Introduction
Механизмы, с помощью которых кишка регламентирует диетическую обработку липидов, печень контролирует сложный синтез липидов и липопротеинов обмен веществ, и как эти органы работают с центральной нервной системой, чтобы контролировать потребление пищи не полностью поняты. Это биомедицинской интерес для выяснения этого биологии в свете нынешних эпидемий ожирения, сердечно-сосудистых заболеваний, диабета и неалкогольного жировой болезни печени. Исследования в культуре клеток и мыши обеспечили большую часть нашего понимания механистических отношений между диетическими липидов и болезни, и данио (Danio rerio) появляются в качестве идеальной модели , чтобы дополнить эту работу.
Рерио имеют аналогичные органы желудочно - кишечного тракта (ЖКТ), липидный обмен и липопротеинов транспорт до высших позвоночных 1,2, быстро развиваются, и генетически послушный. Оптическая прозрачность личиночной данио облегчает в естественных условиях исследования, A particulaг преимуществом для изучения системы GI как его внеклеточной среде (то есть, желчи, микрофлора, эндокринные сигнализации) практически невозможно смоделировать ех естественных условиях. В соответствии, орган исследований объединения генетического удобство манипулирования и факторов, способствующих выполнению живых изображений данио личинок с разнообразие диетических манипуляций ( с высоким содержанием жиров 3,4, -холестерина 5 и -carbohydrate диет 6,7), а также модели сердечно - сосудистых заболеваний 8, диабет 9,10, стеатоз печени 11-13, 14-16 и ожирение, появляются, чтобы обеспечить множество метаболических идей.
Важным аспектом перехода личиночной данио в метаболические исследования является оптимизация методик, разработанных в других модельных животных к данио и разработке новых анализов, которые используют уникальные сильные стороны данио. Этот протокол представляет методы разработаны и оптимизированы, чтобы накормить личиночной данио липиd-богатая пища, визуализировать диетическую обработку липидов от всего тела к внутриклеточной резолюции, и измерить потребление пищи. Куриный яичный желток был выбран, чтобы составить с высоким содержанием липидов пищи, как она содержит большое количество жиров и холестерина (липидов составляют ~ 58% из куриного желтка, из которых ~ 5% холестерина, 60% являются триглицеридами, а 35% являются фосфолипиды ). Куриный яичный желток содержит больше жира , чем обычные коммерческие данио микропеллет продуктов питания (~ 15% липидов) и тем преимуществом , что она представляет собой стандартизированный корм с известными процентным содержанием определенных видов жирных кислот, так как данио диеты и кормления полки не были стандартизированы в лабораториях 17. Кроме того, флуоресцентные аналоги липида , представленные в яичном желтке визуализации транспорта и накопления пищевых липидов 18, изображение клеточных компонентов , включая липидные капли, действуя как в качестве жизненно важных красителей 3 и через ковалентного включения в сложные липиды, исследовать метаболизм через тонкослойной хроматографии (ТСХ) 19 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Эти протоколы были одобрены Институт Карнеги институциональной уходу и использованию животных комитета (Протокол №. 139).
1. Подготовка животных
- Поддерживать взрослые особи и личинки при 28 ° С на 14 ч: 10 ч света: темный цикл. Поток взрослых два раза в день с оболочкой свободной артемии (декапсулируются, не-штриховкой, начиная с 14 DPF) и коммерческих микрогранул.
- Эти протоколы оптимизированы для использования 6-7 личинок DPF, собранных естественном нересте фона АВ. Протоколы могут быть модифицированы для личинок других возрастов и профессий. Не обеспечивают экзогенных пищу до 6 DPF.
- Обезболить личинок с Tricaine в зародыше средах (EM) (4,2 мл 4 мг / мл Tricaine на 100 мл ЭМ) при комнатной температуре (RT).
2. Получение богатых липидами яичный желток поток
- Подготовить и хранить куриные желтки. Отделить желток и белый 12 куриных яиц. Бассейн желтки, аликвоту 1 мл в 1,5трубки мл, и хранят при -80 ° С до 1 года (12 желтков составит 80 ~ аликвот). Бассейн белых, хранить и использовать в качестве липидного бедных, богатых белком корма.
- Готовят флуоресцентный аналоговый (ы) липида быть добавлены к сырью яичного желтка, при желании.
- Приостановка купленную, порошкообразный флуоресцентный аналог липида в 100% этаноле или 100% хлороформа при 0,1 мкг / мкл (см следующую записку растворителей), обсуждая, аликвоты в непрозрачные стеклянные трубки, печать с парафином, и хранить в соответствии с инструкциями изготовителя. Из-за быстрого испарения органических растворителей, не используют объемы аликвотных меньше, чем ~ 400 мкл в течение длительного хранения.
Примечание: Если аналоговый липидный суспендируют в этаноле, большие объемы аналога липида будут использоваться , поскольку она сохнет быстрее под N 2 , чем хлороформ. Если аналоговый липидный взвешивают в этаноле он не должен быть высушен и ресуспендировали перед его добавлением в корм липосом на этапе 2.2.4, но общая концентрация этанола не должно превышать 0.1% в корм липосом, чтобы избежать потенциально вмешивающихся физиологические эффекты этанола. - Для получения аналогов флюоресцентных жирных кислот: Приготовьте общий объем 20 мл 5% -ного яичного желтка эмульсии в ЭМ. Из того, что готовят 5 мл аликвоты с конечной концентрации 6,4 мкМ 4,4-дифтор-4-Bora-3а, 4а-диаза-s-индацен (BODIPY C 16) для живой конфокальной микроскопии и приема пищи анализов или 1 мкг / мл BODIPY C 12 для работы с изображениями стереомикроскопа. Перенести желаемое количество флуоресцентного аналога липида в 1,5 мл пластиковую пробирку. Сушат липидов в потоке N 2, следя за тем, чтобы не дуть липида из трубки.
- Немедленно, ресуспендируют в 5 мкл 100% этанола с помощью пипетки поток вниз по стенкам пробирки, добавляют 95 мкл EM, и хорошо перемешать.
Примечание: Смесь должна появиться однородная; если цветные липидный остается по бокам трубки или жидкость появляется массивно, липид не полностью солюбилизировать и требует большего количества этанола. Защитить трубку сюдам свет и хранить на льду. - Для флуоресцентного аналога холестерина: подготовить конечной концентрации 2,4 мкг холестерина / мл в 5 мл 0,5-5% эмульсии яичного желтка для исследования живых изображений. Перенести желаемое количество холестерина в пластиковую пробирку на 1,5 мл. Сушат липидов в потоке N 2, следя за тем, чтобы не дуть липида из трубки.
- Сразу же, ресуспендируют в 15 мкл RT 100% этанола с помощью пипетки поток по стенкам трубы и смешивают с 85 мкл RT 1% не содержащего жирных кислот бычьего сывороточного альбумина в очищенной H 2 O. Защитите трубу от света и хранить на льду.
- Приостановка купленную, порошкообразный флуоресцентный аналог липида в 100% этаноле или 100% хлороформа при 0,1 мкг / мкл (см следующую записку растворителей), обсуждая, аликвоты в непрозрачные стеклянные трубки, печать с парафином, и хранить в соответствии с инструкциями изготовителя. Из-за быстрого испарения органических растворителей, не используют объемы аликвотных меньше, чем ~ 400 мкл в течение длительного хранения.
- Приготовьте желток липосомная поток.
- Добавьте талой аликвоты яичным желтком до ЕМ в 50 мл коническую трубку. Vortex разбавленный смесь яичного желтка в течение 1-2 мин; смесь должна, как представляется, гомогенной эмульсии.
- Вылейте смесь через сито с мелкими отверстиями для удаления белковых конгломератов и собрать в новом, свежем 50 мл коническую трубку.
- Pulse Соникат.е смесь яйца с одной четверти дюйма коническим микроострия (5 раз (5 х 1 сек на 1 сек выкл) приостановка 5-10 сек между каждым набором; интенсивность выхода: 6 Вт) при комнатной температуре, чтобы создать липосом. Параметры питания ультразвуковом зависят инструмент и, следовательно, требуют оптимизации для каждого инструмента и микроострия.
Примечание: Постоянно качаться липосомная смесь при комнатной температуре, чтобы поддерживать гомогенность до использования.
- Добавьте флуоресцентный аналог липида к желтка липосом яиц, если это необходимо. Сразу же после обработки ультразвуком, пипеткой заготовленные липиды в липосому смеси и вихря на высокой скорости в течение 30 секунд, чтобы включить в липосомы. Защитите смесь от света, обернув трубку в фольгу и продолжают встряхивании при комнатной температуре.
3. Кормление Paradigm
- Подготовка Личинки для кормления.
- До начала подачи, личинки экрана для очевидных морфологических дефектов, которые могут препятствовать кормление. Личинки Передача до 60 мм х 15 мм чашки Петри или 6- или 12-луночного опалубTES, уменьшить ЕМ к минимуму, и заменить 5 мл приготовленного раствора липосом.
- При необходимости передавать ненакормленный личинок управления до 5 мл ЕМ и / или 5 мл 5% яичного белка в ЕМ и лечения параллельно.
- Осторожно покачайте личинки в качестве инкубированных коромысла (29-31 ° C при 30 оборотах в минуту) в течение всего корма, чтобы стимулировать потребление пищи, продолжая защищать от света, если флуоресцентные аналоги липида присутствуют. Если личинки необходимости подвергаться воздействию света, минимизировать экспозицию с тонированного стекла инкубатор крышкой.
- В конце периода кормления, полоскать свободно плавание личинок в ЕМ 3 раза.
Примечание: Личинки могут начать потреблять липосом в любой момент во время подачи. Если это важно, что личинки начинается подача в то же время, экран для приема пищи (см 3.4) после 1 часа кормления и возвращают только личинки, которые приступили к подаче яичного желтка эмульсии для завершения подачи. - Экран личинок на данный момент для приема пищи, как небольшое число не может еат (обычно ~ 0-5%). Проверьте кишечник личинок , которые были наркозом или слегка охлажденным на металлическом блоке на льду , чтобы определить , есть ли они кормили: личинки , которые потребляли липосом будут иметь затемненную кишечник (рисунок 1).
- Изображение или процесс личинок для приема пищи сразу. С другой стороны, место личинок в свежем ЕМ и инкубировать при 28 ° С, чтобы обеспечить обработку обмена веществ происходить.
4. Монтаж Личинка живых изображений
- Подготовить монтируемого Media.
- Для 3% метилцеллюлозы: добавляют 0,75 г метилцеллюлозы в 25 мл вблизи кипения Е.М., вихря, скалы при комнатной температуре 2-3 дня до полного растворения, и хранят при температуре 4 ° С в течение многих лет при -20 ° C. Повторные циклов замораживания и оттаивания при температуре 4 ° C будет удалить пузырьки воздуха. Хранить 3% метилцеллюлозы на льду во время монтажа личинки.
- Для 1,2% низкой горы агарозы: добавить 0,3 г легкоплавкой агарозы до 25 мл ЭМ и растворяют путем доведения до кипения, Алиготе в 2 мл тмассовые рассылки, и выдерживают при 26-28 ° С на тепловом блоке. Неиспользованные аликвоты можно хранить при комнатной температуре или при -20 ° С и снова варят в момент использования. Убедитесь, что агарозы достаточно прохладно, чтобы обращаться, прежде чем подвергать личинок или они могут быть чрезмерно нагреваться.
- Для низкого увеличения, средней пропускной способности живого изображения, поместите предметное стекло на ткани на металлическом блоке на льду и ждать слайд, чтобы остыть. Применяют щедрое количество 3% метилцеллюлозы (который поддерживали при 4 ° С на льду) на слайде, передать личинку на 3% метилцеллюлозы, используя лески покер (0,41 мм рыболовное диаметр линии приклеены к конец капиллярной трубки стеклянной) создают для слива и поклялся избыток EM (так что метилцеллюлозы не будет размыта) и положение личинок по желанию.
- Для кратковременного (<20 мин), с высоким увеличением живой визуализации с вертикально цели масла всплытии, смонтировать личинок с покровным пристройке к методу.
- Используйте клей на основе цианакрилатный (суперклей), чтобыприсоединять аа 22 х 30 мм покровным к одному концу предметного стекла. Используйте кочергу, чтобы положить тонкую линию 3% метилцеллюлозы на слайде, примыкающей к покровным и переносят личинки на слайд с широким отверстием Пастера пипеткой. Удалите излишки EM, поэтому он не будет разбавлять метилцеллюлозы.
- Использование покер, аккуратно поместите личинки в метилцеллюлозы на их сторонах (левая сторона до изображения больше, печени, правой стороной вверх к изображению желчного пузыря) с их головами рядом с покровным.
- Пятно суперклей в углах второго покровного и аккуратно поместите один край покровного стекла на смонтированном покровное, а другой на слайде, преодоление личинок. Будьте осторожны, чтобы не применять избыточное давление во время этого шага или с целью в то время как изображения, так что личинки остаются неповрежденную.
- Для долгосрочной перспективе, с высоким увеличением изображения с вертикальным иммерсионного объектива, крепление личинок в агарозы. Добавьте личинку в небольшую аликвоту 1,2% агарозном низкой расплава выполняться передачаЛичинка в небольшом объеме агарозы в чашке Петри.
- Быстро поместите личинки кочергой перед агарозном затвердевает. Дайте агарозы высохнуть в течение 2-3 мин и покрыть агарозы полностью свежим ЭМ, чтобы предотвратить его от высыхания.
- Для долгосрочной перспективе, с высоким увеличением изображения с перевернутого объектива, крепление личинок на стеклянным дном блюдо в агарозы.
- Охлаждают металлический блок на льду. Поместите блюдо на металлический блок, разделенных тканью, чтобы предотвратить чрезмерное охлаждение и замораживание личиночной. Передача личинку на блюдо и удалить EM путем затекания с тканью.
- Поместите каплю 28 ° C легкоплавкой агарозы (1,2%) на верхней части личинки и сразу же расположить кочергой (слева вниз, чтобы лучшим образом печени, с правой стороны вниз к изображению желчного пузыря). Удалить блюдо из холодного блока, дайте высохнуть в течение 2-3 мин, и добавить достаточный объем свежего ЕМ, чтобы покрыть агарозы (~ 2-5 мл).
5. Потребление продуктов питанияанализ
- В конце корма липосом яичного желтка , содержащего 6,4 мкМ BODIPY C 16, бассейн как минимум 10 промытого личинок в пластиковом 1,5 или 2 мл трубки, удалите EM, и оснастки заморозить. Образцы могут храниться при температуре -80 ° С в защищенном от света месте в течение нескольких месяцев.
Примечание: Если это возможно, собрать несколько повторов. Важно, чтобы собрать ненакормленный личинок на этой стадии нормализации для фона липидного флуоресценции (в идеале личинок из той же муфты используются). - Выполните модифицированный Блай-Дайера экстракции липидов 3,21.
- Добавьте 100 мкл буфера дл гомогенизации (20 мМ Трис-Cl, 1 мМ ЭДТА) к образцу на льду ( в альтернативном варианте очищенный H 2 O может быть использован). Перемешать на льду с микроострия ультразвуковом (5 сек всего: 1 сек на 1 сек в выключенном состоянии). Убедитесь, что личинки полностью гомогенизируют; если нет, то повторить. Перенесите в 13 мл одноразового использования стеклянной культуральную пробирку (могут быть использованы и другие стеклянные трубки).
Примечание: Хлороформ является опасным; выполнить все последующие липидный ехшаги тяги при комнатной температуре в химическом капюшоном. - На каждые 100 мкл буфера дл гомогенизации, используемых, добавляют 375 мкл 1: 2 (хлороформ: метанол). Vortex 30-60 сек, инкубировать 10 мин, добавляют 125 мкл хлороформа в 100 мкл буфера для гомогенизации используется, и вихрь 30 сек.
- Добавить 125 мкл 200 мМ Трис рН 7,5 на 100 мкл буфера для гомогенизации, используемой вихревой 30 сек, и центрифуге (2000 х г, 5 мин, RT, защищенном от света месте ). Осторожно удалите образцы из центрифуги. Они будут разделены на две фазы: верхнюю фазу представляет собой водный раствор, интерфейса личиночной мусора, и нижнюю органическую фазу (содержит липиды).
- С чистой стеклянной пипеткой собирают на дно, органическую фазу и перенести его в чистую стеклянную трубку 13 мл.
Примечание: Будьте осторожны, чтобы избежать водной фазы и личиночной мусора на границе раздела; если происходит загрязнение, повторите шаг центрифугирования и вспомню. Отбросить верхнюю водную фазу; это может быть полезно, чтобы удалить и выбросить этотфаза перед сбором органической фазы. Образец можно хранить при температуре -80 ° С в течение до 1 месяца. - Органическую фазу сушат в вакууме (0,12 атм), защищая от света. Не продолжайте сушить образцы после того, как жидкость испарится, как это приведет к снижению растворимости в липидах. Ресуспендируют липиды в соотношении 2: 1 (хлороформ: метанол) и хранить его на льду. Оптимальный объем хлороформа: метанола раствор, зависит от способа обнаружения, используемого; начать с низким и продолжают разбавить по мере необходимости. Общее правило заключается в использовании 10 мкл 10 складочном личинок.
- Добавьте 100 мкл буфера дл гомогенизации (20 мМ Трис-Cl, 1 мМ ЭДТА) к образцу на льду ( в альтернативном варианте очищенный H 2 O может быть использован). Перемешать на льду с микроострия ультразвуковом (5 сек всего: 1 сек на 1 сек в выключенном состоянии). Убедитесь, что личинки полностью гомогенизируют; если нет, то повторить. Перенесите в 13 мл одноразового использования стеклянной культуральную пробирку (могут быть использованы и другие стеклянные трубки).
- Пятно целые тома образца в равномерно расположенных интервалах на каналированной пластину ТСХ и сканировать пластину с лазерным сканером , которые обычно используются для визуализации биомолекул (например, флуоресцентный планшет - ридер). Для получения флуоресцентных аналогов липидов, включенных в перечень материалов, которые имеют максимумы возбуждения от 500-650 нм и испускания максимумов от 510-665 нм, используют лазер 488 нм и с коллекцией излучения на длине волны 520 нм,
- Количественная общей флуоресценции каждого пятна с программным обеспечением обработки изображений.
Примечание: Правильно для естественного происхождения фона липидный флуоресценции путем вычитания флуоресценции парных, личиночной образцов голодных.
- Количественная общей флуоресценции каждого пятна с программным обеспечением обработки изображений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
При подаче на качалке при 29-31 ° С, большинство здоровых личинок (≥95%) будет есть в течение 1 часа. При потребляя яичный желток эмульсии, личиночной кишечника темнеет. Очень темные кишок можно наблюдать на 2 ч (рисунок 1). Если личинки ненакормленный или не кормить, кишечник остается ясным. Личинки кормили яичный белок обнаруживают растянутый просвет кишечника, который не темнеет в цвете.
Рисунок 1:. Скрининг Личинка приема пищи дикого типа 6-DPF личинок кормили 5% яичного желтка в EM в течение 2 часов или обрабатывают параллельно в EM , чтобы получить ненакормленный управления. Голодной личинки имеют четкие кишок в то время как кормят личинок, которые потребляли яичный желток имеют темные кишок, когда изображается в 10х на стереоскоп. Масштабные столбики представляют 0,1 мм.Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Кормление с люминесцентными аналогами липида позволяет визуализировать системного транспорта и внутриклеточной накоплению пищевых липидов. Флуоресцентный сигнал присутствует в течение пищеварительных органов (кишечник, печень, и поджелудочная железа) личинок кормили 5% яичного желтка с 6,4 мкМ флуоресцентной C 16 аналога в течение 8 ч , установленного с покровным пристройке методом и визуализируют с помощью вертикальной цели (рис 2) 3.
Рис . 2: Люминесцентные липида аналогах Visualize Диетические липида Транспорт представитель составное изображение 6-DPF личинка (голова венке вправо) подается 5% яичного желтка в EM с 6,4 мкМ BODIPY FL C 16 в течение 8 часов. Личинки был установлен в 3% метилцеллюлозы с помощью покровного наклоняться к способу и визуализируют с помощью вертикально 63X Цель погружения нефти на однофотонной конфокальной микроскопии с аргоновым лазером. Масштабные столбики представляют 20 мкм. Печень, L; кишечник, I; поджелудочной железы, Р, желчный пузырь, GB; перепечатано с разрешения Dev Bio 3. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Различные липидные аналоги позволяют визуализировать уникальных наборов клеточных структур , так как они по- разному метаболизируется в сложные липиды (т.е. триглицеридов, эфиров холестерина, фосфолипидов). После 4 - 8 ч каналы, флуоресцентный C 16 и C 12 аналоги маркировать липидные капли, FL C 5 этикетки капель флуоресцентных липидных, печеночная и протоках поджелудочной железы, клеточных мембран, а также артериальные сети и флуоресцентные C 2 аналоговых этикетки печени и протоках поджелудочной железы и сотовой связи мембраны (рис 3) 3.
ove_content "ВОК: Keep-together.within-странице =" 1 ">
Рис . 3: различные флуоресцентные липидные аналогах Этикетка Уникальные Клеточные Органов Представительные композитные изображения личинок кормили 5% яичного желтка в EM с 6,4 мкМ BODIPY FL C 16, C 12, C 5 или C 2 в течение 4-8 ч (6 DPF) , С 16 аналоговых наблюдается в липидных капель (LD) энтероцитов, C 12 и C 5 аналогов в энтероцитов LD и просвет кишечника, и C 2 аналога в просвет кишечника. Личинки были установлены в 3% метилцеллюлозы с помощью покровного наклоняться к способу и визуализируют с помощью вертикально 63x цели иммерсионным на одиночный фотон конфокальной микроскопии с аргоновым лазером. Масштабные столбики представляют 20 микрон. Печатается с разрешения снадобья Discov Сегодня Dis Модели 22._blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Личиночной анализ потребления пищи была разработана, чтобы исследовать, как генетические мутации, трансгенного гена гиперэкспрессия и / или экзогенными лечение влияют личиночной потребление пищи. Личинки питаются богатой липидами еду подсыпали флуоресцентного аналога липида, чтобы указать количество потребляемой пищи. Ненакормленный личинки собирают параллельно нормализуют для количества фоновой флуоресценции, присутствующей в личинок, повышение чувствительности, при котором флуоресцентный аналоговый липид может быть обнаружен. Этот анализ был использован, чтобы показать, что избыточная экспрессия аполипопротеина А-IVb.1 (апо-IVb.1) уменьшает потребление пищи. Ранее ненакормленный Tg (hsp70: апоА-IVb.1: mCherry) личинки кормили 10% яичного желтка с 6,4 мкМ флуоресцентной C 16 аналога в течение 4 ч при 7 DPF потребляется примерно на 30% меньше , чем липиды личинок дикого типа (Рисунок 4) 20.
Рис . 4: Представитель приёма пищи Анализ дикого типа (WT) и Tg (hsp70: апоА-IVb.1: mCherry) (Tg) личинок кормили 10% куриного желтка с 6,4 мкМ BODIPY FL С16 в течение 4 ч (ФРС) или обрабатывают параллельно в EM (голодной). (А) Личинки объединяли (N = 10), липиды экстрагировали, а экстракты пробы наносили на пластинку ТСХ. (B) Всего флуоресценции количественно, выраженное в произвольных единицах флуоресцентных (AFU), нормированные для фоновой флуоресценции в голодных братьев и сестер вычитанием, и выражали относительно WT. Tg личинки гиперэкспрессией АпоА-IVb.1 глотают меньше флуоресцентно меченных аналогов липида , как показано в сравнении с WT (парный Т-тест Стьюдента, р <0,001; п = 9, 20 личинок на эксперимент). Коробка представляет собой 25-75 - й процентили, и средний показатель указывается. Усы показывают 10-90 - й процентили. переизданныйс разрешения Дис модели Меха 20. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Методы, описанные здесь, позволяют исследователям для лечения личиночной данио с богатой липидами корма, визуализировать диетическое обработку липидов в живых личинок, и количественно личиночной потребление пищи. Для того, чтобы обеспечить успех, особое внимание следует уделить несколько важных шагов. Коммерческие куриные яйца различаются; чтобы свести к минимуму потенциальную изменчивость мы выполняем все анализы на органические яйца из клетки свободных кур, которые не были обогащенные для омега-3 жирных кислот. Более низкие показатели кормления могут наблюдаться у рыб моложе 6 денье с остальными эндогенные запасы желтка энергии, нездоровое рыбу или рыбу с мутациями в области развития , которые препятствуют потребление пищи (то есть, челюсть или кишечника пороки развития, неспособность плавать должным образом). Лаборатория Фарбер в целом выполняет кормления исследования на 6-7 дней после оплодотворения (DPF), поскольку личинки не требуют экзогенной пищи, пока их эндогенные желток магазины не будут исчерпаны и истощение желток позволяет для лучшей визуализации пищеварительной системы. вскармливаниепри комнатной температуре также значительно уменьшает количество личинок, которые питаются. Отсутствие личинок экрана для приема пищи и непреднамеренного включения голодной личинок в последующих экспериментах могут запутать результаты. Кроме того, важно, чтобы защитить флуоресцентные аналоги липида и всех личиночных образцы, подаваемые с аналогами, от света, когда это возможно, чтобы поддерживать максимальную флуоресценцию, и, таким образом, для анализа чувствительности. Наконец, если прием пищи будет измеряться, не позволяют кормить и Погоня (после подачи период метаболизма) превышает в общей сложности 4 часа, так как еда начнет выделяться. В настоящее время, скорость, с которой еда и связанные с флуоресцентной липидные аналоги из организма неизвестна, но флуоресценция может сохраняться на протяжении всего тела личинки, по крайней мере, 2 дней столба подачи (МСС и SAF неопубликованные данные).
Есть несколько способов, чтобы изменить и устранять неполадки протоколы, чтобы ответить на экспериментальные вопросы, представляющие интерес. С высоким содержанием липидов корма может быть выполнена в течение различных периодов TИМЕ: 1 час обеспечит небольшую еду, в то время как 4 часа заполнит кишечник с большим количеством липидов. Тем не менее, кормление личинок дольше , чем 6 часов не рекомендуется в качестве желтка и EM не подготовлены в стерильных условиях и избыточного бактериального роста в яичном желтке / белая эмульсия может запутать результаты (то есть, увеличение воспаление, измененную кишечную профиль микрофлора). Личинки могут быть рассмотрены сразу после кормления, чтобы исследовать острые эффекты Личинки питаются иммобилизованного путем кратковременного охлаждения или анестезии быстро начинают кормить снова после согревания, но охлаждение является предпочтительным методом иммобилизации как личинок, может показывать рвоты после анестезии (SAF неопубликованное наблюдение). В качестве альтернативы, периоды чейз может быть осуществлено после подачи для обеспечения транспортировки и метаболизма пищевых липидов перед включением в исследование. Хотя каналы, как правило, проводят в растворе липосом 5 мл, корма были успешно проведены в объемах от 1 до 20 мл. Различные концентрациис яичного желтка можно использовать для личиночной кормов; лаборатория Фарбер регулярно проводит эксперименты с 5% яичного желтка (1 мл яичный желток добавляют к 19 мл ЕМ), 0,5% яичного желтка и 10% яичного желтка.
Есть потенциальные ограничения флуоресцентных аналогов липидов, которые необходимо учитывать. При выборе флуоресцентного аналога липида, важно рассмотреть, как липид физиологически обрабатывается и где флуоресцентный фрагмент находится на химической структуре липидного при интерпретации результатов. Например, триглицериды расщепляются на свободные жирные кислоты и глицерин, а также сложные эфиры холестерина в свободный холестерин и жирные кислоты, в просвет кишечника перед всасыванием. Таким образом, если флуоресцентный триглицерид или сложный эфир холестерина аналоговая содержится в рационе флуоресценция наблюдается в организме будет отслеживать и жирной кислоты, свободного холестерина, или глицерин, что флуоресцентный часть присоединена к, а не оригинальный триглицерид или сложный эфир холестерина. Различные fluorescenт липидные аналоги маркировать уникальные клеточные структуры, и этот факт следует учитывать при выборе 3. Следует также отметить, по сравнению с метаболизмом нативных жирных кислот, добавление фрагмента BODIPY примерно эквивалентно добавлению ~ 2-3 атомами углерода, к длине цепи жирных кислот (ФСП неопубликованные данные).
Методы, описанные здесь, представляют собой значительный прогресс по сравнению с предыдущими анализов, описанных в этой области. До начала разработки этого куриного яйца корма желтка, две рукописи детальных исследований , в которых личинки кормили питанием вкрутую яичный желток 4,23. Техника, описанная здесь, дает преимущество, что яичный желток не нужно быть вкрутую и порошкообразный перед употреблением и порошковый яичный желток имеет очень короткий период полураспада благодаря своему быстрому окислению. Жидкий яичный желток также могут быть приготовлены в виде липосом, которые с готовностью принимают флуоресцентные аналоги липида для эффективного диетического доставки. В качестве альтернативы, радиоактивно меченные липиды могут быть использованы для инвеtigate диетическое метаболизм липидов и измерить потребление пищи, но флуоресцентные аналоги липида не представляют угрозы безопасности, связанные с радиоактивностью. Тем не менее , если исследователи хотят использовать радиоактивно меченных липидов, лаборатория Фарбер провели исследования с целью проверки того, что радиоактивно меченные липиды могут быть включены в, и успешно кормили, липосом 19. Флуоресцентные аналоги липида, описанные здесь, были выбраны потому, что они показывают очень похожи на метаболизм эндогенных и меченных липидов, и были достаточно ярким для низко- и обработки изображений высокой мощности.
Предшествующая развитие этой методики , чтобы кормить флуоресцентные аналоги липида к личинкам, никакие другие методы не были доступны для визуализации диетическое транспорт липидов и накопление в естественных условиях. Прямая визуализация флуоресцентных аналогов липидов может обеспечить преимущество по сравнению с использованием косвенных мер физиологии, таких как липиды сыворотки. Точное измерение потребления пищи личиночной данио также давно STAвызов в дача области. Единственной альтернативой было культуры парамеции, маркировать их с флуоресцентным липофильных трассирующими 4- (4- (didecylamino) стирилового) - N - метилпиридини (4-Di-10-ASP), позволяют личинки кормить, и измеряют флуоресценцию внутрибрюшного зона с читателем 24 пластины. Наконец, эти методы имеют преимущество быть применимы к обоим экранам средней пропускной способности (т.е. вперед генетические экраны диетического обработки липидов), а также исследования изображений сосредоточены с высоким увеличением (т.е. обратная генетические, гипотезах исследования). В будущем, эти методы могут быть применены к фенотипу и скрининга различных моделей метаболических и желудочно-кишечного заболевания у данио.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulofnate salt) | Sigma-Aldrich | A5040-25G | Anesthesia for larval zebrafish |
| Chicken eggs | N/A | N/A | Organic, cage-free eggs, not enriched for omege-3 fatty acids |
| Ultrasonic processor 3000 sonicator | Misonix, Inc. | S-3000 | To make egg yolk liposomes |
| Sonabox acoustic enclosure | Misonix, Inc. | 432B | To make egg yolk liposomes |
| 1/8” tapered microtip | Misonix, Inc. | 419 | To make egg yolk liposomes |
| Amber vials (4 ml, glass) | National Scientific | 13-425 | Lipid storage; includes vials, open-top caps, and cap septa |
| Incu-Shaker Mini | Benchmark | 1222U12 | Incubated shaker for feeds |
| BODIPY FL C16 | Thermo Fisher Scientific | D3821 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Hexadecanoic Acid) |
| BODIPY FL C12 | Thermo Fisher Scientific | D3822 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Dodecanoic Acid) |
| BODIPY FL C5 | Thermo Fisher Scientific | D3834 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Pentanoic Acid) |
| BODIPY FL C5 | Thermo Fisher Scientific | D2183 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Propionic Acid) |
| TopFluor cholesterol | Avanti Polar Lipids Inc. | 810255 | Fluorescent lipid analog; 23-(dipyrrometheneboron difluoride)-24-norcholesterol |
| Fatty acid-free BSA | Sigma-Aldrich | A0281-1G | For TopFluor cholesterol solubilization |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0387 | Mounting media for live larval imaging; 75 x 25 x 1 mm |
| Low melt agarose | Thermo Fisher Scientific | BP165-25 | Mounting media for live larval imaging; 22 x 30 |
| VWR microscope slides | VWR | 16004-422 | Mounting larvae for live imaging |
| Coverslips | Cover Glass | 12-544A | Mounting larvae for live imaging |
| Super glue | Loctite | LOC01-30379 | Mounting larvae for live imaging |
| FluoroDish (glass bottom dish) | World Precision Instruments, Inc. | FD35-100 | Mounting larvae for live imaging; 35 mm dish, 23 mm glass, 0.17 mm glass thickness |
| Confocal microscope | Leica Microsytems | SP-2, SP-5 | Microscope for high magnification live imaging |
| Stereoscope | Nikon | SM21500 | Microscope for low magnification live imaging |
| Glass culture tubes | Kimble | 73500-13100 | Lipid extraction; (13 x 100 mm; 13 ml) |
| Savant SpeedVac Plus | ThermoQuest | SC210A | Lipid extraction |
| Channeled TLC plates | Whatman Scientific | WC4855-821 | Food intake assay; LK5D Silica Gel 150 A, 20 x 20 cm, 250 um thick; Discontinued |
| Channeled TLC plates | Analtech, Inc. | 66911 | Food intake assay; Direct replacement for Whatman Scientific TLC plates |
| Typhoon 9410 Variable Mode Imager | GE Healthcare | 9410 | Fluorescent plate reader for food intake assay |
| ImageQuant software | GE Healthcare | 29000605 | Analysis of food intake assay |
| 5 3/4’ Wide bore, borosilicate disposable pasteur pipets | Kimble | 63A53WT | Transfering larvae |
References
- Carten, J. D., Farber, S. A. A new model system swims into focus: using the zebrafish to visualize intestinal metabolism in vivo. Clin Lipidol. 4 (4), 501 (2009).
- Babin, P. J., Vernier, J. M.
- Carten, J. D., Bradford, M. K., Farber, S. A. Visualizing digestive organ morphology and function using differential fatty acid metabolism in live zebrafish. Dev Biol. 360 (2), 276-285 (2011).
- Marza, E., et al. Developmental expression and nutritional regulation of a zebrafish gene homologous to mammalian microsomal triglyceride transfer protein large subunit. Dev Dyn. 232 (2), 506-518 (2005).
- Stoletov, K., et al. Vascular lipid accumulation, lipoprotein oxidation, and macrophage lipid uptake in hypercholesterolemic zebrafish. Circ Res. 104 (8), 952-960 (2009).
- Fang, L., et al. Programming effects of high-carbohydrate feeding of larvae on adult glucose metabolism in zebrafish, Danio rerio. Br J Nutr. 111 (5), 808-818 (2014).
- Wang, Z., Mao, Y., Cui, T., Tang, D., Wang, X. L. Impact of a combined high cholesterol diet and high glucose environment on vasculature. PLoS One. 8 (12), 81485 (2013).
- Fang, L., et al. In vivo visualization and attenuation of oxidized lipid accumulation in hypercholesterolemic zebrafish. J Clin Invest. 121 (12), 4861-4869 (2011).
- Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies. Dev Dyn. 236 (4), 1025-1035 (2007).
- Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase. Mech Dev. 124 (3), 218-229 (2007).
- Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation. Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).
- Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease. Development. 132 (15), 3561-3572 (2005).
- Matthews, R. P., et al. TNFalpha-dependent hepatic steatosis and liver degeneration caused by mutation of zebrafish S-adenosylhomocysteine hydrolase. Development. 136 (5), 865-875 (2009).
- Oka, T., et al. Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity. BMC Physiol. 10, 21 (2010).
- Chu, C. Y., et al. Overexpression of Akt1 enhances adipogenesis and leads to lipoma formation in zebrafish. PLoS One. 7 (5), 36474 (2012).
- Song, Y., Cone, R. D. Creation of a genetic model of obesity in a teleost. FASEB J. 21 (9), 2042-2049 (2007).
- Watts, S. A., Powell, M., D'Abramo, L. R. Fundamental approaches to the study of zebrafish nutrition. ILAR J. 53 (2), 144-160 (2012).
- Farber, S. A., et al. Genetic analysis of digestive physiology using fluorescent phospholipid reporters. Science. 292 (5520), 1385-1388 (2001).
- Miyares, R. L., de Rezende, V. B., Farber, S. A. Zebrafish yolk lipid processing: a tractable tool for the study of vertebrate lipid transport and metabolism. Dis Model Mech. 7 (7), 915-927 (2014).
- Otis, J. P., et al. Zebrafish as a model for apolipoprotein biology: comprehensive expression analysis and a role for ApoA-IV in regulating food intake. Dis Model Mech. 8 (3), 295-309 (2015).
- Bligh, E., Dyer, W. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-918 (1959).
- Otis, J. P., Farber, S. A. Imaging vertebrate digestive function and lipid metabolism. Drug Discov Today Dis Models. 10 (1), (2013).
- Andre, M., et al. Intestinal fatty acid binding protein gene expression reveals the cephalocaudal patterning during zebrafish gut morphogenesis. Int J Dev Biol. 44 (2), 249-252 (2000).
- Shimada, Y., Hirano, M., Nishimura, Y., Tanaka, T. A high-throughput fluorescence-based assay system for appetite-regulating gene and drug screening. PLoS One. 7 (12), 52549 (2012).
