Introduction
De mekanismer som regulerer tarmen kost lipid behandling, styrer leveren komplekse lipid syntese og lipoproteinmetabolismen, og hvordan disse organene arbeider med sentralnervesystemet for å kontrollere matinntak er ufullstendig forstått. Det er av biomedisinsk interesse å belyse dette biologi i lys av dagens epidemier av fedme, hjerte- og karsykdommer, diabetes og alkoholfrie fatty leversykdom. Studier i cellekultur og mus har gitt mesteparten av vår forståelse av de mekanistiske relasjoner mellom lipider og sykdom, og sebrafisk (Danio rerio) er fremstår som en ideell modell for å utfylle dette arbeidet.
Sebrafisk har lignende gastrointestinal (GI) organer, lipidmetabolismen, og lipoprotein transport til høyere virveldyr 1,2, utvikle seg raskt, og er genetisk medgjørlig. Den optiske klarhet i larvesebrafisk letter in vivo studier, en particular fordel for studier av GI-systemet som sin ekstracellulære miljø (dvs. galle, microbiota, endokrine signalering) er nesten umulig å modellere ex vivo. I samsvar, en mengde forskning kombinere genetiske tractability og conduciveness å leve avbildning av sebrafisk larver med en rekke kosttilskudd manipulasjoner (fettrik 3,4, -kolesterol 5 og -karbohydrat dietter 6,7), og modeller av hjerte-og karsykdommer 8, diabetes 9,10, leversteatose 11-13, og fedme 14-16, dukker opp for å gi en rekke metabolske innsikt.
En viktig del av overgangen larvesebrafisk til metabolsk forskning er optimalisering av teknikker utviklet i modell for andre dyr til sebrafisk og utvikling av nye analyser som utnytter de unike styrkene til sebrafisk. Denne protokollen presenterer teknikker utviklet og optimalisert for å mate larvesebrafisk en Lipid rikt måltid, visualisere kosten lipid behandling fra hele kroppen til subcellulære oppløsning, og måle matinntaket. Kylling eggeplomme ble valgt for å komponere lipidrike måltid som den inneholder høye nivåer av fett og kolesterol (lipider komponere ~ 58% av kylling eggeplomme, hvorav ~ 5% cholesterol, 60% er triglycerider, og 35% er fosfolipider ). Kylling egg gir mer fett enn typiske kommersielle sebrafisk micropellet matvarer (~ 15% lipider) og den fordelen at det er en standardisert feed med kjente prosenter av spesifikke fettsyrer arter, som sebrafisk dietter og fôring regiments ikke har blitt standardisert på tvers av laboratorier 17. Videre fluorescerende lipid analogs anordnet i eggeplommen visualisere transport og akkumulering av lipider 18, bilde cellulære komponenter omfattende lipid-dråper ved å virke både som vitale fargestoffer 3 og gjennom kovalent inkorporering i komplekse lipider, undersøke metabolismen ved tynnsjiktskromatografi (TLC) 19 20.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Disse protokollene har blitt godkjent av Carnegie Institution for Science Institutional Animal Care og bruk Committee (protokoll nr. 139).
1. Animal Forberedelse
- Opprettholde voksne og larver ved 28 ° C på en 14 timer: 10 timer lys: mørke syklus. Mate voksne to ganger daglig med skall gratis Artemia (Decapsulated, ikke-klekking, starter på 14 dpf) og kommersielle micro.
- Disse protokollene er optimalisert for bruken av 6-7 dpf larver oppsamlet ved naturlig gyting av AB bakgrunn. Protokoller kan modifiseres for larver av andre aldre og bakgrunner. Ikke gi eksogene mat før 6 DPF.
- Bedøve larver med Tricaine i embryo media (EM) (4,2 ml av 4 mg / ml Tricaine per 100 ml EM) ved romtemperatur (RT).
2. Utarbeidelse av Lipid rike eggeplomme-feed
- Forbered og lagre kylling eggeplommer. Skill eggeplomme og hvite av 12 kylling egg. Pool eggeplommene, delmengde 1 ml til 1,5ml rør, og oppbevar ved -80 ° C opp til 1 år (12 plommer vil gjøre ~ 80 porsjoner). Pool den hvite, lagre og bruke som en lipid fattig, proteinrik feed.
- Forbered fluorescerende lipid analog (er) som skal tilsettes til eggeplomme mate hvis ønskelig.
- Heng kjøpt, pulverisert fluorescerende lipid analog i 100% etanol eller 100% kloroform på 0,1 ug / ul (se følgende merknad diskutere løsemidler), delmengde i ugjennomsiktig glass rør, forsegle med parafilm, og butikken i henhold til produsentens instruksjoner. På grunn av rask fordampning av organiske løsemidler ikke bruk alikvote volum mindre enn ~ 400 mL for langtidslagring.
Merk: Hvis lipid analoge suspenderes i etanol, vil store mengder lipid analoge brukes fordi det tørker hurtigere under N2 enn kloroform. Dersom den analoge lipid suspenderes i etanol, det trenger ikke å være tørket og resuspendert før tilsetning av den til liposomet innmatingen i trinn 2.2.4, men den totale etanolkonsentrasjonen bør ikke overstige 0.1% i liposomet strømmen for å unngå potensielt samvirkende fysiologiske effekter av etanol. - For fluorescerende fettsyre analoger: Forbered et totalvolum på 20 ml 5% eggeplomme emulsjon i EM. Fra det forberede 5 ml prøver med en endelig konsentrasjon på 6,4 uM 4,4-difluor-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indacene (BODIPY C 16) for levende konfokalt avbildnings og matinntak analyser eller 1 pg / ml BODIPY C 12 for stereo bildebehandling. Overfør den ønskede mengde av det fluorescerende lipid analoge inn i en 1,5 ml plastrør. Tørk lipid under en strøm av N2, tar seg ikke å blåse lipid ut av røret.
- Umiddelbart, resuspender i 5 pl 100% etanol ved å pipettere en strøm ned sidene av røret, tilsett 95 ul EM, og bland godt.
Merk: Blandingen skal vises homogen; hvis farget lipid forblir på sidene av røret eller den flytende vises klumpete, og lipidet ikke fullstendig oppløst og krever mer etanol. Beskytt røret from lys og butikk på is. - For fluorescerende kolesterol analogt: fremstille en endelig konsentrasjon på 2,4 ug / ml kolesterol i 5 ml 0,5-5% eggeplomme emulsjon for levende bildediagnostikk. Overfør den ønskede mengden av kolesterol i en 1,5 ml plastrør. Tørk lipid under en strøm av N2, tar seg ikke å blåse lipid ut av røret.
- Umiddelbart, resuspender i 15 ul RT 100% etanol ved å pipettere en strøm ned sidene av røret og blandes med 85 ul av RT 1% fettsyre-fri BSA i renset H2O Beskytt røret fra lys og lagre på is.
- Heng kjøpt, pulverisert fluorescerende lipid analog i 100% etanol eller 100% kloroform på 0,1 ug / ul (se følgende merknad diskutere løsemidler), delmengde i ugjennomsiktig glass rør, forsegle med parafilm, og butikken i henhold til produsentens instruksjoner. På grunn av rask fordampning av organiske løsemidler ikke bruk alikvote volum mindre enn ~ 400 mL for langtidslagring.
- Forbered eggeplomme Liposome feed.
- Legg til en tint porsjon av eggeplomme til EM i et 50 ml konisk rør. Vortex utvannet eggeplomme blandingen i 1-2 min; blandingen skal se ut som en homogen emulsjon.
- Hell blandingen gjennom en finmasket sil for å fjerne protein konglomerater og samles i en ny, frisk 50 ml konisk tube.
- Pulse Sonicate i eggedosisen med en en fjerdedel tommers konisk mikrotip (5 ganger (5 x 1 sek på, 1 sek av) midlertidig stopping 5-10 sek mellom hvert sett, utgang intensitet: 6 W) ved RT for å lage liposomer. Ultralydstrøminnstillinger er instrumentavhengige og derfor kreve optimalisering for hvert instrument og mikrotip.
Merk: Kontinuerlig gynge liposom-blanding ved RT for å opprettholde homogenitet inntil bruk.
- Tilsett fluorescerende lipid analog til eggeplommen liposomene, om ønskelig. Umiddelbart etter sonikering, pipettér de preparerte lipidene i liposomet blandingen og virvle ved høy hastighet i 30 sek for å innlemme i liposomer. Beskytt blandingen fra lys ved å pakke røret i folie og fortsette gynge ved RT.
3. Fôring Paradigm
- Forbered Larver for fôring.
- Før start av fôr, skjermen larver for åpen morfologiske defekter som kan hindre fôring. Overføring larver til 60 mm x 15 mm petriskåler eller 6- eller 12-brønn plates, redusere EM til et minimum, og erstatte med 5 ml av den tilberedte liposomoppløsningen.
- Hvis det er nødvendig, overføre unfed kontroll larver til 5 ml EM og / eller 5 ml 5% eggehvite i EM og behandle parallelt.
- Rist forsiktig larvene i en inkuberes rocker (29-31 ° C ved 30 rpm) gjennom fôret for å oppmuntre matinntaket mens du fortsetter å skjerme mot lys hvis fluorescerende lipid-analoger er til stede. Hvis larver behov for å bli utsatt for lys, minimere eksponeringen med en farget glass inkubator dekselet.
- På slutten av foringsperioden, skyll frittsvømmende larver i EM 3 ganger.
Merk: Larvene kan begynne å forbruke liposomer på noe tidspunkt i løpet av strømmen. Dersom det er viktig at larvene begynne å mate samtidig, skjerm for matinntak (se 3.4) etter en time av mate- og returnere bare larver som har startet å mate til eggeplommen emulsjonen for å fullføre mate. - Skjermen larvene på dette tidspunkt for inntak av mat som et lite antall kan ikke eat (vanligvis ~ 0-5%). Undersøk tarmen hos larver som har blitt bedøvet eller litt avkjølt på en metallblokk på isen for å finne ut om de har matet: larver som har konsumert liposomer vil ha et mørkt tarmen (figur 1).
- Bilde eller prosess larver for matinntaket umiddelbart. Vekselvis, i stedet larver i frisk EM og inkuber ved 28 ° C tillate metabolsk behandling for å forekomme.
4. Montering Larver for Live Imaging
- Forbered Montering Media.
- For 3% metyl cellulose: legge til 0,75 g methyl cellulose til 25 ml nær koke EM, vortex, rock ved RT 2-3 dager til det er helt oppløst, og oppbevar ved 4 ° C i år ved -20 ° C. Gjentatte sykluser med frysing og tining ved 4 ° C, fjernes luftbobler. Oppbevar 3% metyl cellulose på is mens montering larver.
- For 1,2% lav-mount agarose: legge 0,3 g av lav-smelte agarose til 25 ml EM og oppløse ved å bringe til en byll, delmengde inn i 2 ml tUBE'er, og opprettholde ved 26-28 ° C på en varmeblokk. Ubrukte alikvoter kan oppbevares ved romtemperatur eller 20 ° C og kokes igjen ved tidspunktet for bruk. Vær sikker på at agarose er kjølig nok til å håndtere før du utsetter til larver eller de kan være over-oppvarmet.
- For lav forstørrelse, medium-throughput levende avbildning, plasserer et glass lysbilde på en vev på en metallblokk på is og vente på lysbildet avkjøles. Påfør en generøs mengde på 3% metyl cellulose (som har blitt opprettholdt ved 4 ° C på is) på lysbildet, overføre en larve på 3% metyl cellulose, ved hjelp av en fiske-line poker (0,41 mm diameter fiskesnøre limt til ende av et glass kapillarrør) skape en troth for å drenere overskudds EM (slik som metylcellulose ikke vil bli utvannet) og posisjonere larver som ønsket.
- For kort sikt (<20 min), høy forstørrelse levende avbildning med en oppreist olje emersion objektiv, montere larver med dekk gapahuk metoden.
- Bruk cyanoakrylat basert lim (superlim) tilfeste en en 22 mm x 30 mm dekkglass til den ene enden av en glass-slide. Bruk en poker å sette en tynn linje på 3% metyl cellulose på lysbildet ved siden av dekkglass og overføre larvene til lysbilde med et bredt boring Pasteur pipette. Fjern overflødig EM så det vil ikke fortynne methyl cellulose.
- Ved hjelp av en poker, forsiktig posisjonere larver i metylcellulose på sine sider (venstre side opp til bilde flere av leveren, med riktig side opp til bildet i galleblæren) med hodet ved siden av dekkglass.
- Spot superlim i hjørnene av en andre dekkglass og forsiktig plassere den ene kanten av dekkglass på montert dekkglass, og den andre på lysbildet, bygge bro larvene. Pass på å ikke bruke for høyt trykk i dette trinnet, eller med det formål mens bilde slik at larvene forblir uskadd.
- For langsiktig, høy forstørrelse bildebehandling med en oppreist nedsenking objektiv, montere larver i agarose. Legg en larve til en liten porsjon av 1,2% lavt smeltepunkt agarose deretter overførelarve i et lite volum av agarose til en petriskål.
- Raskt plassere larver med poker før agarose stivner. Tillat agarose tørke i 2-3 min og dekke agarose fullt ut med frisk EM for å hindre at den tørker.
- For langsiktig, høy forstørrelse bildebehandling med en omvendt objektiv, montere larver på en glassbunn rett i agarose.
- Avkjøl en metallblokk på is. Sett fatet på metallblokk atskilt med en vev for å hindre overdreven kjøling og larve frysing. Overfør en larve til parabolen og fjern EM ved wicking med en vev.
- Plasser en dråpe på 28 ° C lavt smelte agarose (1,2%) på toppen av larven og umiddelbart plassere en poker (venstre side ned til beste bilde i leveren, høyre side ned til bilde galleblæren). Fjern tallerken fra den kalde blokken, la det tørke i 2-3 min, og legge et tilstrekkelig volum av fersk EM for å dekke agarose (~ 2-5 ml).
5. matinntakanalyse~~POS=TRUNC
- Ved slutten av en eggeplomme liposom tilførsel inneholdende 6,4 pM BODIPY C 16, basseng et minimum av 10 larver ble vasket i en plast 1,5 eller 2 ml rør, fjerne EM, og snap fryse. Prøvene kan lagres ved -80 ° C beskyttet mot lys i flere måneder.
Merk: Hvis det er mulig, samle flere paralleller. Det er viktig å samle unfed larver på dette trinnet for å normalisere for bakgrunns lipid fluorescens (ideelt sett larver fra den samme kopling er benyttet). - Utfør en modifisert Bligh-Dyer lipidekstrahering 3,21.
- Tilsett 100 ul homogeniseringsbuffer (20 mM Tris-CI, 1 mM EDTA) til prøven på is (alternativt renses H 2 O kan benyttes). Homogen på isen med en mikrotip ultralyd (5 sek totalt: 1 sek på 1 sek av). Sjekk at larvene er helt homogenisert; hvis ikke, gjenta. Overfør til et 13 ml engangs glasskulturrør (andre glassrør kan benyttes).
Merk: Kloroform er farlig; utføre alle påfølgende lipid extrekkraft trinn ved RT i en kjemisk hette. - For hver 100 mL av homogenisering buffer som brukes, legge til 375 mL av 1: 2 (kloroform: metanol). Vortex 30-60 sek, inkuber 10 min, tilsett 125 mL av kloroform per 100 mL homogenisering buffer som brukes, og virvle 30 sek.
- Legg 125 pl av 200 mM Tris pH 7.5 per 100 ul homogeniseringsbuffer anvendes, vortex 30 sek, og sentrifuge (2000 x g, 5 minutter, romtemperatur, beskyttet mot lys). Fjern forsiktig prøvene fra sentrifugen. De vil bli separert i to faser: en øvre fase er vandig, en grenseflate av larve rusk, og et nedre organisk fase (inneholder lipider).
- Med et rent glass pipette samle bunnen, organiske fasen og overføre den til en ren 13 ml glassrør.
Merk: Pass på å unngå vannfasen og larve rusk i grensesnittet; hvis forurensning oppstår, gjenta sentrifugeringstrinn og minnes. Kast den øvre, vandige fase; kan det være nyttig å ta bort dennefase før samle den organiske fasen. Prøven kan oppbevares ved -80 ° C i opptil en måned. - Tørk den organiske fase under vakuum (0,12 atm) og samtidig beskytte mot lys. Ikke fortsett å tørke prøvene etter at væsken har fordampet som det vil redusere lipid løselighet. Suspender lipider i 2: 1 (kloroform: metanol) og lagre på is. Den optimale volum av kloroform: metanol løsning er avhengig av deteksjonsmetode som brukes; starter lavt og fortsetter å fortynne etter behov. En generell retningslinje er å bruke 10 mL for 10 sammenslått larver.
- Tilsett 100 ul homogeniseringsbuffer (20 mM Tris-CI, 1 mM EDTA) til prøven på is (alternativt renses H 2 O kan benyttes). Homogen på isen med en mikrotip ultralyd (5 sek totalt: 1 sek på 1 sek av). Sjekk at larvene er helt homogenisert; hvis ikke, gjenta. Overfør til et 13 ml engangs glasskulturrør (andre glassrør kan benyttes).
- Spot hele prøvevolumer i jevnt fordelt intervaller på en kanalisert TLC plate og skanne plate med en laserskanner som rutinemessig brukes for biomolekylære bildebehandling (f.eks en fluorescerende plateleser). For de fluorescerende lipid analoger inkludert i listen materialer som har en eksitasjon maxima 500-650 nm og emisjon maxima 510-665 nm, bruker en 488 nm laser og med utslipp samling på 520 nm.
- Kvantifisere den totale fluorescens av hver flekk med bildebehandlingsprogrammer.
Merk: Riktig for naturlig forekommende bakgrunn lipid fluorescens ved å trekke fluorescens over sammenkoblede, sultne larver prøver.
- Kvantifisere den totale fluorescens av hver flekk med bildebehandlingsprogrammer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Når fôres på en rocker ved 29-31 ° C, vil flertallet av sunne larver (≥95%) spise innen en time. Ved inntak av eggeplommen emulsjon, mørkner larvetarmen i fargen. Svært mørke tarmen kan observeres ved 2 timer (figur 1). Dersom larvene er unfed eller unnlater å mate, forblir tarmen klart. Larver matet eggehvite utstillings et utvidet intestinal lumen som ikke mørkere i fargen.
Figur 1:. Screening Larver for matinntak Wild type 6-dpf larver ble matet 5% eggeplomme i EM for to timer eller behandlet parallelt i EM å skaffe unfed kontroller. Unfed larver har klare tarmen mens matet larver som har konsumert eggeplomme har mørke tarmen når avbildes på 10X på et stereoskop. Skala barer representerer 0,1 mm.Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fôring med fluorescerende lipid analoger tillater visualisering av systemisk transport og subcellulære akkumulering av lipider. Det fluorescente signalet er til stede gjennom hele fordøyelsesorganer (tarm, lever og pankreas) av larver tilført 5% eggeplomme med 6,4 pM fluorescerende C 16 analog i 8 timer montert med dekkglass lean-to-metoden og avbildes med en opprettstående objektiv (figur 2) 3.
Figur 2:. Fluorescent Lipid analoger Visualiser Kost Lipid Transport Representant sammensatt bilde av en 6-DPF larve (hodet mot høyre) matet 5% eggeplomme i EM med 6,4 mikrometer BODIPY FL C 16 i 8 timer. Larvene ble montert i 3% metylcellulose ved dekkglass lean-to-metoden og avbildes med en opprettstående 63X oljeneddyppingsobjektivet på et enkelt foton konfokalmikroskop med en argon laser. Skala barer representerer 20 mikrometer. Lever, L; tarmen, jeg; bukspyttkjertelen, P, galleblæren, GB; gjengitt med tillatelse fra Dev Bio tre. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Ulike lipid analoger tillater visualisering av unike sett av cellulære strukturer, siden de er forskjellig metaboliseres til komplekse lipider (dvs. triglyserider, kolesterol estere, fosfolipider). Etter 4-8 timers feeds, fluorescerende C 16 og C 12 analoger merke lipid dråper, fluorescerende FL C 5 etiketter lipid dråper, lever og bukspyttkjertel kanaler, cellemembraner og arterielle nettverk og fluorescerende C 2 analoge etiketter og pankreaslymfeknutene kanaler og mobil membraner (figur 3) 3.
ove_content "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figur 3:. Ulike Fluorescent Lipid analoger Etikett Unike Cellular Organs Representative sammensatte bilder av larver matet 5% eggeplomme i EM med 6,4 mikrometer BODIPY FL C 16, C 12, C 5 eller C 2 for 4-8 timer (6 dpf) . C 16 analog er observert i lipiddråper (LD) på enterocyttene, C-12 og C-5-analoger i enterocyte LD og den intestinale lumen, og C to analoge i tarmlumen. Larvene ble montert i 3% methyl cellulose av dekkglass lene-til metode og avbildes med en oppreist 63X oljeneddyppingsobjektivet på et enkelt foton konfokalmikroskop med en argon laser. Skala barer representerer 20 mikrometer. Gjengitt med tillatelse fra Legemiddel Discov dag Dis Modeller 22._blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Larve matinntak assay ble utviklet for å undersøke hvordan genetiske mutasjoner, transgen overekspresjon-genet, og / eller eksogene behandling påvirker larvenes matinntak. Larvene blir matet en lipid rikt måltid tilsatt et fluorescerende lipid analog å indikere mengden mat konsumert. Unfed larver er samlet i parallell for å normalisere for mengden av bakgrunnsfluorescens til stede i larver, å øke følsomheten ved hvilken det fluorescerende lipid analoge kan påvises. Denne analysen ble brukt til å vise at overekspresjon av Apolipoprotein A-IVb.1 (ApoA-IVb.1) reduserer matinntak. Tidligere unfed Tg (hsp70: ApoA-IVb.1: mCherry) larver fôres 10% eggeplomme med 6,4 mikrometer fluorescerende C 16 analog for 4 timer ved 7 dpf forbrukes ca 30% færre lipider enn villtype larvene (figur 4) 20.
Figur 4:. Representant matinntak analysen Wild type (WT) og Tg (hsp70: ApoA-IVb.1: mCherry) (Tg) larver ble foret 10% kylling eggeplomme med 6,4 mikrometer BODIPY FL C16 i 4 timer (Fed) eller behandles parallelt i EM (unfed). (A) Larvene ble slått sammen (n = 10), ble lipider ekstrahert, og ekstrakter ble oppdaget på en TLC-plate. (B) Totalt fluorescens ble kvantifisert, uttrykt i vilkår fluorescerende enheter (AFU), normalisert for bakgrunnsfluorescens i unfed søsken ved subtraksjon, og uttrykt i forhold til WT. Tg larver overekspresjon ApoA-IVb.1 innta færre fluorescensmerkede lipid-analoger, som vist ved sammenligning med WT (paret t-test, p <0,001, n = 9, 20 larver per forsøk). Boksen representerer 25-75 th persentiler, og median er indikert. Værhårene viser 10-90 th persentiler. Gjengittmed tillatelse fra Dis Modell Mech 20. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Teknikkene som beskrives her tillate forskere å behandle larvesebrafisk med en lipid-rik feed, visualisere kosten lipid behandling i levende larver, og kvantifisere larve matinntak. For å sikre suksess, bør spesiell oppmerksomhet gis til flere kritiske trinn. Kommersielle kylling egg variere; for å minimere potensielle variasjonen vi utføre alle analyser på økologiske egg fra bur-free kyllinger som ikke har blitt beriket for omega-3 fettsyrer. Lavere fôring prisene kan observeres i fisk yngre enn 6 dpf med gjenværende endogene eggeplomme energiforsyning, usunn fisk eller fisk med utviklings mutasjoner som hindrer matinntak (dvs. kjeve eller tarm misdannelse, manglende evne til å svømme ordentlig). Den Farber laboratorium vanligvis utfører fôring studier ved 6-7 dager etter befruktning (DPF) fordi larvene ikke krever eksogene mat til sine endogene plomme butikker er oppbrukt og eggeplomme uttømming gir bedre visualisering av fordøyelsessystemet. fôringved RT også i stor grad reduserer antallet larver som spiser. Unnlatelse av å skjerm larver for matinntak og utilsiktet inkludering av unfed larver i senere eksperimenter kan skamme resultater. I tillegg er det viktig å beskytte de fluorescerende lipid analogene, og alle larver prøvene som ble matet med analogene, mot lys når det er mulig å opprettholde maksimal fluorescens, og således analysesensitiviteten. Til slutt, hvis matinntaket vil bli målt, ikke la fôret og jage (post-fôr metabolisme periode) å overskride totalt 4 timer, siden måltidet vil begynne å bli utskilt. Foreløpig er den hastigheten som måltidet og tilhørende fluorescerende lipid analoger utskilles ukjent, men fluorescens kan vedvare gjennom hele larvekroppen i minst 2 dager etter fôr (JPO og SAF upubliserte data).
Det er flere måter å endre og feilsøke protokollene å svare på eksperimentelle spørsmål av interesse. Den lipidrike mate kan utføres i forskjellige perioder av tIME: 1 time vil gi et lite måltid, mens 4 timer vil fylle tarmen med en stor mengde lipid. Men mate larvene lenger enn 6 timer er ikke anbefalt som eggeplomme og EM er ikke forberedt i sterile forhold og bakteriell overvekst i eggeplommen / hvit emulsjon kan forvirre resultater (dvs. økt betennelse, endret tarmfloraen profil). Larver kan undersøkes umiddelbart etter foring for å undersøke akutte virkninger av tilførsels larver immobilisert ved kort avkjøling eller anestesi hurtig begynne å mates igjen etter gjenoppvarming, men kjøling er det foretrukket fremgangsmåte for immobilisering som larver kan oppvise emese etter anestesi (SAF upublisert observasjon). Alternativt kan jage perioder utføres etter tilførselen for å tillate transport og metabolisme av lipider før studere. Selv feeds er vanligvis utført i 5 ml liposomoppløsningen har feeds blitt gjennomført i volumene fra 1 til 20 ml. Various konsentrasjons eggeplomme kan anvendes for larve strømmer; den Farber laboratoriet utfører rutinemessig eksperimentering med 5% eggeplomme (1 ml eggeplomme tilsettes til 19 ml EM), 0,5% eggeplomme, og 10% eggeplomme.
Det er potensielle begrensninger av fluorescerende lipid analoger som må vurderes. Ved valg av en fluoriserende analog lipid er det viktig å vurdere hvor lipidet er fysiologisk behandlet og hvor det fluorescerende delen er på den kjemiske strukturen til lipid ved tolkning av resultater. For eksempel er triglyserider brytes ned til frie fettsyrer og glycerol, og kolesterolestere til frie kolesterol og fettsyrer, i tarmlumen før absorpsjon. Derfor, hvis en fluorescerende triglycerid eller kolesterolester analoge er gitt i kosten fluorescens observert i kroppen vil spore fettsyre, fritt kolesterol, eller glycerol som den fluorescerende gruppe er festet til, ikke det opprinnelige triglycerid eller kolesterolester. Ulike fluorescent lipid analoger merke unike cellulære strukturer, og dette faktum bør vurderes ved valg 3. Også verdt å merke, sammenlignet med metabolismen av innfødte fettsyrer, tillegg av en BODIPY enhet tilsvarer omtrent legger ~ 2-3 karbonatomer til fettsyrekjedelengde (SAF upubliserte data).
Teknikkene som er beskrevet her representerer betydelige fremskritt i forhold til tidligere assays som er beskrevet i felten. Før utviklingen av denne kylling eggeplomme fôr, to manuskripter detaljerte studier der larver ble matet drevet hardkokt eggeplomme 4,23. Teknikken som er beskrevet her gir fordelen at eggeplommen ikke behøver å være vanskelig kokte og pulverisert før bruk, og at pulverisert eggeplomme har en meget kort halveringstid på grunn av sin raske oksydasjon. Flytende eggeplomme kan også fremstilles som liposomer som lett aksepterer fluorescerende lipid analogs for effektiv levering kosten. Alternativt kan radiomerkede lipider brukes til å investigate kosttilskudd lipidmetabolisme og måle matinntaket, men fluorescerende lipid analoger ikke presentere sikkerhetsrisikoer forbundet med radioaktivitet. Men hvis forskere ønske å benytte radioaktivt merkede lipider, har Farber laboratoriet utført studier for å verifisere at radioaktivt merkede lipider kan bli innlemmet i, og hell matet med, liposomer 19. De fluorescerende lipid analoger beskrevet her ble valgt fordi de viser svært lik stoffskiftet å endogene og radiomerket lipider, og var tilstrekkelig lys for lav- og høy effekt bildebehandling.
Forut for utviklingen av denne teknikk for å mate fluorescerende lipid analogs til larver, ingen andre metoder var tilgjengelig for å visualisere kost lipid transport og akkumulering in vivo. Direkte visualisering av fluorescerende lipid-analoger kan gi en fordel i forhold til ved bruk av indirekte mål på fysiologi, som serumlipider. Nøyaktig måling av larvenes sebrafisk matinntak var også en lang-standing utfordring i feltet. Det eneste alternativet var å kultur paramecia, merke dem med fluorescerende lipofile tracer 4- (4- (didecylamino) styryl) - N -methylpyridinium jodid (4-Di-10-ASP), la larvene å mate, og måle fluorescens intra-abdominal området med en plateleser 24. Til slutt, disse teknikkene har fordelen av å være gjeldende for både medium-throughput skjermer (dvs. termin genetiske skjermer kost lipid behandling) samt fokusert høy forstørrelse imaging studier (dvs. omvendt genetiske, hypotesen drevet studier). I fremtiden kan disse teknikkene brukes til fenotype og screene ulike modeller av metabolske og GI sykdom hos sebrafisk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulofnate salt) | Sigma-Aldrich | A5040-25G | Anesthesia for larval zebrafish |
| Chicken eggs | N/A | N/A | Organic, cage-free eggs, not enriched for omege-3 fatty acids |
| Ultrasonic processor 3000 sonicator | Misonix, Inc. | S-3000 | To make egg yolk liposomes |
| Sonabox acoustic enclosure | Misonix, Inc. | 432B | To make egg yolk liposomes |
| 1/8” tapered microtip | Misonix, Inc. | 419 | To make egg yolk liposomes |
| Amber vials (4 ml, glass) | National Scientific | 13-425 | Lipid storage; includes vials, open-top caps, and cap septa |
| Incu-Shaker Mini | Benchmark | 1222U12 | Incubated shaker for feeds |
| BODIPY FL C16 | Thermo Fisher Scientific | D3821 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Hexadecanoic Acid) |
| BODIPY FL C12 | Thermo Fisher Scientific | D3822 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Dodecanoic Acid) |
| BODIPY FL C5 | Thermo Fisher Scientific | D3834 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Pentanoic Acid) |
| BODIPY FL C5 | Thermo Fisher Scientific | D2183 | Fluorescent lipid analog; (4,4-Difluoro-5,7-Dimethyl-4-Bora-3a,4a-Diaza-s-Indacene-3-Propionic Acid) |
| TopFluor cholesterol | Avanti Polar Lipids Inc. | 810255 | Fluorescent lipid analog; 23-(dipyrrometheneboron difluoride)-24-norcholesterol |
| Fatty acid-free BSA | Sigma-Aldrich | A0281-1G | For TopFluor cholesterol solubilization |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M0387 | Mounting media for live larval imaging; 75 x 25 x 1 mm |
| Low melt agarose | Thermo Fisher Scientific | BP165-25 | Mounting media for live larval imaging; 22 x 30 |
| VWR microscope slides | VWR | 16004-422 | Mounting larvae for live imaging |
| Coverslips | Cover Glass | 12-544A | Mounting larvae for live imaging |
| Super glue | Loctite | LOC01-30379 | Mounting larvae for live imaging |
| FluoroDish (glass bottom dish) | World Precision Instruments, Inc. | FD35-100 | Mounting larvae for live imaging; 35 mm dish, 23 mm glass, 0.17 mm glass thickness |
| Confocal microscope | Leica Microsytems | SP-2, SP-5 | Microscope for high magnification live imaging |
| Stereoscope | Nikon | SM21500 | Microscope for low magnification live imaging |
| Glass culture tubes | Kimble | 73500-13100 | Lipid extraction; (13 x 100 mm; 13 ml) |
| Savant SpeedVac Plus | ThermoQuest | SC210A | Lipid extraction |
| Channeled TLC plates | Whatman Scientific | WC4855-821 | Food intake assay; LK5D Silica Gel 150 A, 20 x 20 cm, 250 um thick; Discontinued |
| Channeled TLC plates | Analtech, Inc. | 66911 | Food intake assay; Direct replacement for Whatman Scientific TLC plates |
| Typhoon 9410 Variable Mode Imager | GE Healthcare | 9410 | Fluorescent plate reader for food intake assay |
| ImageQuant software | GE Healthcare | 29000605 | Analysis of food intake assay |
| 5 3/4’ Wide bore, borosilicate disposable pasteur pipets | Kimble | 63A53WT | Transfering larvae |
References
- Carten, J. D., Farber, S. A. A new model system swims into focus: using the zebrafish to visualize intestinal metabolism in vivo. Clin Lipidol. 4 (4), 501 (2009).
- Babin, P. J., Vernier, J. M.
- Carten, J. D., Bradford, M. K., Farber, S. A. Visualizing digestive organ morphology and function using differential fatty acid metabolism in live zebrafish. Dev Biol. 360 (2), 276-285 (2011).
- Marza, E., et al. Developmental expression and nutritional regulation of a zebrafish gene homologous to mammalian microsomal triglyceride transfer protein large subunit. Dev Dyn. 232 (2), 506-518 (2005).
- Stoletov, K., et al. Vascular lipid accumulation, lipoprotein oxidation, and macrophage lipid uptake in hypercholesterolemic zebrafish. Circ Res. 104 (8), 952-960 (2009).
- Fang, L., et al. Programming effects of high-carbohydrate feeding of larvae on adult glucose metabolism in zebrafish, Danio rerio. Br J Nutr. 111 (5), 808-818 (2014).
- Wang, Z., Mao, Y., Cui, T., Tang, D., Wang, X. L. Impact of a combined high cholesterol diet and high glucose environment on vasculature. PLoS One. 8 (12), 81485 (2013).
- Fang, L., et al. In vivo visualization and attenuation of oxidized lipid accumulation in hypercholesterolemic zebrafish. J Clin Invest. 121 (12), 4861-4869 (2011).
- Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: a new tool for regeneration studies. Dev Dyn. 236 (4), 1025-1035 (2007).
- Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase. Mech Dev. 124 (3), 218-229 (2007).
- Passeri, M. J., Cinaroglu, A., Gao, C., Sadler, K. C. Hepatic steatosis in response to acute alcohol exposure in zebrafish requires sterol regulatory element binding protein activation. Hepatology. 49 (2), 443-452 (2009).
- Sadler, K. C., Amsterdam, A., Soroka, C., Boyer, J., Hopkins, N. A genetic screen in zebrafish identifies the mutants vps18, nf2 and foie gras as models of liver disease. Development. 132 (15), 3561-3572 (2005).
- Matthews, R. P., et al. TNFalpha-dependent hepatic steatosis and liver degeneration caused by mutation of zebrafish S-adenosylhomocysteine hydrolase. Development. 136 (5), 865-875 (2009).
- Oka, T., et al. Diet-induced obesity in zebrafish shares common pathophysiological pathways with mammalian obesity. BMC Physiol. 10, 21 (2010).
- Chu, C. Y., et al. Overexpression of Akt1 enhances adipogenesis and leads to lipoma formation in zebrafish. PLoS One. 7 (5), 36474 (2012).
- Song, Y., Cone, R. D. Creation of a genetic model of obesity in a teleost. FASEB J. 21 (9), 2042-2049 (2007).
- Watts, S. A., Powell, M., D'Abramo, L. R. Fundamental approaches to the study of zebrafish nutrition. ILAR J. 53 (2), 144-160 (2012).
- Farber, S. A., et al. Genetic analysis of digestive physiology using fluorescent phospholipid reporters. Science. 292 (5520), 1385-1388 (2001).
- Miyares, R. L., de Rezende, V. B., Farber, S. A. Zebrafish yolk lipid processing: a tractable tool for the study of vertebrate lipid transport and metabolism. Dis Model Mech. 7 (7), 915-927 (2014).
- Otis, J. P., et al. Zebrafish as a model for apolipoprotein biology: comprehensive expression analysis and a role for ApoA-IV in regulating food intake. Dis Model Mech. 8 (3), 295-309 (2015).
- Bligh, E., Dyer, W. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-918 (1959).
- Otis, J. P., Farber, S. A. Imaging vertebrate digestive function and lipid metabolism. Drug Discov Today Dis Models. 10 (1), (2013).
- Andre, M., et al. Intestinal fatty acid binding protein gene expression reveals the cephalocaudal patterning during zebrafish gut morphogenesis. Int J Dev Biol. 44 (2), 249-252 (2000).
- Shimada, Y., Hirano, M., Nishimura, Y., Tanaka, T. A high-throughput fluorescence-based assay system for appetite-regulating gene and drug screening. PLoS One. 7 (12), 52549 (2012).
