожи хирургическая процедура, чтобы Выставляют опухоли молочной железы
- С животного на платформе хирургической тампоном опухоли и вентральной поверхности с 70% этанола. Примечание: Как описано выше, эта процедура не выполняется полностью в асептических условиях. Для длительных сеансов визуализации, где инфекция может стать сбивающий фактор, то рекомендуется использовать правильную технику асептики.
- Использование STERIле щипцов, поднимите брюшного кожу и стерильными ножницами сделать подкожный надрез вдоль вентральной срединной линии примерно на 1 см в длину. Избегайте прокалывание брюшины во время разреза.
- Аккуратно разрезать соединительную ткань имеется молочную железу и опухоль от брюшины подвергать опухоли молочной железы.
- Используя ножницы и пинцет, аккуратно удалите и срезаем фасции и жир с открытой поверхности опухоли при сохранении целостности опухолевой сосудистой и сводя к минимуму кровотечение. Этот шаг имеет решающее значение в поддержании архитектуры опухоли и сосудистой снабжение опухоли.
6. Подготовка животных для микроскопии
- Перенести животное на сцену подогретого визуализации с облученной опухоли, размещенной на покровное на этапе вставки над объектива микроскопа для работы с изображениями. Позаботьтесь перевести хвостовую вену катетер осторожно с животным, чтобы не смещать иглу.
- Место йе анестезии носа конус над мордой животного для поддержания анестезии набор на 3% изофлуран.
- Поместите животное так, чтобы опухоль лежит в отверстие резиновую прокладку и вступает в контакт с покровным стеклом.
- Используйте две резиновые прокладки, чтобы мягко держать опухоль на месте и зафиксировать их на столике микроскопа с лабораторным лентой, чтобы уменьшить движение во время захвата изображения.
- Наполните камеру от резиновую прокладку с PBS, чтобы сохранить ткани гидратированный и поддерживать оптический контакт с покровным.
- Начать мониторинг жизненно важных признаков животного с пульсоксиметр зондом. Приложить датчик клип на бедро животного. В качестве альтернативы можно использовать хомут, который выполнен с возможностью установки вокруг шеи.
- Поместите коробку нагрева над животным для поддержания 30 ° C 20.
- Медленно уменьшить уровень изофлуран до 0,5-1% для поддержания анестезии и поддержания кровотока.
7. Получение изображения и инъекция Fluorescлор Красители и инъекционные Белки
- Использование фокус окуляра микроскопа на флуоресцентном опухолевых клеток на поверхности опухоли.
- Выберите интересующую область, находя участки с распущенными кровеносных сосудов. Выбор области интереса плавных кровеносных сосудов является критическим для оценки сосудистую сеть опухоли.
- После того, как область интереса выбран переключатель микроскопа в режим многофотонном визуализации.
- Установите верхний и нижний пределы в Z-серии. Установить верхний предел Z-серии с помощью фокуса регулятора для перемещения цели в нужное место начала и нажав на кнопку позиции Z "Top". Определить верхний предел Z-серии, визуализовав сеть из волокон коллагена на поверхности опухоли в канале генерации второй гармоники (SHG) и наблюдения, когда никакие клетки, но только коллагеновые волокна не видны.
- Установите нижний предел серии Z, перемещая цель на нужную глубину изображения (TypicaLLY 50 - 150 мкм) и нажав на кнопку Z позицию "Bottom".
- Устанавливает размер шага, введя нужное значение в поле размера шага. Определить размер шага на основе соображений, для разрешения и времени приобретения (как правило, используется 2 мкм для 3D реконструкции высокого разрешения и в противном случае 5 мкм).
- Установить интервал времени покадровой путем переключения на панели Time-Lapse и введя желаемое время впасть в поле Time-Lapse. Для оптимального временного разрешения установить интервал времени до 0 сек для непрерывной визуализации. Примечание: в течение длительного времени покадровой съемки рекомендуется установить интервал времени до 10 секунд между приобретениями для пополнения объективного иммерсионной жидкости.
- После того как параметры для визуализации определены, медленно вводят 155 кДа декстрана-TMR.
- Удалите шприц с PBS в хвостовую вену катетер и заменить шприц, содержащий 155 кДа декстрана-TMR, стараясь не вводить никаких пузырьков в Liсеверо-восток
- Медленно впрыснуть 155 кД декстраном TMR в мышь, с максимальным объемом 200 мкл, и заменить шприц с шприц, содержащий PBS. ШАГ КРИТИЧЕСКОЕ: Выполните инъекцию медленно и принять меры предосторожности, чтобы избежать попадания раствора вне вены.
- Начало приобретение покадровой обработки изображений Z-стека, нажав на Z-Stack и кнопки ЗАМЕДЛЕННАЯ нажимать их, а затем нажав на кнопку записи.
- Если другие флуоресцентные декстраны, то есть, 10 кДа декстран-изотиоцианат флуоресцеина (FITC), или белки, т.е. VEGFA 165, были подготовлены заранее, вводить их после начала захвата изображения для при = 0 мин начала.
- Удалите шприц с PBS в вену катетера хвост и заменить шприц , содержащий 10 кДа декстрана-FITC или VEGFA 165, стараясь не вводить никаких пузырьков в линию.
- Медленно вводят уколы в мышь через хвостовую вену катетери заменить шприц с помощью шприца, содержащего PBS.
- Каждый 30-45 мин, медленно вводят 50 мкл PBS или физиологический раствор для поддержания гидратации животного.
8. Эвтаназия
- При прекращении получения изображения, усыпить животное.
- Увеличение изофлуран до 5%.
- Держите животное под 5% изофлуран до 30 секунд после того, как она перестает дышать и удалить животное со сцены.
- Выполните шейки дислокации, чтобы обеспечить полную эвтаназию.
Обработка 9. Изображение
- Получение изображений на 16-битных файлов TIFF для каждого отдельного канала в каждый момент времени и сохранить последовательно.
- Выполните разделение спектрального перекрытия (т.е., GFP и CFP), устранение ху дрейфа и генерации фильмов из покадровой последовательностей с использованием установленных методов в ImageJ 9. Выполнение 3D поверхностных реконструкций изображений с высоким разрешением 13,
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Расширенный покадровой прижизненной микроскопии позволяет одного элемента разрешения визуализации многоклеточных процессов в опухоли микроокружения. По флуоресцентно опухолевых клеток маркировки, макрофагов, сосудистого пространства и визуализации сети коллагеновых волокон с использованием второго сигнала генерации гармоник, несколько отсеков в микросреды опухоли одновременно отслеживается во время съемки. Опухолевые клетки , меченные флуоресцентными белками могут быть получены в трансгенных мышах , как это было сделано в мышах ВОМЖМ-PyMT-Dendra2, с молочными опухолевых клеток , меченных Dendra2 (Рис . 1А) Путем скрещивания этих трансгенных мышей с мышей Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP, которые имеют макрофаги , меченные ECFP, как опухолевые клетки и макрофаги маркируются у мышей MMTV-PyMT. С двойной стратегии маркировки опухолевых клеток и макрофагов, непосредственное взаимодействие двух типов клеток , могут быть визуализированы в реальном времени (рис 1А). Кроме того, клетки рака молочной железы линии человека или пациента, полученных опухолевые клетки трансдуцированных с GFP может быть использован для обозначения опухолевых клеток. Макрофаги могут быть помечены с использованием флуоресцентно меченных 70 кДа декстран , который накапливается в фагоцитирующих макрофагов (рис 1B). Эти методы способствовали изучению динамических многоклеточных событий, таких как опухолевых клеток-макрофагов потоковом моторики, проницаемость сосудов и опухолевых клеток intravasation. Для того, чтобы визуализировать изменения проницаемости сосудов опухоли, флуоресцентно меченый с высокой молекулярной массой декстрана (155 кДа или выше рекомендуется 9,13,21,22) или квантовые точки используются для обозначения сосудистого пространства (рисунок 1). 155 кДа декстран или квантовые точки являются достаточно большими , что они не могут легко диффундировать через interendothelial пространства 23.
Непрерывное создание изображений с высоким разрешением облегчает захват сосудистой проницаемости событий иКоличественное кинетики декстрана экстравазации и клиренс на TMEM (рисунок 2 и Movie 1). Поскольку сосудистое пространство легко определяется 155 кДа декстрана при инициировании последовательности в заданный промежуток времени (как в 0 'на рисунке 2) внесосудистая флуоресцентный декстран может быть определена количественно в каждом кадре последовательности в заданный промежуток времени. Рисунок 2 и фильм 1 демонстрируют Экстравазация 155 кДа декстрана-TMR вводили через хвостовую вену катетер в MMTV-PyMT-Dendra2; Csf1r-CFP мыши. Dendra2-меченых опухолевых клеток (зеленый) и CFP меченные макрофаги (Cyan) используются для идентификации TMEM в живых животных. Структура TMEM на участке сосудистой проницаемости описана в белой коробке. Сосудистый пространство метят 155 кДа декстрана-TMR (красные) для визуализации, протекающий сосудистую сеть и транссудации сосудистых содержимого во время событий сосудистой проницаемости. Пик 155 кДа декстрана-TMR экстравазациина рисунке 2 видно , между 29 'и 34'. Экстраваскулярных декстран видно на белом в наконечник стрелы верхних панелей и на красной стрелки в нижней панели, показывая только канал 155 кДа декстрана-TMR. 155 кДа декстран-TMR очищает от ткани и рассматривается как уменьшение внесосудистое сигнала TMR , как показано на 97 'на фиг.2. После компиляции последовательности в заданный промежуток времени в ImageJ экстраваскулярной декстрана количественно.
Помимо наблюдения за спонтанные события в микросреды опухоли, важно изучить основной молекулярный механизм выявленных явлений. Инъекционное дополнительные сосудистые красители или белки индуцируют проницаемость сосудов может обеспечить понимание сигнальных событий , регулирующих проницаемость сосудов. Рисунок 3 показывает разницу в транссудации 10 кДа декстрана-FITC (зеленый) и 155 кДа декстрана-TMR (красный).Высокая молекулярная масса 155 кДа декстрана-TMR немедленно вводят до начала покадровой обработки изображений. Пять Z-стеки приобретаются в последовательности в заданный промежуток времени, чтобы установить базовую линию до 10 кДа декстран-FITC впрыскивается. После приобретения 5 - го Z-стек 10 кДа декстран-FITC вводят через вену катетера хвост , не прерывая захвата изображения. Декстран-FITC , рассматривается ввод сосудистую сеть с немедленным экстравазации в то время как 155 кД декстран-TMR остается ограниченной сосудистом пространстве (рис 3, 0 'и 6'). 10 кДа декстран-FITC , полностью экстравазатов из кровеносного сосуда и очищает от тканей , покидающих 155 кДа декстрана-TMR в кровеносный сосуд (рисунок 3 , как показано на 56 'и Movie 2). Использование временной точки от перед инъекцией, кинетика 10 кДа декстран-FITC экстравазации может быть легко по сравнению с 155 кДа декстрана-TMR 13. Непосредственным экстравазация 10 кДа dextrан-FITC , после инъекции существенно отличается от удерживания 155 кДа декстрана-TMR в сосудистую сеть и спонтанными проницаемость сосудов событий 13. Дополнительные экспериментальные управления могут быть выполнены в том числе индуцирования сосудистой проницаемости через механическое разрушение эндотелия или через VEGFA 165 опосредованной проницаемости 13. Кинетика транссудации 155 кДа декстрана-TMR спонтанных проницаемости событий можно сравнить с весом 10 кДа декстран, а также другие средства стимулирования сосудистую проницаемость, чтобы понять события и сигналы, связанные с сосудистой проницаемости событий в микроокружение опухоли.
Рисунок 1. Стратегии маркировки клеток и в сосудистую сеть опухоли микроокружения. (А) Трансгенные MMTV-PyMT мыши с опухолевыми клетками , меченными Dendra2 (MMTV-МСВЗ / CAGCAT-Dendra2 / MMTV-PyMT) и макрофаги , меченные CFP (Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP). Опухоль васкулатура метят 155 кДа декстрана-TMR под управлением хвостовую вену катетер. (B) Tn1-GFP пациента , полученных ксенотрансплантатов опухолей с макрофагами , меченных 70 кДа декстрана-Texas Red и сосудистую систему, меченных квантовыми точками , используя хвостовую вену катетер. Шкала бар, 50 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Визуальное переходную проницаемость сосудов. (А) Прижизненные микроскопии (IVM) замедленная 155 кДа декстрана-TMR (красный) транссудации и опухолевых клеток intravasation в TMEM (белая коробка). Опухолевые клетки, меченные Dendra2 (зеленый, ТС), макрофаги с ECFP (Cyan, M) и БлоО.Д. сосуды с 155 кДа декстрана-TMR (красный, BV). сайты проницаемости кровеносных сосудов (белые стрелки). (B) Изолированные 155 кДа декстрана-TMR канал. Красные стрелки отмечают декстран кровоизлияние (белый). Шкала бар, 50 мкм. Фильм о покадровой микроскопии в Movie 1. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Визуализация нескольких флуоресцентно меченных декстранов. IVM замедленной разницы в транссудации 155 кДа декстрана-TMR (красный) и 10 кДа декстрана-FITC (зеленый). Макрофаги помечены ECFP (Cyan) и коллагена в синем (SHG). Наложение красного 155 кДа декстрана-TMR и зеленый 10 кДа декстран-FITC в сосудистую желтый. Быстрое экстравазация зеленого 10 кДа декстран-FITC пика в 6 мин. Scalе-бар, 50 мкм. Фильм о покадровой микроскопии в кино 2. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Фильм 1. Визуальное спонтанное переходную проницаемость сосудов с покадровой IVM. Покадровый микроскопии (как показано на рисунке 2) транзиторной проницаемости кровеносных сосудов визуализированы в трансгенной MMTV-PyMT мыши с опухолевыми клетками , меченными Dendra2 (MMTV-МСВЗ / CAGCAT -Dendra2 / MMTV-PyMT) и макрофаги , меченные CFP (Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP). Экстравазация 155 кДа декстрана-TMR экстравазации (красный в левой панели, белая правая панель) наблюдается в точке ветвления опухоли кровеносных сосудов. Pсдавать в аренду, нажмите здесь для просмотра этого видео. (Щелкните правой кнопкой мыши для загрузки.)
Фильм 2. Визуальное кровоизлияние нескольких флуоресцентно меченных декстранов путем покадровой IVM. Покадровый микроскопии (как показано на рисунке 3) транссудации 155 кДа декстрана-TMR (красный) и 10 кДа декстрана-FITC (зеленый) в трансгенной MMTV-PyMT мышь с макрофагами , меченных CFP (Csf1r -GAL4VP16 / UAS-ECFP). SHG коллагена помечены синим цветом. Красный 155 кДа декстрана-TMR остается в опухолевой сосудистой для длительности временного промежутка в то время как зеленый 10 кДа декстран-FITC быстро экстравазатов и очищает от кровеносных сосудов и ткани. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы просмотреть это видео. (Щелкните правой кнопкой мыши для загрузки.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Межклеточных взаимодействий, которые происходят спонтанно в микроокружение опухоли может привести к изменениям в опухолевых клеток моторики и intravasation. Высокое разрешение прижизненной визуализации тканей живого опухоли позволяет визуализировать многоклеточных динамики , которые могут быть весьма переходная 10,13,24. Конечная точка в анализах естественных условиях или покадровой изображений , полученных с помощью дискретных моментов времени может обеспечить существенную информацию о молекулярных механизмах процессов в опухоли микроокружения. Исследования прижизненные визуализации были использованы для изучения процессов в микросреды опухоли , которые происходят в течение нескольких дней, создавая новое понимание ангиогенеза, миграции опухолевых клеток и ответ на лечение наркотической 25-30. Тем не менее, эти анализы не могли бы захватить кинетика переходных процессов в опухоли микроокружения в связи с временным масштабом изучаемых процессов 7,31. Отличительный нескольких переходных событий от постоянных процессов является существенным объявлениеПреимущество прижизненной микроскопии.
Прижизненный метод визуализации, описанный в этом протоколе позволяет прямой визуализации клеточной динамики в микроокружение опухоли с помощью флуоресцентной маркировки нескольких линий и клеточных структур. Многофотонная микроскопия позволяет большую глубину изображения по однофотонной конфокальной микроскопии с глубины 300 мкм обычно выполняется 24. Приобретение Z-стеки 50 - 100 мкм с шагом 2 мкм имеет достаточно большой размер , чтобы генерировать 3D - реконструкция клеточных взаимодействий, в том числе выступающих частей , что клетки делают , как они распространяются навстречу друг другу 13 и сосудистых структур в опухоли микроокружения. Фильмы и 3D-реконструкций из последовательностей изображений покадровой позволяют количественному клеточной подвижности (скорости и направленности) и, используя изменения в интенсивности флуоресценции сигнала инъекционные красителей, проницаемости сосудов.
Для того, чтобы захватить зрontaneous клеточных событий, число отдельных изображений, снятых в одной последовательности должны быть оптимизированы для обеспечения скорости получения изображения, который захватывает кинетика события, но также охватывает достаточное физическое пространство, чтобы увеличить вероятность захвата любого отдельного события во время одна последовательность покадровой. Параметры пространственной визуализации, которые необходимо учитывать, включают; количество ломтиков в Z-стека, число полей зрения с Z-стеки, приобретенных и осевого расстояния между отдельными кусочками в Z-стека. Таким образом, установка этих параметров перед началом захвата изображения является важным шагом в протоколе. Использование многофотонный микроскопа, приобретение 30 кадров (500 мкм × 500 мкм) в Z-серии составляет около 60 сек. Поскольку продолжительность наблюдаемого опухолевых клеток intravasation может быть порядка нескольких минут 13, захватив несколько Z-стеки для 3D - реконструкции intravasation, время приобретения Z-стека было ограничено тO 60 сек. Таким образом, одно поле зрения с до 30 срезов в Z-стек был приобретен. Кроме того, так как 3D реконструкция клеток желательно, аксиальный шаг между Z-срезах была установлена на уровне 2 мкм. Это позволяет достаточно информации об объемах ячеек для обеспечения 3D-реконструкции. Эти параметры должны быть оптимизированы для любого программного обеспечения микроскопа и обработки изображений, используемых на основе кинетики живых изучаемых событий.
Модификация резиновой подушечкой на предметный столик микроскопа и хвостовой вены внутривенный катетер оба позволили значительному увеличению времени визуализации. Формы резиновые накладки хорошо для обеспечения поддерживаемой гидратации опухоли при минимизации XY дрейф на покровного стекла. Сочетание нагревательной камеры с введением PBS поддерживает гидратацию и физиологической температуре животных. Эти условия в сочетании поддержания сосудистого кровоснабжения и кровотока, чтобы разрешить расширенный визуализации клеточных событий на опухоль семявыносящегоculature включая проницаемость сосудов и опухолевых клеток intravasation.
Ограничением этого метода является то количество флуоресцентных меток, которые могут быть использованы для визуализации клеток в опухоли микроокружения. Создание трансгенных мышей с дополнительными типами клеток (то есть, эндотелиальные клетки, фибробласты или перицитов) , содержащие флуоресцентный белок может быть трудным и требует много времени. Тем не менее, будущие потенциальные приложения могут использовать комбинацию флуоресцентного мечения белков типов клеток стромы с имплантированными опухолевых клеток и 70 кДа декстрана маркировки макрофагов. Используя сочетание этих нумерующих стратегий и скрещивания трансгенных мышей новые комбинации клеточных меток могут быть сгенерированы для оценки клеточного движения и события в микроокружение опухоли.
В отличие от конечных точек экспериментов, основанных на иммунофлуоресцентного окрашивания, с высокой разрешающей способностью прижизненной микроскопии позволяет визуализировать спонтанным и переходныхсобытия в опухоли микроокружения. Процедура прижизненной визуализации описана здесь раскрывает новые события и клеточные взаимодействия в микросреды опухоли, которые не могут быть расшифрованы от статических изображений. С новой информацией о типах взаимодействующих клеток или процессов, а также кинетики этих событий, гипотезы могут быть созданы для изучения сигнальных путей, которые ведут эти взаимодействия.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Министерством обороны груди Программа исследований рака под номером премии (ясень, W81XWH-13-1-0010), NIH CA100324, PPG CA100324 и Программа комплексной обработки изображений.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 155 kDa dextran-tetramethylrhodamine isothiocyanate | Sigma Aldrich | T1287 | reconstitute at 20 mg/ml in 1x PBS |
| 70 kDa dextran-Texas Red | Life Technologies | D-1830 | reconstitute at 10 mg/ml in 1x PBS |
| 10 kDa dextran-fluorescein isothyocyanate | Sigma Aldrich | FD10S | reconstitute at 20 mg/ml in 1x PBS |
| Qdot 705 ITK Amino (PEG) Quantum Dots | Life Technologies | Q21561MP | Dilute 25 μl in 175 μl of 1x PBS for injection |
| MMTV-PyMT mice | Jackson Laboratory | 2374 | |
| Csf1r-ECFP mice (Csf1r-Gal4/VP16,UAS-ECFP) | Jackson Laboratory | 26051 | |
| Csf1r-EGFP mice | Jackson Laboratory | 18549 | |
| 1x PBS | Life Technologies | ||
| Isoethesia (isoflurane) | Henry Schein Animal Health | 50033 | 250 ml |
| Oxygen | AirTech | ||
| 1 ml syringe, tuberculin slip tip | BD | 309659 | |
| 30 G x 1 (0.3 mm x 25 mm) needle | BD | 305128 | |
| Polyethylene micro medical tubing | Scientific Commodities Inc | BB31695-PE/1 | 0.28 mm I.D. x 0.64 mm O.D. |
| Microscope coverglass | Corning | 2980-225 | thickness 1.5, 22 x 50 mm |
| PhysioSuite MouseSTAT pulse oximeter, software and sensors | Kent Scientific | ||
| Laboratory tape | Fisher Scientific | 159015R | |
| soft rubber pad | McMaster-Carr | 8514K62 | Ultra-Soft Polyurethane Film, 3/16” Thick, 12" x 12", 40 Oo Durometer, Plain Back |
| hard rubber pad | McMaster-Carr | 8568K615 | High-Strength Neoprene Rubber Sheet 1/4" Thick, 12" x 12", 50 A Durometer |
| Microscope | Olympus | The microscope is a custom built two laser multiphoton microscope based on an Olympus IX-71 stand utilizing a 20X 1.05NA objective lens. | |
| 7-Punch set | McMaster-Carr | 3429A12 | 1/4" to 1" Hole Diameter, for Hammer-Driven Hole Punch |
References
- Gerlowski, L. E., Jain, R. K. Microvascular permeability of normal and neoplastic tissues. Microvasc Res. 31 (3), 288-305 (1986).
- Wang, H. -L., Lai, T. W. Optimization of Evans blue quantitation in limited rat tissue samples. Sci Rep. 4, (2014).
- Dvorak, H. F. Rous-Whipple Award Lecture. How tumors make bad blood vessels and stroma. Am J Pathol. 162 (6), 1747-1757 (2003).
- Nagy, J. A., et al. Permeability properties of tumor surrogate blood vessels induced by VEGF-A. Lab Invest. 86 (8), 767-780 (2006).
- Egawa, G., et al. Intravital analysis of vascular permeability in mice using two-photon microscopy. Sci Rep. 3, (2013).
- Yuan, F., et al. Vascular permeability in a human tumor xenograft: molecular size dependence and cutoff size. Cancer Res. 55 (17), 3752-3756 (1995).
- Dellian, M., Yuan, F., Trubetskoy, V. S., Torchilin, V. P., Jain, R. K. Vascular permeability in a human tumour xenograft: molecular charge dependence. Br J Cancer. 82 (9), 1513-1518 (2000).
- Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nat Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
- Entenberg, D., et al. Imaging tumor cell movement in vivo. Curr Protoc Cell Biol. Chapter. 19, (2013).
- Patsialou, A., et al. Intravital multiphoton imaging reveals multicellular streaming as a crucial component of in vivo. cell migration in human breast tumors. Intravital. 2 (2), e25294 (2013).
- Gligorijevic, B., Bergman, A., Condeelis, J. Multiparametric classification links tumor microenvironments with tumor cell phenotype. PLoS Biol. 12 (11), e1001995 (2014).
- Roussos, E. T., et al. Mena invasive (MenaINV) promotes multicellular streaming motility and transendothelial migration in a mouse model of breast cancer. J Cell Sci. 13, 2120-2131 (2011).
- Harney, A. S., et al. Real-Time Imaging Reveals Local, Transient Vascular Permeability, and Tumor Cell Intravasation Stimulated by TIE2hi Macrophage-Derived VEGFA). Cancer Discov. 5 (9), 932-943 (2015).
- Robinson, B. D., et al. Tumor microenvironment of metastasis in human breast carcinoma: a potential prognostic marker linked to hematogenous dissemination. Clin Cancer Res. 15, 2433-2441 (2009).
- Sasmono, R. T., et al. A macrophage colony-stimulating factor receptor-green fluorescent protein transgene is expressed throughout the mononuclear phagocyte system of the mouse. Blood. 101 (3), 1155-1163 (2003).
- Ovchinnikov, D. A., et al. Expression of Gal4-dependent transgenes in cells of the mononuclear phagocyte system labeled with enhanced cyan fluorescent protein using Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP double-transgenic mice. J Leukcocyte Biol. 83 (2), 430-433 (2008).
- Liu, H., et al. Cancer stem cells from human breast tumors are involved in spontaneous metastases in orthotopic mouse models. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (42), 18115-18120 (2010).
- Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. J Vis Exp. (73), (2013).
- Weis, S., Cui, J., Barnes, L., Cheresh, D. Endothelial barrier disruption by VEGF-mediated Src activity potentiates tumor cell extravasation and metastasis. J Cell Biol. 167 (2), 223-229 (2004).
- Wyckoff, J., Gligorijevic, B., Entenberg, D., Segall, J., Condeelis, J.
- Lathia, J. D., et al. Direct in vivo. evidence for tumor propagation by glioblastoma cancer stem cells. PLoS One. 6 (9), e24807 (2011).
- Nakasone, E. S., et al. Imaging tumor-stroma interactions during chemotherapy reveals contributions of the microenvironment to resistance. Cancer Cell. 21 (4), 488-503 (2012).
- Dreher, M. R., et al. Tumor vascular permeability, accumulation, and penetration of macromolecular drug carriers. J Natl Cancer Inst. 98 (5), 335-344 (2006).
- Wyckoff, J. B., et al. Direct visualization of macrophage-assisted tumor cell intravasation in mammary tumors. Cancer Res. 67 (6), 2649-2656 (2007).
- Chittajallu, D. R., et al. In vivo. cell-cycle profiling in xenograft tumors by quantitative intravital microscopy. Nat Methods. 12 (6), 577-585 (2015).
- Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nat Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
- Yano, S., et al. Spatial-temporal FUCCI imaging of each cell in a tumor demonstrates locational dependence of cell cycle dynamics and chemoresponsiveness. Cell Cycle. 13 (13), 2110-2119 (2014).
- Yang, M., Jiang, P., Hoffman, R. M. Whole-body subcellular multicolor imaging of tumor-host interaction and drug response in real time. Cancer Res. 67 (11), 5195-5200 (2007).
- Manning, C. S., et al. Intravital imaging reveals conversion between distinct tumor vascular morphologies and localized vascular response to Sunitinib. Intravital. 2 (1), 24790 (2013).
- Alexander, S., Koehl, G. E., Hirschberg, M., Geissler, E. K., Friedl, P. Dynamic imaging of cancer growth and invasion: a modified skin-fold chamber model. Histochem Cell Biol. 130 (6), 1147-1154 (2008).
- Brown, E. B., et al. In vivo. measurement of gene expression, angiogenesis and physiological function in tumors using multiphoton laser scanning microscopy. Nat Med. 7 (7), 864-868 (2001).
